基于SNP標記桃抗蚜性狀的基因定位

張南南，魯振華，崔國朝，潘磊，曾文芳，牛良，王志強

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基于SNP標記桃抗蚜性狀的基因定位

張南南，魯振華，崔國朝，潘磊，曾文芳，牛良，王志強

（中國農業科學院鄭州果樹研究所/國家桃葡萄改良中心/農業部果樹育種技術重點實驗室，鄭州 450009）

挖掘與桃抗蚜性狀緊密連鎖的SNP位點及候選基因，為桃抗性分子標記輔助選擇育種奠定基礎，并為進一步揭示桃抗蚜性狀的遺傳基礎和分子機制提供依據。以來源于‘粉壽星’的抗蚜桃‘01-77-3’為母本，栽培品種‘中油桃13號’為父本，雜交獲得F1代分離群體進行基因定位。以‘96-5-1’（抗蚜）為母本，‘10-7’（感蚜）為父本雜交獲得F1分離群體作為驗證定位位點準確性的材料。參考桃基因組序列（Genome v2.0.a1）開發基于Sanger測序的SNP標記，在親本（‘01-77-3’‘中油桃13號’）及各4個子代中PCR擴增后進行Sanger測序，獲得候選SNP后，擴大群體驗證，實現對抗性基因的初步定位。對親本（‘01-77-3’‘中油桃13號’‘96-5-1’‘10-7’）進行覆蓋度約為70×的全基因組深度測序，并基于重測序數據，在初定位區間內開發基于Sanger測序與HRM分析的SNP標記，篩選多態性標記，對‘01-77-3’ב中油桃13號’雜交后代141株實生苗進行基因分型，以獲得與桃抗蚜型基因緊密連鎖的分子標記。通過雙親（‘96-5-1’‘10-7’）表型與基因型一致，在精細定位區間內開發與桃抗蚜性狀緊密連鎖的InDel位點，以驗證InDel標記與抗蚜表型是否連鎖。最后，參考桃基因組分析定位區間的候選基因。通過人工接種觀察蚜蟲對桃F1后代單株新梢危害表明，抗蚜與感蚜比例接近1﹕1（值為0.556；χ2為0.348），符合孟德爾遺傳規律。基于Sanger測序結果，初步將抗蚜基因定位在桃基因組Pp01_38011783與Pp01_47231340之間，物理距離約為9.22 Mb。親本全基因組深度測序分別產生Clean data 17.109 Gb，平均覆蓋度為75.19×，在Pp01初定位區間內開發基于HRM與Sanger測序的SNP標記共29對，篩選后得到11對緊密連鎖的標記。基因分型結果表明，與桃抗蚜基因緊密連鎖的標記位于桃基因組Pp01的45.66 Mb和46.12 Mb處，Pp01_45.66處等位基因為T和C，Pp01_46.12處等位基因為G和C，遺傳距離分別為1.4 cM、2.1 cM；與抗蚜基因完全連鎖的標記SNP_Pp01_45712702，位于桃基因組Pp01_45.71處，等位基因為G和T。基于親本（‘96-5-1’‘10-7’）重測序數據，在精細定位區間內開發緊密連鎖的InDel標記KYYZ_Pp01_45799758，位于Pp01_45.79處。對驗證群體92個單株進行PCR擴增，經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表明，僅1個單株基因型與表型不符，分子鑒定準確率為98.91%。利用親本深度測序與SNP標記技術相結合的方法，精細定位了控制桃抗蚜性狀的基因，將抗蚜基因縮小到物理區間460 Kb內，共包含56個轉錄本，包括52個候選基因。

