聽覺功能生物學修復和重建的研究進展

李文妍 李華偉

(1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院耳鼻喉科,2耳鼻喉科研究院,上海 200031)

專家簡介李華偉,教授,博士生導師,973項目首席科學家,長江學者特聘教授及國家杰出青年基金獲得者,教育部創新團隊帶頭人,國家衛生計生委突出貢獻中青年專家,上海市領軍人才和優秀學術帶頭人。現任復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院耳鼻喉科研究院院長,耳鼻喉科主任,上海市醫學會耳鼻咽喉頭頸外科分會副主任委員。致力于感音神經性聾、周圍性眩暈發病機制和治療的研究。擅長耳和側顱底顯微外科,將“精準醫療”的理念引入人工耳蝸植入的圍手術期評估和手術治療中,在各型中耳炎、耳硬化癥、聽骨鏈畸形導致的傳導性聾的手術治療以及感音神經性聾的人工耳蝸的植入手術方面均積累了豐富的經驗,開創了經迷路上間隙保留聽骨鏈的面神經全程減壓手術。

作為學科帶頭人,帶領復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院聽覺及言語疾病科的成員,每年完成耳顯微外科手術超過4 000例,已經成為目前世界范圍內業務量最大及設施最全的聽覺醫學專科;圍繞著聽覺損傷保護及再生、遺傳性聾診斷及發病機制、人工耳蝸優化及臨床技術和耳顯微外科臨床技術研究等領域開展了一系列深入的研究工作,建立起了一支扎實的聽力學研究隊伍。聽覺醫學團隊獲得了2011年復旦大學優秀創新團隊稱號、上海市領先專業“重中之重”資助,培養出一批出色的青年研究人員。以第一作者或通信作者在NatMed、ProcNatlAcadSciUSA、EMBOMolMed以及JNeurosci等國際著名雜志上發表SCI收錄的論著80余篇,并獲國家科技進步二等獎,教育部高等學校自然科學一等獎,上海市科學技術一等獎,中華醫學科技獎等,先后主持國家杰青基金、國自然科學基金面上項目、重點項目、重大國際合作項目,以及科技部國家重點研發計劃項目、973項目等多項國家級和省部級課題。

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聽覺功能生物學修復和重建的研究進展

李文妍1,2李華偉1,2△

(1復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院耳鼻喉科,2耳鼻喉科研究院,上海 200031)

感音神經性耳聾是最常見的感官障礙疾病,在嚴重影響患者的生活質量的同時也帶來了沉重的家庭和社會負擔。盡管助聽器和人工耳蝸植入在一定程度幫助患者實現聽覺功能的部分恢復,但是遠未達到重建自然聽力的效果。因此通過生物學的方式修復耳蝸感覺上皮的遺傳缺陷以及促進毛細胞損傷之后的功能再生是實現聽覺重建的理想途徑。本文從感音神經性耳聾基因治療和毛細胞再生兩個方面綜述了聽覺功能生物學重建的研究進展。

感音神經性耳聾; 基因治療; 毛細胞再生; 聽力重建

耳蝸是我們能夠感知到自然界豐富美妙聲音的重要感知器官,精細復雜的耳蝸結構為不同頻率和響度聲音的感知提供了解剖和生理基礎。在耳蝸的感覺上皮中,終末感受細胞毛細胞和支持細胞相間排列形成高度特化的耳蝸Corti器,也正是這種結構和細胞組成異質性和高耗能的特點,耳蝸毛細胞極易受到遺傳缺陷、耳毒性藥物、噪音和外傷等因素的損害,導致感音神經性耳聾[1]。

2013年WHO的統計數據顯示,全球聽力障礙的人數為3.6億人,在我國聽力殘疾是僅次于肢體殘疾的第二大致殘疾病。聽力障礙給患者在言語發育和社會交往方面帶來了極大的困難,同時也導致了嚴重的社會問題和經濟問題。目前針對感音神經性耳聾的治療依賴于能夠放大外界聲源的助聽器設備和植入電極直接刺激聽覺神經的人工耳蝸設備,雖然這些治療措施能夠幫助患者實現部分聽覺功能的恢復,但是遠未達到重建自然聽力的效果。

相對于魚類、禽類等非哺乳動物而言,哺乳動物耳蝸毛細胞損傷之后不能夠再生,將導致不可逆的聽覺功能障礙。因此探索毛細胞損傷機制,修復耳蝸感覺上皮的功能缺陷以及促進毛細胞損傷之后的功能再生是實現聽覺重建的理想途徑,也是耳科學領域的醫生和研究者們關注的焦點。

