HPLC法測定安神補腦液中防腐劑的含量Δ

陳靈君，王發英，王偉影#（1.浙江中醫藥大學附屬第三醫院，杭州310005；.麗水市食品藥品與質量技術檢驗檢測院，浙江麗水 33000）

HPLC法測定安神補腦液中防腐劑的含量Δ

陳靈君1＊，王發英2，王偉影2#（1.浙江中醫藥大學附屬第三醫院，杭州310005；2.麗水市食品藥品與質量技術檢驗檢測院，浙江麗水 323000）

目的：建立測定安神補腦液中防腐劑含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18，流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為236 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。結果：苯甲酸和羥苯乙酯檢測質量濃度線性范圍分別為12.85～128.54μg/mL（r＝0.999 9）、4.05～40.48μg/mL（r＝0.999 8）；定量限分別為0.514、1.012 μg/mL，檢測限分別為0.171、0.353 μg/mL；精密度、穩定性、重復性試驗的RSD＜1.0%；加樣回收率分別為99.38%～100.21%（RSD＝0.31%，n＝6）、97.96%～100.72%（RSD＝0.91%，n＝6）。結論：該方法操作簡單、結果準確，可用于安神補腦液中防腐劑的含量測定。

高效液相色譜法；安神補腦液；防腐劑；含量

安神補腦液是由鹿茸、制何首烏、淫羊藿提取物及維生素B1等加入單糖漿/蔗糖溶液/果糖溶液及防腐劑制成的復方中藥制劑，具有生精補髓、益氣養血、強腦安神的功效；可用于腎精不足、氣血兩虧所致的頭暈、乏力、健忘、失眠等癥的治療[1]。該制劑收載于2015年版《中國藥典》（一部），現行標準只對處方中部分藥味進行了鑒別或含量的測定，但對其中的防腐劑尚未作出規定[1]。安神補腦液中所用的防腐劑為常用化學防腐劑——苯甲酸和羥苯乙酯。過量使用苯甲酸不僅破壞維生素B1、影響人體對鈣的吸收、刺激胃腸道、損壞神經系統，而且還會對人體肝臟造成危害，具有致癌性、細胞毒性[2-3]；過量使用羥苯乙酯會產生變態反應以及類激素作用[4]。為保證患者的用藥安全，筆者參考相關文獻[5-7]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測定該制劑中防腐劑含量的方法，以期為完善該制劑的質量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀、包括G4212B二極管陣列檢測器、G1329B自動進樣器、Aglient色譜工作站（美國Agilent公司）；XS105DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-QA10型超純水儀（美國Millipore公司）

1.2 藥品與試劑

安神補腦液（吉林敖東延邊藥業股份有限公司，批號：1512026、1604211、1604213、1606214、1609020，規格：10 mL/支）；苯甲酸對照品（批號：100419-201202，純度：100%）、羥苯乙酯對照品（批號：00847-201102，純度：99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙睛、甲醇和磷酸為色譜純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，16%→20%A；5～25 min，20%→85%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：236 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取苯甲酸對照品24.10 mg和羥苯乙酯對照品15.18 mg，分別加甲醇制成每1 mL含苯甲酸482.0 μg、羥苯乙酯303.6 μg的單一對照品貯備液。精密吸取上述兩種單一對照品貯備液各適量，加甲醇制成每1 mL含苯甲酸64.27 μg、羥苯乙酯20.24 μg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品2 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝制備無防腐劑的樣品，再按“2.2.2”項下方法制備陰性對照溶液。

2.3 系統適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，各待測成分均能達到基線分離，分離度均＞1.5；理論板數以苯甲酸峰計為109 061，以羥苯乙酯峰計為192 418；保留時間分別為12.93、15.97 min。結果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液 0.1、0.2、0.5、1、2 mL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以苯甲酸和羥苯乙酯質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得苯甲酸回歸方程為y＝40.058 4x－0.045 6（r＝0.999 9）、羥苯乙酯回歸方程為y＝19.196 5x+0.036 3（r＝0.999 8）。結果表明，苯甲酸和羥苯乙酯檢測質量濃度線性范圍分別為12.85～128.54、4.05～40.48 μg/mL。

2.5 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD。結果，苯甲酸和羥苯乙酯的LOQ分別為0.514、1.012 μg/mL，LOD分別為0.171 、0.353 μg/mL。

2.6 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，苯甲酸和羥苯乙酯峰面積的RSD分別為0.15%、0.17%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：1512026）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、18、30 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，苯甲酸和羥苯乙酯峰面積的RSD分別為0.17%、0.47%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置30 h內穩定性良好。

2.8 重復性試驗

取樣品（批號：1512026）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果，苯甲酸和羥苯乙酯含量的平均值分別為0.188%、0.046%，RSD分別為0.31%、0.98%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密量取樣品（批號：1512026）1 mL，共6份，分別置于50 mL量瓶中，各加入一定質量的苯甲酸和羥苯乙酯對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結果見表1。

2.10 樣品中防腐劑含量測定

取5批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算防腐劑含量，結果見表2。

3 討論

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 樣品防腐劑含量測定結果（n＝3，%）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3.1 流動相的選擇