桃；SNP標記；抗蚜；基因定位

0 引言

【研究意義】桃[（L.）Batsch]是中國栽培面積較大的落葉果樹之一。據2014年統計中國桃栽培面積799 500 hm2，占世界栽培總面積的53.3%（FAO）。蚜蟲是危害桃產業發展的主要蟲害之一，其危害新梢和幼果，嚴重的會導致葉片卷曲、果實畸形、品質下降、樹體生長勢減弱甚至死亡[1]。發掘和培育抗蚜品種是防治蚜蟲的重要途徑，利用現有遺傳資源開展相關抗性基因的定位工作具有重要意義。【前人研究進展】蚜蟲為半翅目昆蟲，包含近5 000種，是地球上最大、分布最廣、破壞力最強的植食性昆蟲之一[2]。其繁殖力強，生活周期短，常常在短期內就能形成較高的種群密度[3]。據報道，桃綠蚜（GPA）具有很強的抗藥性，因為殺蟲劑的廣泛使用，使得GPA能抵抗眾多的殺蟲劑[4-6]。法國農業科學院（INRA）最先對‘Weeping Flower Peach’（S2678）、‘Rubira?’（S2605）、‘’（P1908）、‘Summergrand’（S39712）和‘Malo konare’（S5392）5種桃抗蚜資源開展了一系列研究工作，發現桃‘Weeping Flower Peach’和‘Rubira?’具有很強的抗蚜能力，進一步研究表明其中有5種抗蚜基因型[7-8]。初步明確了與抗蚜相關的顯性遺傳機制，同時闡明3種不同來源的抗蚜資源抗性機制不同[9-11]。目前，中國已經發現了多種抗性資源。其中，牛良等[1]對‘粉壽星’抗蚜性的遺傳及其穩定性進行分析，明確了其抗蚜性狀由一對顯性基因控制。【本研究切入點】盡管中國有豐富的抗蚜資源，但相關遺傳資源的研究和利用起步較晚，且對抗蚜機制沒有深入研究。基于來源中國重要的抗蚜資源‘粉壽星’，開展抗蚜基因的精細定位是明確桃抗蚜機制與遺傳改良的前提。【擬解決的關鍵問題】本研究在明確‘粉壽星’抗蚜遺傳特征的基礎上，繼續對來源中國‘粉壽星’的桃抗蚜基因進行定位。通過獲得與抗蚜基因緊密連鎖的分子標記實現早期對目標性狀的分子鑒定，提高育種效率，為桃抗蚜資源的挖掘和抗性品種的培育奠定基礎。

1 材料與方法

田間試驗于2014—2016年在中國農業科學院鄭州果樹研究所新鄉試驗基地進行，其他試驗于中國農業科學院鄭州果樹研究所農業部果樹育種技術重點實驗室進行。

1.1 試驗材料

以‘01-77-3’為母本，來源于‘粉壽星’，具有抗蚜性狀，基因型為Rr；以‘中油桃13號’為父本，感蚜，基因型為rr。2014年4月手工去雄后并人工授粉，獲得雜交后代141株實生苗作為基因定位群體。另外，以‘96-5-1’（抗蚜，Rr）為母本，‘10-7’（感蚜，rr）為父本，人工去雄授粉，獲得F1分離后代116株實生苗，用于驗證標記與抗蚜表型的連鎖性。

1.2 表型鑒定與DNA提取

參考PASCAL等[12]的抗蚜表型鑒定方法和標準確定各單株的抗蚜型和感蚜型。2015年4月上旬將兩群體F1代實生苗分別放入網室中進行接種處理，人工接種混合桃綠蚜10頭后套上小紗網，蚜蟲來自試驗園感蚜株，2周后觀察蚜蟲對新梢的危害，確定抗蚜與感蚜表型（圖1）。2016年4月上旬將全部F1代實生苗分別放入網室中進行接種處理，重復鑒定。

采用改良CTAB法[13]提取親本及F1群體各單株基因組DNA，略作修改。加入100 μL體積的0.1×TE溶解沉淀DNA，同時加入0.5 μL的RNase，37℃放置1 h，去除RNA污染（長期保存在-20℃冰箱，常用則存于4℃冰箱）；采用NanoDrop 1000 spectrophotometer（Thermo）和1%的瓊脂糖膠對提取的DNA純度、濃度和完整度進行檢測，并稀釋成工作液濃度（25 ng?μL-1），用于后續研究。

左邊為感蚜，右邊為抗蚜 Left:Sensitive type to green aphid, Right:Resistant type to green aphid

