分子伴侶hfq基因缺失對單核細胞增生李斯特菌毒力及生物被膜生成的影響

盧海亭，喬 軍，孟慶玲，彭葉龍，陳 誠，劉田莉，才學鵬，陳創夫

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832003；2.阿克蘇地區動物疫病控制診斷中心，新疆 阿克蘇 843000；3.中國農業科學院 蘭州獸醫研究所，甘肅 蘭州 730046)

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)屬于李斯特菌屬革蘭氏陽性無芽胞胞內寄生菌，屬人獸共患的重要病原菌，人及動物感染后主要表現為敗血癥、腦膜腦炎、流產和單核細胞增多等癥狀，引起較高的死亡率，是世界衛生組織(World Health Organization，WHO)規定的四大食源性致病菌之一[1-2]。

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)能夠通過轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平調節細菌環境應激及毒力相關基因表達以調節細菌眾多的生理代謝及致病過程。目前，研究表明革蘭氏陰性菌中大部分ncRNA發揮作用依賴于Hfq蛋白，該蛋白通過分子伴侶的方式參與大部分ncRNA對毒力基因及環境應激相關基因的表達調控過程。革蘭氏陽性菌中大部分ncRNA發揮作用時并不需要Hfq蛋白的參與，甚至在一些革蘭氏陽性菌中并不存在Hfq蛋白的同系物，這就表明在不同細菌中Hfq蛋白發揮作用的方式并不相同[3-6]。在LM中目前只鑒定到LhrA、LhrB、LhrC 3種可以與Hfq蛋白結合的ncRNA[7-8]，而其余眾多的ncRNA與Hfq蛋白的相互作用關系及Hfq蛋白在LM中發揮的具體作用及作用機制還有待于進一步研究。因此，本試驗通過對LMhfq基因缺失株毒力、溶血活性、生物被膜生成能力的檢測，以期進一步了解hfq基因在LM毒力及生物被膜生成中的作用。

1 材料和方法

1.1 菌株與試驗動物

單核細胞增生李斯特菌野毒株LM-SB5由石河子大學動物科技學院動物疾病防控兵團重點實驗室從發病綿羊體內分離鑒定后保存；單核細胞增生李斯特菌hfq基因缺失株LM-Δhfq由本實驗室構建保存；8周齡的昆明系小鼠由石河子大學實驗動物中心提供；綿羊全血采自石河子大學試驗站。

1.2 小鼠半數致死量LD50檢測

將LM-SB5及LM-Δhfq分別接種于BHI液體培養基中，置于37 ℃恒溫條件下培養，當OD600至0.6時，12 000 r/min離心2 min收集菌體，棄去上清后用PBS緩沖液將菌體清洗2遍，10倍梯度稀釋。將100只8周齡昆明系小鼠隨機平均分成2組，每組分為5個梯度，分別給每只小鼠腹腔注射0.5 mL不同稀釋梯度的菌液，觀察小鼠精神狀態及臨床癥狀，連續觀察7 d后統計各組小鼠死亡率，利用寇氏法計算LM-SB5及LM-Δhfq對小鼠的半數致死量LD50。

1.3 肝臟、脾臟載菌量及病理變化檢測

將8周齡昆明系小鼠隨機分成3組，通過腹腔注射亞致死劑量的LM-SB5及LM-Δhfq菌液各0.5 mL，同時設置對照組，對照組腹腔注射0.5 mL PBS緩沖液，以注射菌液當天開始，計為t=0 d，每組分別在t=1～5 d各取1只小鼠摘取其肝、脾，加入1.0 mL PBS充分研磨，10倍梯度稀釋后吸取不同稀釋梯度的組織研磨液涂布于BHI平板固體培養基上，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h計數，每個稀釋梯度設置3個重復，最后以平均值作為肝、脾載菌量。在t=5 d時分別摘取3組小鼠的肝、脾、腎，經4%甲醛溶液固定制備切片，HE染色后觀察其組織病理學變化。

1.4 溶血試驗

將LM-SB5及LM-Δhfq分別接于BHI液體培養基中于37 ℃條件下培養過夜，取1 mL菌液12 000 r/min離心5 min，取上清，用PBS緩沖液調整OD600至相同大小，取70 μL上清液用pH值6.0的PBS緩沖液倍比稀釋至2-8，加入30 μL 1% 紅細胞，觀察LM-SB5及LM-Δhfq溶解紅細胞情況，測定溶血效價。