感音神經性耳聾的基因治療

感音神經性耳聾的基因治療概況 感音神經性耳聾是最常見的感官和功能缺陷性疾病,其中2/3的語前聾由遺傳因素引起,而95%以上的遺傳性耳聾是受一對等位基因控制的單基因遺傳病,一直是遺傳學研究和基因治療的重點。相對于其他組織器官而言,耳蝸感覺上皮位于堅固的內耳骨性結構中,存在天然的血-迷路屏障,為基因治療提供了一個相對封閉的干預空間,能最大限度地減少基因治療載體向周圍的擴散,降低對周圍組織和全身其他系統的影響,為感音神經性耳聾的基因治療提供了便利。

在感音神經性耳聾基因治療策略的制定過程中,需要考慮到突變基因致病機制、靶細胞以及基因載體等多方面的因素[2]。特定的突變基因將影響內耳特定的細胞類型,在細胞結構和功能層面上影響正常的感音功能,因此充分研究耳蝸感覺上皮中各細胞成分的生物學特點,目標基因在耳蝸中的時空表達特點和致病機制,對于基因治療策略的選擇(基因替代、基因沉默和基因編輯),基因治療靶細胞的確定,基因治療載體、內耳徑路以及治療時間窗的選擇都具有重要意義。

感音神經性耳聾基因治療靶細胞 目前的研究表明50%的遺傳性感音神經性耳聾是由于毛細胞表達基因的突變所導致[3],在毛細胞頂端成簇狀排列的纖毛結構中存在機械傳導通道,該通道能夠將機械運動轉化成電化學活動,是毛細胞實現感音功能的重要組成部分,當編碼機械傳導通道結構蛋白基因發生突變,將干擾機械信號向電信號的傳導過程,導致感音神經性耳聾,是耳蝸感覺上皮中最脆弱、最容易受到遺傳因素影響的部分[3]。支持細胞是內耳感覺上皮中另外一個重要的組成成分,為毛細胞提供機械支撐,同時發揮穩定內耳微環境的重要作用,支持細胞和支持細胞之間形成縫隙鏈接,這種縫隙鏈接通道主要由Connexin蛋白家族成員Connexin26和Connexin 30所組成,其中編碼Connexin26的Gjb2基因突變是導致人類感音神經性耳聾的最常見的遺傳突變[4]。此外,血管紋是位于耳蝸中階外側的結構成分,主要由邊緣細胞、中間細胞、基底細胞和毛細血管內皮細胞構成,對于產生和維持耳蝸中階的高鉀環境和內淋巴電位具有重要的作用[5]。因此毛細胞、支持細胞和血管紋細胞都可能成為基因治療的靶標,在基因治療策略的制定過程中,需要針對不同的靶細胞選擇相應的內耳徑路和基因載體。

感音神經性耳聾基因治療徑路與載體 內耳徑路主要包括經圓窗或卵圓窗注射的外淋巴徑路,以及經耳蝸打孔或內淋巴囊注射的內淋巴徑路兩種,具體徑路的選擇依賴于靶細胞的類型和載體的特點。基因治療載體包括病毒載體和非病毒載體,其中病毒載體包括慢病毒、腺病毒和腺相關病毒載體,由于不同的病毒載體轉染的細胞類型、效率以及表達的時間窗有很大的差別,病毒載體的選擇對于治療效果有很大的影響。我們在前期的研究過程中分別比較了新生小鼠和成年鼠中階內淋巴徑路注射12種不同血清型的腺相關病毒和慢性毒對耳蝸感覺上皮不同細胞亞群的感染效率和外源性基因的表達水平,結果發現在新生鼠階段經耳蝸中階注射病毒能夠有效地感染耳蝸感覺上皮的各型細胞(不同的血清型感染的細胞類型有差異)而不會影響其正常的聽覺功能[6-7]。在成年鼠階段中階注射各型腺相關病毒感染的細胞類型與新生鼠階段類似,感染的部位與注射的部位有關,同時注射會導致注射耳外毛細胞的死亡和聽覺功能的喪失[6]。Luk H.Vandenberghe課題組將最新合成的AAV載體Anc80L65通過圓窗膜注射入內耳,獲得了極高的內外毛細胞轉染效率(達90%),同時不會損傷毛細胞的結構和功能,為以毛細胞修復為目的的基因治療提供了良好的載體[8]。此外還有非病毒載體如陽離子脂質體等,盡管目前相關的研究應用仍然不多,但鑒于這些合成材料的生物安全性和缺乏免疫原性的特點,在某些特定的情況下仍有可能被廣泛應用,產生優于病毒載體的效果[2]。

