雷帕霉素對睪丸卵黃囊瘤細胞生長及凋亡的影響

林孝坤 王永飚 趙一鳴 姚賢明 蔡祖仁 吳大洲

雷帕霉素對睪丸卵黃囊瘤細胞生長及凋亡的影響

林孝坤 王永飚 趙一鳴 姚賢明 蔡祖仁 吳大洲

目的 研究雷帕霉素對睪丸卵黃囊瘤細胞的生長抑制和誘導凋亡作用。方法 用不同濃度的雷帕霉素(1、10、50、100nmol/L)處理睪丸卵黃囊瘤細胞，設空白組和陰性對照組。采用CCK-8法測定不同濃度雷帕霉素對細胞生長的影響；采用流式細胞儀檢測不同濃度雷帕霉素對細胞周期及凋亡的影響。結果 雷帕霉素可以抑制睪丸卵黃囊瘤細胞生長，呈濃度依賴性和時間依賴性，除1nmol/L濃度組外，其余濃度組各時間點的細胞生長抑制率與陰性對照組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。雷帕霉素可以誘導睪丸卵黃囊瘤細胞凋亡，使細胞停留在G0/G1期，除1nmol/L濃度組外，其余濃度組G0/G1期細胞比例及細胞凋亡率顯著高于陰性對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。結論 雷帕霉素能夠抑制睪丸卵黃囊瘤細胞的生長，促進細胞凋亡。

卵黃囊瘤 雷帕霉素 細胞生長 細胞凋亡

卵黃囊瘤是由胚胎外系生殖細胞異常分化而形成的，又稱為內胚竇瘤，是最常見且高度惡性的兒童生殖細胞腫瘤，約占兒童睪丸腫瘤發病率的50%[1-2]。目前臨床上睪丸卵黃囊瘤的治療方法主要是手術治療，同時輔以化療或放療，但聯合化療不良反應大，使化療的作用受到限制，總療效還欠理想[3]。深入探討睪丸卵黃囊瘤發病的分子機制，發現早期診斷的指標以及潛在的治療靶點，是當前睪丸卵黃囊瘤研究的一項重要內容。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶,不僅在細胞轉錄、翻譯等生物學功能中發揮著重要作用，而且參與調控多種腫瘤細胞的生長、增殖、轉移及凋亡等過程[4]。雷帕霉素是一種mTOR特異性抑制劑，對多種惡性腫瘤如胃腸道神經內分泌瘤[5]、胃癌[6]、前列腺癌[7]、頭頸部鱗癌[8]等具有一定的抑制作用，但對睪丸生殖細胞腫瘤的影響鮮有報道。本研究旨在探討雷帕霉素對睪丸卵黃囊瘤細胞的生長抑制和誘導凋亡作用，為睪丸卵黃囊瘤的治療提供一定的實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和試劑 睪丸卵黃囊瘤細胞由復旦大學中山醫院生物醫學研究中心經原代培養建立,生長穩定,其生物學特性經過鑒定。雷帕霉素為美國Sigma公司產品；DMEM培養基、胰蛋白酶為美國Gibco公司產品，青鏈霉素雙抗為美國Invitrogen公司產品；FBS為美國Hyclone公司產品；EDTA為美國Amersco公司產品；CCK-8試劑盒、流式凋亡試劑盒為日本同仁化學研究所產品；二甲基亞砜為上海華舜生物工程公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 睪丸卵黃囊瘤細胞培養在含有10%FBS、100U/ml青霉素及 100μg/ml鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中。1.2.2 CCK-8法測定細胞生長率 以1×104/孔的密度將睪丸卵黃囊瘤細胞接種于96孔板內，培養24h細胞貼壁后，采用不同濃度（1nmol/L、10nmol/L、50nmol/L、100nmol/L）的雷帕霉素溶于DMSO中處理細胞，設空白組（無細胞僅有培養液）和陰性對照組（有細胞但不加藥），每組設6個復孔。分別于加藥后24、48、72h每孔加入10μl CCK-8試劑，培養箱孵育2h，酶標儀測定450nm波長處的吸光度（OD）值，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率=（對照組吸光度值-實驗組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）。實驗操作重復3次。

1.2.3 PI染色法測定細胞周期 以1×105/孔的密度將睪丸卵黃囊瘤細胞接種于6孔板，用不同濃度（1、10、50、100nmol/L）的雷帕霉素溶于DMSO中處理細胞，設立陰性對照組（有細胞但不加藥）。處理24h后，胰酶消化細胞，PBS洗滌2次，70%冷乙醇固定細胞2h，用含RNA酶的PI溶液染色，采用流式細胞儀分析細胞DNA含量,實驗操作重復3次。

1.2.4 Annexin V/PI雙染色法測定細胞凋亡 以1×105/孔的密度將睪丸卵黃囊瘤細胞接種于6孔板，用不同濃度（1、10、50、100nmol/L）的雷帕霉素溶于 DMSO 中處理細胞，設立陰性對照組（有細胞但不加藥）。處理24h后，采用細胞凋亡檢測試劑盒測定細胞凋亡，按照試劑盒說明書進行操作：胰酶消化細胞，PBS洗滌2次，用1×結合緩沖液重懸細胞。加入Annexin V-FITC，室溫下在暗室孵育10min；PI溶液共染色細胞，流式細胞儀分析。實驗操作重復3次。

1.3 統計學處理 采用SPSS20.0統計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較方差齊性采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度雷帕霉素對睪丸卵黃囊瘤細胞生長抑制率比較 見表1。

由表1可見，除1nmol/L濃度組外，其余3個濃度組各時間點的細胞生長抑制率與陰性對照組比較差異均有統計學意義（均P＜0.05）。隨藥物濃度的提高和作用時間的延長，雷帕霉素對睪丸卵黃囊瘤細胞的生長有明顯的抑制作用，呈濃度和時間依賴性。