筆者參考相關文獻[8-9]，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.02%乙酸銨溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動相時對色譜分離的影響。結果，甲醇-水、乙腈-水為流動相進行梯度洗脫時，苯甲酸和羥苯乙酯有拖尾現象；以甲醇-0.02%乙酸銨溶液為流動相進行梯度洗脫時，苯甲酸和羥苯乙酯的保留時間波動較大；以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫時，苯甲酸和羥苯乙酯分離效果理想、峰形佳、理論板數高。故本試驗選擇乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相進行梯度洗脫。

3.2 檢測波長的選擇

查閱相關文獻[10-12]，苯甲酸和羥苯乙酯的檢測波長不同。但在預試驗中，筆者在200～400 nm波長范圍內進行全波長掃面，發現苯甲酸和羥苯乙酯在236 nm波長處響應值均較高，且在此波長處無其他成分干擾，因此選擇236 nm作為檢測波長。

3.3 樣品測定結果分析

2015年《中國藥典》（四部）對合劑中防腐劑的用量作了規定，其中苯甲酸的用量不得超過0.3%（其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計），羥苯酯類的用量不得超過0.05%[13]，本試驗樣品中苯甲酸的含量為0.176%～0.188%、羥苯乙酯的含量為0.043%～0.046%，均未超出限定用量；但相比苯甲酸，羥苯乙酯的用量則需注意控制。

綜上所述，本方法操作簡單、結果準確，可用于安神補腦液中防腐劑的含量測定。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：884-885.

[2]謝兆輝，李學貴，許禔森.防腐劑苯甲酸（鈉）測定方法的研究進展[J].糧食與油脂，2015，28（3）：6-10.

[3]王思文，鞏江，高昂，等.防腐劑苯甲酸鈉的藥理及毒理學研究[J].安徽農業科學，2010，38（30）：16724、16846.

[4]陳龍浩，王雪榮，孫春玲，等.HPLC法測定鹽酸丁卡因滴眼液中羥苯乙酯的含量[J].西北藥學雜志，2015，30（2）：149-151.

[5]郭旭光.HPLC法同時測定水楊酸復合洗劑中苯甲酸和水楊酸的含量[J].中國藥房，2014，25（28）：2667-2669.

[6]胡衛南.HPLC法測定強力枇杷露中苯甲酸鈉的含量[J].中國藥房，2016，27（9）：1257-1259.

[7]敬小麗，余蓉，李莉，等.高效液相色譜法測定飲料中苯甲酸、山梨酸鉀[J].預防醫學情報雜志，2017，33（3）：212-215.

[8]谷亦平，楊園，李霜，等.HPLC法同時測定馬來酸噻嗎洛爾滴眼液中噻嗎洛爾和羥苯乙酯的含量[J].藥物分析雜志，2017，37（1）：125-129.

[9]張留記，周志敏，屠萬倩，等.反相高效液相色譜法測定牡丹皮中苯甲酸和苯甲酰基總苷[J].中南藥學，2017，15（5）：671-673.

[10]田海燕，李智慧.HPLC法同時測定吡諾克辛鈉滴眼液中不同抑菌劑的含量[J].中國藥事，2017，31（2）：150-156.

[11]劉彥，倪美萍，劉睿思，等.中藥口服液中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的中空纖維離心超濾-HPLC法測定[J].中國醫藥工業雜志，2017，48（5）：726-729.

[12]王帆.HPLC法測定羅紅霉素顆粒中3種對羥基苯甲酸酯類防腐劑[J].海峽藥學，2013，25（8）：80-82.

[13]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：26.

Content Determination of Antiseptics in Anshen Bunao Oral Liquid by HPLC

CHEN Lingjun1，WANG Faying2，WANG Weiying2（1.The Third Affiliated Hospital of Zhejiang University of TCM，Hangzhou 310005，China；2.Lishui Inspection Institute of Food and Drug ＆ Quality and Technology Inspection，Zhejiang Lishui 323000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of antiseptics in Anshen bunao oral liquid.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent Zorbax SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%phosphorice acid solution（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 236 nm，and column temperature was 30 ℃.The injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range of benzoic acid and ethylparaben were 12.85-128.54 μg/mL（r＝0.999 9）and 4.05-40.48 μg/mL（r＝0.999 8），respectively.The limits of quantitation were 0.514，1.012 μg/mL.The limits of detection were 0.171，0.353 μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 1.0%.The recoveries were 99.38%-100.21%（RSD＝0.31%，n＝6），97.96%-100.72%（RSD＝0.91%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，and can be used for content determination of antiseptics in Anshen bunao oral liquid.

HPLC；Anshen bunao oral liquid；Antiseptics；Content

R927.2

A

1001-0408（2017）33-4722-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.31

浙江省公共科技條件平臺項目（No.2012E60008）

＊中藥師。研究方向：中藥質量控制。電話：0571-87238002。E-mail：chen3952991@163.com

#通信作者：副主任中藥師。研究方向：藥物分析、藥物質量控制。電話：0578-2661121。E-mail：onlyying0508@gmail.com

（編輯：劉 柳）

2017-07-02

2017-08-10）