感音神經性耳聾的基因治療進展 目前盡管感音神經性耳聾的基因治療仍未進入臨床試驗階段,但是在實驗室已經產生了一些令人振奮的研究成果:2012年Lawrence R.Lustig課題組利用AAV1-Vglut3轉染耳蝸毛細胞實現了Vglut3基因缺陷性小鼠的聽覺功能恢復,是哺乳動物毛細胞基因治療的第一個成功案例[9]。我們課題組與美國埃默瑞大學合作研究項目中,利用編碼鉀離子通道亞基KCNQ1基因敲除小鼠模擬人類重度先天性耳聾的Jervell and Lange-Nielsen (JLN)綜合征,并在P0-P2小鼠的耳蝸中階注射AAV-Kcnq1載體,成功挽救了轉基因小鼠耳蝸的結構和聽覺功能,是第一個針對耳蝸血管紋基因治療的成功案例[9]。2015年Jeffery Holt的課題組利用跨膜通道蛋白1(TMC1)基因敲除小鼠和點突變小鼠(Beethoven小鼠)模型模擬人類的DFNB7/11和DFNA36遺傳性耳聾,并利用AAV2/1-Cba-TMC1成功感染耳蝸內毛細胞并有效表達TMC1,改善了小鼠的聽覺功能[10]。此外最新的研究表明,利用Anc80L65合成的AAV病毒載體,能夠顯著提高Usher綜合征1C型模型小鼠的聽力和前庭功能狀態,甚至達到野生小鼠的水平[11]。

上述成功的基因治療案例主要是針對突變基因功能的缺失或者不足而采取的基因替代治療策略,而在遺傳性聾的發病機制中,90%以上的遲發型聾是顯性遺傳的單基因突變導致的,其中約一半以上突變的致病機制是突變等位基因表達產物的顯性負效應。因此,通過減少突變等位基因表達量的基因治療策略,有可能減少異常的表達產物的累積,從而促進聽覺功能的恢復。

基于CRISPR/Cas9的人工核酸酶基因組定點編輯技術,為基因治療過程中特定的基因組序列的敲除或堿基的改變提供了理想的工具。我們課題組成員前期參與的研究工作中,利用陽離子脂質體成功地將Cas9-sgRNA復合物導入小鼠內耳中,在20%的毛細胞中實現了Cas介導的基因修飾,對該系統的深入研究將為基因治療提供新的方法和工具[12]。

目前的研究成果顯著推進了本領域基因治療的研究,并為進一步的臨床研究奠定了扎實的基礎,在此基礎上利用大型哺乳動物的實驗研究,將為臨床治療的安全性和有效性提供良好的參考標準。

耳蝸毛細胞的功能再生包括遺傳缺陷在內的各種損傷因素終將導致耳蝸毛細胞不可逆的損傷和缺失,是感音神經性耳聾的主要因素,因此促進毛細胞再生,重建耳蝸感覺上皮結構和功能的完整性,被認為是聽覺功能恢復的理想途徑[1]。研究認為在胚胎發育的過程中,支持細胞和毛細胞來源于相同的前體細胞亞群,新生鼠耳蝸中純化的支持細胞在體外培養的過程中能夠增殖并分化為毛細胞,因此支持細胞被認為是毛細胞再生的理想細胞來源[13]。毛細胞再生的方式主要有兩種,一種是受損細胞周圍的支持細胞向毛細胞的直接轉分化,但這種再生方式必然伴隨著支持細胞數目的減少和耳蝸Corti器結構的改變;另一種是支持細胞重新進入細胞周期,增殖后部分轉分化為毛細胞,在再生毛細胞的同時能夠維持支持細胞數目的穩定,對于聽覺功能的恢復具有重要的意義。

支持細胞向毛細胞的直接轉分化 Atoh1是決定毛細胞命運的關鍵轉錄因子[14],在小鼠胚胎發育過程中以及新生鼠階段的支持細胞中高表達Atoh1能夠促進支持細胞向毛細胞的直接轉分化[15]。盡管有研究表明在成年豚鼠的耳蝸中高表達Atoh1能夠促進耳蝸毛細胞的再生和聽覺功能的恢復[16],但隨后大量的研究表明無法重復出類似的實驗結果[17-18],認為該過程僅僅涉及受損毛細胞的修復,并不存在功能意義上的毛細胞再生[19]。最新的研究表明,聯合P27Kip1基因敲除和高表達Atoh1,以及同時上調Gata1/Pou4f3與Atoh1,均能夠促使成年小鼠耳蝸支持細胞向毛細胞的直接轉分化,為利用Atoh1激活成年鼠毛細胞再生提供了新的研究思路[20]。