1.3 抗蚜基因的初步定位

參考Genome Database for Rosaceae數據庫的桃基因組（Genome v2.0.a1）序列，采用primer3 Web Version 4.0（http://primer3.ut.ee/）設計引物，引物的退火溫度在60—63℃，長度20—23 bp，開發基于Sanger測序的SNP標記，選擇約每1—2 Mb設計1對引物，擴增片段長度約為1 600 bp或750 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。對親本及各4個子代（抗蚜型和感蚜型）進行PCR擴增（步驟參數詳見TaKaRa Ex Taq說明書），PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。將測序結果在CExpress軟件中打開，序列對齊后尋找與抗蚜性狀緊密連鎖的SNP標記，表現為抗蚜型母本基因型為Rr，感蚜型父本基因型為rr，且子代表型與基因型一致。

1.4 親本深度測序

將檢驗合格的親本（‘01-77-3’‘中油桃13號’‘96-5-1’‘10-7’）基因組DNA樣品（無污染，樣品量＞2 μg，樣品濃度＞50 ng?μL-1）送至北京諾禾致源科技（天津）股份有限公司進行文庫構建，采用Hiseq4000（Illumina，CA）進行基因組重測序，測序深度為70×，下機數據經質量控制及過濾后，獲得Clean Data。參考桃基因組，采用IGV軟件對生成的數據進行分析，尋找與親本表型一致的SNP位點。

1.5 抗蚜性狀緊密連鎖標記的開發

基于兩親本（‘01-77-3’ב中油桃13號’）深度測序數據，在初步定位區間內依據雙親的基因型和表型開發更多的SNP標記，平均每200 Kb處設計1對引物，引物的退火溫度在60—63℃，引物長度20—25 bp，擴增片段長度約為150 bp或700 bp。采用HRM（High Resolution Melting）和Sanger測序技術對雜交組合‘01-77-3’ב中油桃13號’后代群體單株進行SNP基因分型，確立緊密連鎖的SNP標記。HRM master mix試劑購自Roche，在LightCycler 480II定量PCR儀（Roche）上進行SNP基因分型，HRM基因分型參考魯振華等[14]的方法。

1.6 基于分子標記的植株表型鑒定

根據已經獲得的緊密連鎖的SNP標記的物理位置，參考桃基因組數據在親本（‘96-5-1’‘10-7’）中開發表型和基因型一致的InDel標記KYYZ_Pp01_ 45799758。即在同一位點，抗蚜親本基因型為Rr，感蚜基因型為rr。隨機選取92個雜交F1代單株進行PCR擴增，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對擴增片段進行分離、檢測。目的是利用定位區間內的分子標記對雜交后代單株的表型進行鑒定。

2 結果

2.1 抗蚜表型鑒定

觀察蚜蟲對桃新梢的危害，確定抗蚜和感蚜的表型，其中呈紅點狀無其他危害癥狀的為抗蚜類型，具有明顯危害癥狀的為感蚜類型。對‘01-77-3’ב中油桃13號’雜交后代141株實生苗的表型評價表明，67株實生苗抗蚜特性明顯，無蚜蟲侵害，無卷葉，新梢蚜蟲刺探部位有明顯的紅色斑點，為抗蚜型；74株實生苗新稍葉背均有蚜蟲，出現不同程度的卷葉（2—4級），為感蚜型；二者比例接近1﹕1（值為0.556，χ2為0.348），符合孟德爾遺傳規律。‘96-5-1’ב10-7’雜交獲得F1后代116株實生苗，經表型鑒定后隨機選取92個單株（抗蚜型33株，感蚜型59株），用于驗證定位區間的準確性。

2.2 基因的初步定位

基于Genome Database for Rosaceae數據庫的桃基因組（Peach v2.0）序列，依據雙親重測序數據，開發與抗蚜表型一致的SNP標記，共設計引物108對，在親本及感蚜型、抗蚜型各4個子代中PCR擴增后進行Sanger測序。將測序結果在CExpress軟件中打開，序列對齊后根據親本與子代的基因型和表型尋找候選SNP標記，篩選出基因型與表型一致的引物68對，初步獲得可能連鎖的標記；通過擴大雜交群體，在抗蚜型和感蚜型各20個后代單株中進一步驗證連鎖關系，進而在全部樣品中驗證。最終獲得了與抗蚜性狀連鎖的SNP標記SNP_Pp01_38011783與SNP_Pp01_47231340，分別位于桃參考基因組（v2.0.a1）Pp01的38.02 Mb與47.23 Mb處，將目的基因初步定位至Pp01_38011783與Pp01_47231340之間，遺傳距離約為9.22 Mb。

