冠心病患者Hcy和SAH與外周血淋巴細胞基因組甲基化相關性研究〔1〕

李莉，高勝利，2*，翟曉娟，郭任維，李樹峰

(1.山西醫(yī)科大學附屬汾陽醫(yī)院，山西 汾陽 032200；2.山西醫(yī)科大學汾陽學院，山西 汾陽 032200；3.中國醫(yī)學 科學院醫(yī)學信息研究所，北京 100020)

冠心病患者Hcy和SAH與外周血淋巴細胞基因組甲基化相關性研究〔1〕

李莉1，高勝利1，2*，翟曉娟1，郭任維1，李樹峰3

(1.山西醫(yī)科大學附屬汾陽醫(yī)院，山西 汾陽 032200；2.山西醫(yī)科大學汾陽學院，山西 汾陽 032200；3.中國醫(yī)學 科學院醫(yī)學信息研究所，北京 100020)

目的：探討冠心病患者血漿同型半胱氨酸(Hcy)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)與外周血淋巴細胞基因組甲基化水平的相關性。方法：選取山西省汾陽醫(yī)院心血管內(nèi)科冠心病患者70 例(觀察組)，另選取70 例健康人群為對照組，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿Hcy、SAH和DNA甲基轉移酶(DNMTs)水平。提取全血淋巴細胞DNA，用酶聯(lián)免疫吸附法檢測淋巴細胞基因組甲基化水平。結果：與對照組比較，觀察組血漿Hcy含量、SAH含量顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，觀察組血漿DNMTs含量、全基因組甲基化水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。觀察組外周血淋巴細胞基因組甲基化與Hcy (r=-0.757，P<0.05)、SAH(r=-0.94，P<0.01)呈負相關，SAH與外周血淋巴細胞基因組甲基化相關性高于Hcy(Z=4.756，P<0.01)。DNMTs與Hcy(r=-0.537，P<0.05)、SAH(r=-0.672，P<0.01)呈負相關，SAH與DNMTs相關性高于Hcy(Z=7.745，P<0.01)。結論：冠心病患者外周血淋巴細胞基因組甲基化水平顯著降低，與Hcy和SAH呈負相關，且與SAH的相關性高于Hcy。

同型半胱氨酸；S-腺苷同型半胱氨酸；基因組甲基化

同型半胱氨酸(Hcy)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)都是蛋氨酸的代謝產(chǎn)物[1]，Hcy增高被認為是冠心病(CAD)的高危因素之一[2]。然而大規(guī)模的使用維生素B和葉酸降低了血漿Hcy水平，卻未能改善血管損傷和減少動脈粥樣硬化的風險[3-4]。有學者提出Hcy并不是冠心病的直接致病原因，而是另外一個危險因素SAH的標志物，即Hcy的毒性來自于SAH的累積，但需要更多的證據(jù)來證實[5]。DNA甲基化是表觀遺傳的重要分子機制，基因組DNA甲基化水平改變是評價心血管疾病的指標之一。研究顯示，外周血白細胞基因組甲基化水平下降與Hcy和SAH均呈負相關[6-8]。然而有關中國人群冠心病患者中Hcy和SAH與外周血白細胞基因組甲基化水平相關性的報道甚少，對此本文進行研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2015年6月—2016年6月山西省汾陽醫(yī)院心血管內(nèi)科冠心病患者70 例(觀察組)。冠心病診斷參照中國冠心病診療指南[9-11]，冠狀動脈造影證實其冠狀動脈至少有一支狹窄度≥50%；排除糖尿病、感染性疾病、惡性腫瘤或嚴重肝腎功能不全者。對照組選擇某單位體檢排除冠心病的健康人群70 例。所有入選者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑

多功能酶標儀(美國伯騰)，UV755B分光光度計(蘇州萊頓)，Hcy和SAH酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(美國Arthus Biosystems)，人外周血淋巴細胞分離液(北京索萊寶)，DNA提取試劑盒(大連博士德)，甲基轉移酶(DNMTs)酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒和基因組DNA甲基化定量檢測試劑盒(美國Epigentek)。