1.5 hfq基因缺失對LM生物被膜生成能力的影響

將LM-SB5及LM-Δhfq菌液以1∶100的比例分別接于BHI液體培養基中培養，使其OD600值達到0.2，吸取菌液200 μL加入到96孔微孔板中，每個樣品分2組，每組設置8個平行重復，將微孔板周圍封閉，靜置于37 ℃條件下分別培養24，48 h；棄去孔中的培養基，加入200 μL無菌蒸餾水洗滌3次，除去尚未形成生物被膜的浮游菌體，室溫干燥45 min，然后向每個孔中加入150 μL 1%的結晶紫溶液在室溫條件下染色30 min，棄去染色液，再用200 μL無菌蒸餾水洗滌微孔板4次，室溫條件下干燥30 min；再加入150 μL濃度為95%乙醇脫色30 min，用酶標儀測定其OD570；將脫色后的微孔板直接放在倒置顯微鏡下觀察生物被膜的形態，選取最佳視野拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 LM-SB5及LM-Δhfq的LD50檢測結果

分別給小鼠腹腔注射LM-SB5和LM-Δhfq菌液后進行觀察及LD50測定，在24 h后部分小鼠開始死亡，病理剖檢發現在2組小鼠中肝、脾明顯腫大，腸道黏膜脫落，部分腸道充血和出血，未死亡的小鼠出現結膜炎、消瘦、被毛雜亂等癥狀。觀察7 d后統計死亡率，根據寇氏法計算得到LM-SB5和LM-Δhfq對小鼠的LD50分別為105.560，106.343cfu(表1)，LM-Δhfq的LD50升高了6.067倍，說明了hfq基因缺失引起LM毒力顯著下降(P<0.05)，表明hfq基因對LM的毒力具有重要調控作用。

表1 LM-SB5與LM-Δhfq的LD50測定結果Tab.1 LD50 measurement results of LM-SB5 and LM-Δhfq

注：半數致死量LD50數值后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values of 50% lethal dose with different small letters means the differences is significant.

2.2 小鼠肝臟、脾臟載菌量檢測結果

對2組小鼠肝、脾的細菌進行平板計數分析，結果發現在第1天肝、脾載菌量差異不顯著(P>0.05)；在第2～5天，注射LM-SB5的小鼠肝、脾載菌量要顯著高于注射LM-Δhfq的小鼠肝、脾載菌量(P<0.05)，第3天差異極顯著(P<0.01)(圖1)；表明LM-Δhfq在宿主體內生存增殖能力弱于LM-SB5，即hfq基因能夠在一定程度上影響LM在宿主體內的生存增殖。

2.3 小鼠肝、脾、腎病理變化

與正常的小鼠肝、脾、腎(圖2-A～C)形態相比，LM-SB5及LM-Δhfq均可引起小鼠肝、脾、腎產生一定的病理變化，LM-SB5感染的肝臟切片有明顯的壞死灶，內有藍染壞死的肝細胞、巨噬細胞以及淋巴細胞，有的只留下細胞輪廓，肝細胞溶解壞死，組織結構消失，含有大量的組織碎片，出現網狀絲狀結構(圖2-D)；脾臟中脾小結體積增大，細胞間結構松散,有明顯的壞死灶，淋巴小結部位淋巴細胞壞死，淋巴組織出血(圖2-E)；腎臟中腎小球腫脹，腎小球內細胞增多充血、出血，腎小管上皮細胞發生顆粒變性、壞死，部分腎小管間質有大量的紅細胞(圖2-F)。LM-Δhfq感染的肝臟切片有的區域輕微肝淤血，肝索排列疏松，同樣有炎性細胞及壞死的肝臟細胞(圖2-G)；脾臟中有明顯的壞死灶，淋巴小結部位淋巴細胞壞死，淋巴組織出血(圖2-H)；腎臟有明顯的顆粒樣變性，腎小球充血、出血(圖2-I)。表明hfq基因缺失后LM對小鼠組織器官的損傷能力也有所減弱。

A.肝臟細菌計數結果；B.脾臟細菌計數結果；*.差異顯著；**.差異極顯著。圖4同。A.Bacterial count in the livers；B.Bacterial count in the spleens；*.The differences is significant；**.The differnces is extremely significant.The same as Tab.4.

A～C.正常肝、脾、腎；D～F.腹腔注射LM-SB5肝、脾、腎病理變化；G～I.腹腔注射LM-Δhfq肝、脾、腎病理變化。A-C.The histopathological slices of the normal liver，spleen，and kidney；D-F.Histopathological changes in the liver， the spleen， and the kidney of mice injected with LM-SB5；G-I.Histopathological changes in the liver，the spleen，and the kidney of mice injected with LM-Δhfq.

2.4 溶血活性檢測結果

通過溶血試驗檢測LM-SB5及LM-Δhfq溶血活性，結果發現LM-SB5的溶血效價為2-3，LM-Δhfq的溶血效價為2-2，其溶血能力下降了2倍。表明hfq基因對LM溶血能力具有一定的調節能力(圖3)。

圖3 LM-SB5 與 LM-Δhfq溶血活性測定Fig.3 Hemolysis activity assay of LM-SB5 and LM-Δhfq

2.5 hfq基因缺失對生物被膜生成能力的影響

在24 h時，LM-SB5和LM-Δhfq生物被膜生成能力差異顯著(P<0.05)，LM-Δhfq生物被膜生成能力顯著低于LM-SB5(圖4)；而在48 h時二者的生物被膜生成能力差異不顯著(P>0.05)。倒置顯微鏡觀察在24，48 h時LM-SB5與LM-Δhfq都生成了典型的生物被膜形態，在24 h LM-Δhfq生物被膜厚度明顯低于LM-SB5(圖5)。

圖4 生物被膜OD570檢測結果Fig.4 Biofilm determined by OD570

A與B.LM-SB5分別在24，48 h形成的生物被膜；C與D.LM-Δhfq分別在24，48 h形成的生物被膜。A and B.Formation of biofilm by LM-SB5 at 24，48 h；C and D.Formation of biofilm by LM-Δhfq at 24，48 h.