表1 不同濃度雷帕霉素對睪丸卵黃囊瘤細胞生長抑制率比較（%）

2.2 不同濃度雷帕霉素對睪丸卵黃囊瘤細胞周期及凋亡的影響 見圖1、表2。

由圖1、表2可見，除1nmol/L濃度組外，其余3個濃度組G0/G1期細胞比例及細胞凋亡率顯著高于陰性對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

睪丸卵黃囊瘤是小兒外科最常見的惡性腫瘤之一,好發于3歲以內的嬰幼兒，不僅惡性程度較高，而且病情進展快，病死率高[9]。基于腫瘤分期的靜脈化療是當前手術治療睪丸卵黃囊瘤之外最重要的手段之一。雖然這兩者的結合提高了患兒的生存率，但是由于化療藥物的不良反應及腫瘤的耐藥性使得其在治療上受到了嚴重的限制[10]。而mTOR抑制劑不僅可以通過抑制mTOR信號通路從而起到腫瘤抑制作用，同時與傳統的化療藥物相比其毒副反應較低，特異性較強。

雷帕霉素是一種從大環內酯類抗生素，最初用作抗真菌藥物，隨后由于發現其免疫抑制功能而在臨床上主要用于器官移植后的抗排異作用。目前已有多項研究發現雷帕霉素可以通過抑制腫瘤細胞生長、抑制血管內皮生長、誘導細胞凋亡等發揮其抗腫瘤作用[11-13]。本研究結果表明，1、10、50、100nmol/L 的雷帕霉素作用睪丸卵黃囊瘤細胞24、48和72h后，對睪丸卵黃囊瘤細胞有明顯的生長抑制作用，且這種抑制效應與藥物濃度和作用時間密切相關。這也表明雷帕霉素作為mTOR的抑制劑，可以通過抑制睪丸卵黃囊瘤細胞生長增殖過程中mTOR信號通路中的關鍵因子mTOR活性，從而起到一定的抑制腫瘤生長作用。因此，深入研究mTOR抑制劑的機制及作用，有望為睪丸卵黃囊瘤的靜脈化療提供新的治療方案，也有望成為睪丸卵黃囊瘤治療的新靶點。

圖1 不同濃度雷帕霉素對睪丸卵黃囊瘤細胞凋亡影響的流式細胞圖（a：陰性對照組；b：1nmol/L濃度組；c：10nmol/L濃度組；d：50nmol/L濃度組；e：100nmol/L濃度組；Annexin-fitc：異硫氰酸工熒光素標記膜聯蛋白V；PI：碘化丙啶）

表2 不同濃度雷帕霉素對睪丸卵黃囊瘤細胞周期及凋亡的影響（%）

腫瘤細胞生長增殖的過程主要有DNA合成前期（G0/G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2/M期）3個時期。如果將腫瘤細胞生長過程的任一周期阻斷，則可以阻滯腫瘤細胞的增殖和抑制腫瘤的生長。本研究流式細胞儀測定結果表明，與陰性對照組相比，10、50、100nmol/L的雷帕霉素作用于睪丸卵黃囊瘤細胞24h后，G0/G1期細胞比例明顯增加，而S期與G2/M期細胞則減少，同時睪丸卵黃囊瘤細胞的凋亡率則明顯增加，差異均有統計學意義，且具有藥物濃度依賴性。這也進一步表明雷帕霉素將睪丸卵黃囊瘤細胞生長過程中細胞周期阻滯在了G0/G1期，并誘導細胞凋亡，從而抑制了睪丸卵黃囊瘤細胞的增殖。

綜上所述，本次研究所采用mTOR靶向抑制劑雷帕霉素作用于體外培養的小兒睪丸卵黃囊瘤細胞，可以抑制腫瘤細胞生長增殖，并且導致細胞凋亡明顯增加，為下一步動物實驗提供了一定的實驗依據，亦為探討mTOR能否作為小兒卵黃囊瘤治療分子靶點提供可行性，但其具體作用機制仍有待進一步研究。

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Effect of rapamycin on growth and apoptosis of testicular yolk sac tumor cells

LIN Xiaokun，WANG Yongbiao,ZHAO Yiming，et al.Department of Pediatric Surgery，the Second Affiliated Hospital and Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325027，China

Objective To investigate the effect of rapamycin on the growth and apoptosis in testicular yolk sac tumor(YST)cells. Methods The testicular YST cells were treated with rapamycin of different concentrations(1nmol/L,10nmol/L,50nmol/L and 100nmol/L).The growth rate for testicular YST cells was evaluated by CCK-8 method,the cell cycle and apoptosis rate were determined by flow cytometry. Results Rapamycin inhibited the growth of testicular YST cells in a concentration and time-dependent manner(P＜0.05).Rapamycin at all concentrations except 1nmol/L induced the apoptosis of testicular YST cells,and also induced cell cycle arrest at G0/G1 phase(P＜0.05). Conclusion Rapamycin can significantly inhibit the cell growth and induce the apoptosis of testicular YST cells.

Yolk sac tumor Rapamycin Cell growth Cell apoptosis

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.22.2016-172

溫州市科技局資助項目（Y20140243）；國家衛生計生委資助項目（2011C1-80）

325027 溫州醫科大學附屬第二醫院、溫州醫科大學附屬育英兒童醫院小兒外科（林孝坤、王永飚、趙一鳴、蔡祖仁、吳大洲）；杭州市兒童醫院小兒外科（姚賢明）

王永飚，E-mail：qtwyb@163.com

2016-10-13）（本文編輯：馬雯娜）