Notch信號通路在內耳的發育過程中發揮著重要的作用,在內耳發育的早期,Notch信號的持續活化對于前感覺上皮的決定具有重要的作用,在耳囊中高表達NICD能夠促使異位感覺上皮的形成[21]。在內耳發育的后期——毛細胞分化的過程中,Notch信號通路的活化能夠抑制毛細胞周圍細胞向毛細胞的分化,從而形成耳蝸感覺上皮中毛細胞和支持細胞相間排列的獨特的馬賽克樣結構,被稱之為“側向抑制作用”[22]。大量的研究表明,在內耳的發育過程中通過小分子藥物(DAPT)或者敲除Notch信號通路的關鍵基因來抑制Notch信號通路,能夠促進支持細胞向毛細胞的直接轉分化,產生大量的異位毛細胞[23]。在成年鼠噪音性耳聾模型中也發現,利用Notch信號通路的小分子抑制劑,能夠促進支持細胞向毛細胞的直接轉分化,促進聽覺功能的部分恢復[24]。

毛細胞的增殖再生 2003年我們在國際上首次報道了成年鼠內耳感覺上皮中存在干細胞,在體外培養的過程中能夠增殖,并定向誘導為內耳的功能細胞。這一發現為激活內耳細胞增殖和促進毛細胞再生提供了嶄新的研究方向和視角[25]。隨后大量的研究試圖揭示內耳干細胞的生物學特性和調控機制。2012年來自美國兩個獨立實驗室的研究者分別證實具有Wnt活性的Lgr5+支持細胞具有強的增殖和分化潛能,Lgr5被認為是內耳干細胞的特異性標記[26-28]。利用轉基因小鼠的體內實驗研究結果顯示,在Lgr5+的內耳干細胞中上調Wnt 信號通路的關鍵轉錄因子β-catenin能夠促進Lgr5+內耳干細胞的增殖,小部分增殖細胞能夠進一步轉分化為毛細胞,實現毛細胞的增殖再生[29]。

我們近期的研究結果表明,抑制Notch信號通路在促進支持細胞向毛細胞直接轉分化的同時,會激活Lgr5+細胞的增殖并轉分化為毛細胞,實現毛細胞的增殖再生,在這個過程中伴隨著Wnt信號通路的活化。我們的研究結果表明 Notch信號通路位于Wnt信號通路的上游,對Wnt信號通路活化所介導的支持細胞增殖具有抑制作用,在國際上首次提出Notch信號通路在維持內耳感覺上皮細胞數目中的重要作用[30]。

此外我們還發現無論是上調Wnt信號通路還是抑制Notch信號通路,所產生的毛細胞增殖再生的區域主要位于耳蝸的頂圈,此外增殖支持細胞向毛細胞轉分化的比率仍然很低。但耳蝸的底圈——對應高頻感音區域是最容易受到各種因素損傷的部位,因此促進耳蝸中、底圈的毛細胞增殖再生,同時提高增殖支持細胞向毛細胞分化的比率對于臨床上促進聽覺功能的恢復具有重要的意義。

我們在之前研究的基礎上采用了多基因聯合調控細胞重編程的技術,利用轉基因小鼠在上調Wnt信號通路的同時抑制Notch信號通路,同時高表達毛細胞命運決定的重要轉錄因子Atoh1,顯著提高了支持細胞增殖的程度和范圍,同時增殖支持細胞向毛細胞轉分化的比率也有了大幅度提高[31]。

但是同時我們也注意到,上述調控措施均不能促進成年鼠耳蝸毛細胞的增殖再生,而促進成年毛細胞的再生才是感音神經性耳聾治療的核心。因此利用成年哺乳動物研究促進毛細胞增殖再生的生物學策略,探索成年毛細胞再生的調控措施,研發相應的治療措施,是未來毛細胞再生研究的熱點,同時也是難點問題。

綜上所述,基于基因治療的聽覺功能修復和激活毛細胞再生的聽覺功能重建都是目前促進聽覺康復的研究熱點,研究的不斷深入將加深我們對于感音神經性耳聾發病機制的認識,促進我們探索更加安全有效的聽覺功能生物學重建策略。

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Advancesinthebiologicalrestorationofthehearing

LI Wen-yan1,2, LI Hua-wei1,2△

(1DepartmentofOtolaryngology,2InstituteofOtolaryngology,Eyeamp;ENTHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China)

Sensorineural deafness is the most common disorders of senses,which severely impact the life quality and bring heavy burden to the family as well as the society.Current state-of-art treatments focus on sound amplification and implanted electrodes that stimulate the auditory nerve.These strategies offer partial recovery of function for a limited patient population but do not come close to restoring natural hearing.Clearly,there is strong need for development of biological treatments for the hearing restoration through correcting the genetic defects or regenerating the new hair cells on the damaged cochlear sensory epithelium.We reviewed the advances in the biological restoration of the hearing,including the gene therapy and the hair cell regeneration aspects.

sensorineural deafness; gene therapy; hair cell regeneration; hearing restoration

R764.43

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2017.06.011

△Corresponding author E-mail:hwli@shmu.edu.cn

2017-10-01;編輯:張秀峰)