1.3 臨床指標檢測

測量兩組人群身高體重，計算身體質(zhì)量指數(shù)。連續(xù)3天同一時間測量血壓水平。Olympus2700生化分析儀測定血脂水平，包括總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白A1(APOA1)、載脂蛋白B(APOB)。

1.4 血漿Hcy、SAH和DNA甲基轉移酶含量檢測

空腹靜脈采血5 mL放入EDTA抗凝管中，2 000～3 000r/min離心20min，分離出血漿，分裝并-20℃保存，采用酶聯(lián)免疫法測定以上指標[12-13]。

1.5 全基因組甲基化分析

空腹靜脈采血5 mL放入EDTA抗凝管，采用密度法分離淋巴細胞，依據(jù)試劑盒說明書提取淋巴細胞DNA，采用Epigentek公司甲基化試劑盒檢測全基因組DNA甲基化水平[14]。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較

兩組患者性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)、收縮壓、舒張壓、吸煙史等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學意義(見表1)。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組血漿Hcy、SAH、DNMTs及外周血淋巴細胞全基因組甲基化水平比較

與對照組比較，觀察組血漿Hcy含量、SAH含量顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與對照組比較，觀察組血漿DNMTs含量、全基因組甲基化水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見表2)。

表2 兩組血漿Hcy、SAH、DNMTs及外周血淋巴細胞全基因組甲基化水平比較

2.3 相關性分析

對照組Hcy與SAH無相關性(r=0.236 5，P=0.235)；觀察組Hcy與SAH呈正相關(r=0.857 0，P<0.05)。觀察組Hcy與外周血淋巴細胞基因組甲基化水平呈負相關(r=-0.757，P<0.05)，SAH與外周血淋巴細胞基因組甲基化水平呈負相關(r=-0.94，P<0.05)，相關系數(shù)比較SAH與外周血淋巴細胞基因組甲基化水平的相關性要高于Hcy(Z=4.756，P<0.01)。觀察組Hcy與DNMTs呈負相關(r=-0.537，P<0.01)，SAH與DNMTs呈負相關(r=-0.672，P<0.01)，相關系數(shù)比較SAH與DNMTs的相關性高于Hcy(Z=7.745，P<0.01)(見表3)。

表3 兩組Hcy、SAH與DNMTs、外周血淋巴細胞甲基化水平相關性分析

3 討 論

Hcy增高被認為是冠心病的獨立高危因素之一，對于這一觀點目前仍存在爭議。來自維生素干預腦卒中預防試驗(VISP)、挪威維生素試驗(NORVIT)、心臟結局預防評估試驗2(HOPE-2)等研究提示，通過補充維生素B和葉酸降低了血漿Hcy水平，但對冠心病危險沒有明顯影響[3-4]。在一項前瞻性隊列研究中，在校正Hcy后，SAH與心臟事件風險呈正相關，而校正SAH后，Hcy與心血管事件風險并無相關性[15]，因此有人提出Hcy的毒性來自于SAH的積累，Hcy可能是冠心病的標志物而不是原因，對于冠心病的預測SAH比Hcy更為敏感[16]。SAH是Hcy的前體物質(zhì)，在SAH水解酶(SAHH)作用下轉變成Hcy，該反應是可逆的，Hcy增高可使反應向SAH合成的方向進行導致其增高[17]。在本研究中，與對照組相比，觀察組血漿Hcy水平和血漿SAH水平均顯著增高，相關性分析提示Hcy與SAH呈正相關性。

DNA甲基化是在DNA甲基轉移酶的作用下，以SAM為甲基供體，將活化的甲基引入胞嘧啶的第五位碳原子上，在不改變DNA堿基序列的基礎上使DNA修飾發(fā)生變化從而調(diào)控基因的表達。多項研究證實，冠心病發(fā)病風險與基因組DNA甲基化改變有關，然而研究結果不盡相同。動物實驗顯示，高蛋氨酸飼養(yǎng)載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠的外周血細胞基因組DNA甲基化水平降低，與Hcy呈負相關[6]。還有研究顯示，高蛋氨酸喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠主動脈DNA甲基轉移酶1(DNMT1)活性和DNA基因組甲基化水平與其血漿SAH水平呈負相關[7]，提示基因組DNA甲基化水平與Hcy和SAH均有關。Castro等[8]對17 例心血管疾病患者(8 例腦卒中和9 例心肌梗死患者)研究發(fā)現(xiàn)，外周血白細胞基因組甲基化水平明顯下降，并且與Hcy和SAH均呈負相關。在新加坡華人中的研究表明，基因組DNA甲基化水平的升高與冠心病密切相關[18]。印度人群的冠心病患者與正常健康人相比，冠心病患者的總體DNA甲基化程度要明顯高于對照組，而且冠心病患者血清中的同型半胱氨酸水平明顯高于對照組[19]。