3 討論

LM作為WHO規定的四大食源性致病菌之一，通過污染飲水、食品、飼草料而引起人與動物食物中毒，對人類健康構成了極大威脅，也給畜牧業發展帶來較大的經濟損失，嚴重威脅公共衛生安全。此外，LM還能夠產生生物被膜，生物被膜是細菌通過分泌胞外基質粘附于生物或非生物表面形成具有一定立體結構的微生物聚集群體，形成生物被膜的菌體在胞外基質的保護下能夠阻止減緩抗菌藥物及殺菌物質的滲透，從而使細菌有足夠的時間調控相關基因的表達，以調節其對脅迫環境的應激能力及動物機體致病力。由于產生生物被膜的細菌對抗菌藥物更不敏感，在臨床上通常會導致一些疾病呈現持續性感染發作[9]。

隨著生物信息學發展以及對微生物基因組整體水平研究不斷深入，LM成為研究革蘭氏陽性菌Hfq蛋白以及ncRNA的模式細菌。Hfq是一種熱穩定蛋白調控因子，其分子量大小和功能在不同細菌中有所不同[10-12]。對革蘭氏陰性菌Hfq蛋白結構和功能的研究比較深入，并已證實該蛋白是一種重要的環境應激和毒力調控因子，然而對革蘭氏陽性菌Hfq蛋白研究相對較少，其主要作為ncRNA的分子伴侶發揮作用。ncRNA按照作用機制可以分為反義RNA(anti-sense RNA，asRNA)，順式作用RNA(Cis-acting RNA)和反式編碼小RNA(Trans-encoded small RNA，sRNA)，在革蘭氏陰性菌中Hfq蛋白作為大部分sRNA的分子伴侶發揮作用，能夠通過影響sRNA與目的mRNA的結合，進而影響基因的表達。而在革蘭氏陽性菌中只有少量sRNA與Hfq蛋白發生互作，在LM中已經發現的200多種sRNA，通過免疫共沉淀鑒定只得到3種sRNA可以與Hfq蛋白發生互作。眾多的研究表明，Hfq蛋白在不同細菌中具有不同的作用，在同種細菌中參與不同sRNA調控細菌基因表達過程中的作用方式也有所區別[13-16]。

Christiansen等[17]研究表明，Hfq蛋白參與了LM對高滲及乙醇環境壓力的應激過程和對小鼠的致病性。本研究通過動物感染試驗證實hfq基因缺失引起LM對小鼠的毒力、肝脾中的生存增殖能力、溶血能力顯著減弱，表明hfq基因缺失能夠導致LM毒力相關生物學特性的降低。同時通過結晶紫染色的方法制備了生物被膜，結果顯示在24 h時生物被膜的生成量顯著降低，而在48 h時生物被膜的生成量沒有顯著差異。Huang等[18]通過插入失活的方式發現gltB、gltC基因的缺失是引起LM生成量顯著降低的主要原因。Peng 等[19]進一步研究發現在缺失sRNArli60基因時，LM的生物被膜生成量顯著降低，且rli60基因缺失引起生物被膜生成相關基因gltB、gltC的表達量顯著下降。Zhou等[20]研究發現PrfA基因缺失引起LM生物被膜生成能力顯著降低。表明生物被膜的生成能力受到自身眾多基因的調控作用。目前的研究發現與生物被膜生成相關的因素眾多：外在因素包括附著面的理化性質、溫度、培養基pH、金屬離子等，內在因素主要包括眾多基因表達的開啟及關閉[9，20]。通過缺失hfq基因LM生物被膜的生成量顯著降低，表明LM生物被膜的生成在一定程度上直接或間接受到hfq基因表達的影響。但是生成生物被膜的細菌只是具有了對外界脅迫環境更強的適應能力而存活下來，進而具備了感染宿主的先決條件。而處于生物被膜狀態下的細菌突破機體免疫系統的能力及致病能力是否得到相同程度的提高，即本研究中hfq基因缺失引起LM毒力及生物被膜生成能力的同時降低，這二者之間是否具有對應的因果關系還有待于進一步研究。總之，本研究表明hfq基因缺失對LM的毒力及生物被膜生成具有一定的調節作用，為進一步開展針對Hfq蛋白調控機理的研究奠定了理論基礎。