基因組甲基化水平與Hcy和SAH水平有關。SAM脫去甲基后轉化為SAH，SAH可結合到DNMTs的催化區(qū)，導致其結構改變、活性降低，繼而影響了DNA的甲基化水平。本研究觀察組基因組甲基化水平與Hcy和SAH呈負相關，且SAH與基因組甲基化水平的相關性高于Hcy；觀察組DNMTs降低，與Hcy和SAH呈負相關，且SAH與DNMT1的相關性高于Hcy，由此可見，在冠心病患者中，SAH與外周血淋巴細胞的基因組甲基化相關性強于Hcy，與累積的SAH直接抑制DNMTs有關，SAH是比Hcy更為敏感的指標。

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2017-07-10

(本文編輯：王作利)

TherelationshipbetweenperipheralbloodlymphocytesglobalDNAmethylationandplasmaHcyandSAHinpatientswithcoronaryarterydisease

LI Li1，GAO Shengli1，2，ZAI Xiaojuan1，GUO Renwei1，LI Shufeng3

(1.Affiliated Fenyang Hospital of Shanxi Medical University，F(xiàn)enyang 032200，China；2.Fenyang College of Shanxi Medical University，F(xiàn)enyang 032200，China；3.Chinese Academy of Medical Sciences in Institute of Medical Information，Beijing 100020，China)

Objective：To research the correlation between peripheral blood lymphocytes global DNA methylation and plasma homocysteine(Hcy) and S-adenosyl hom ocysteine(SAH) in patients with coronary artery disease.Methods：All 70 cases of patients with coronary heart disease were come form in Cardiovascular Medicine in Fenyang Hospital of Shanxi Medical University，70 cases of control group were healthy people.Plasma Hcy，SAH and DNMTs levels was detectsd by enzyme-linked immunosorbent assay.Extracting whole blood lymphocyte DNA and Global DNA methylation was detectsd by enzyme-linked immunosorbent assay.Results：Compared with control group，in coronary artery disease group，plasma Hcy levels was significantly increased of coronary heart disease (P<0.05)，the level of SAH was increased significantly (P<0.05)，the content of DNMTs was decreased significantly (P<0.05)，peripheral blood lymphocyte DNA methylation was significantly decreased (P<0.05).In coronary artery disease group，peripheral blood lymphocytes global DNA methylation and Hcy were negatively correlated(r=-0.757，P<0.05)，negatively correlated with SAH (r=-0.94，P<0.01).The correlation of SAH and peripheral blood lymphocytes global DNA methylation is higher than that of Hcy (Z=4.756，P<0.01).DNMTs and Hcy was negatively correlated (r=-0.537，P<0.05)，with SAH was negatively correlated(r=-0.672，P<0.01).The correlation of SAH and DNMTs is higher than that of Hcy (Z=7.745，P<0.01).Conclusion：Peripheral blood lymphocyte Global DNA methylation level was significantly decreased in patients with coronary heart disease，and negatively correlated with Hcy and SAH，The correlation of between SAH and Global DNA methylation is stronger than that of Hcy.

homocysteine；s-adenosylhomocysteine；global dna methylation

R541.4

A

1671-8631(2017)12-0899-05

〔1〕本課題為山西醫(yī)科大學汾陽學院校級基金(課題編號：1406)

*本文通訊作者：高勝利

李莉(1968— )，女，山西省汾陽市人，學士學位，主任醫(yī)師。研究方向：冠心病表觀遺傳機制與治療。