2.3 親本深度測序數據分析

本次測序共產生Raw data均為17.956 Gb，過濾后的Clean data 17.109 Gb，測序質量較高，其中Q20≥94.85%，Q30≥88.57%，全基因組GC含量為39.04%。參考基因組大小為227 411 381 bp，所有樣本的比對率為96.75%，對參考基因組（排除N區）的平均覆蓋深度為75.19×，1×覆蓋度（至少有一個堿基的覆蓋）在98.87%以上。

分析結果顯示，樣本測序質量合格，GC分布正常，建庫和測序成功，可用于后續的變異檢測及相關分析。

2.4 基因的精細定位

根據深度測序數據，開發雜交群體親本‘01-77-3’ב中油桃13號’的SNP。在Pp01初定位區間9.22 Mb內，依據桃參考基因組設計引物，避開Poly區域、重復序列和微衛星區域，以便能夠順利完成測序并獲得更多的SNP信息，在141個后代單株中擴增，抗蚜生長型為Rr，感蚜生長型為rr。29對引物（表1）中，26對引物存在多態的SNP位點，約占總引物數的89.66％，其中11對引物的基因型與表型一致（圖2）。

結合Sanger測序與HRM對141個單株進行基因分型，獲得的重組單株如圖3。在抗蚜基因位點兩翼各篩選出1對引物SNP_Pp01_45665389與SNP_Pp01_ 46120950，與抗蚜基因緊密連鎖。分別位于桃參考基因組Pp01的45.66 Mb和46.12 Mb位置，在母本‘01-77-3’中引物SNP_Pp01_45665389的SNP位點為C/T，在父本‘中油桃13號’中SNP位點為T/T（圖4）；而在母本‘01-77-3’中引物SNP_Pp01_ 46120950的SNP位點為G/C，在父本‘中油桃13號’中SNP位點為C/C。

表1 基因定位引物序列

另外，在以上兩個緊密連鎖的標記之間獲得一對引物SNP_Pp01_45712702，與抗蚜基因完全連鎖，位于桃基因組Pp01的45.71 Mb處，在母本‘01-77-3’中SNP位點為G/T，在父本‘中油桃13號’中SNP位點為G/G（圖5）。

2.5 基于分子標記的植株表型鑒定

根據已經獲得的緊密連鎖的SNP標記的物理位置，在親本（‘96-5-1’‘10-7’）中開發表型和基因型一致的InDel標記KYYZ_Pp01_45799758（表1），并在92個后代單株中進行PCR擴增，產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測后，抗蚜單株呈現明顯的兩條帶，分別為150 bp與200 bp，感蚜單株呈單條帶，為150 bp；且150 bp處不同表型對應條帶具有明顯的多態性（圖6），證明該InDel可用于驗證標記與表型是否連鎖。通過標記基因型和表型比較發現，在92個樣品中，僅1個樣品基因型與表型不一致，驗證符合率為98.91%。

圖2 與目標性狀的連鎖SNP標記在LG01的位置

基于已將目的基因定位在Pp01_45665389—Pp01_46120950，物理距離約460 kb，介于Prupe. 1G559300與Prupe.1G564800兩基因之間，共包含56個轉錄本，52個候選基因，其中包括蟲漆酶14、β-D-木糖苷酶、γ-微管蛋白、Loricrin相關蛋白、DNA結合蛋白、P環核苷三磷酸水解酶蛋白超家族、磷酸吡哆醛（PLP）端依賴轉移酶蛋白超家族等（詳見基因注釋v2.0，https://www.rosaceae.org/search/genes）。

3 討論

單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指單個核苷酸的變異導致的DNA序列多態性，且等位基因頻率不低于1%[15]。目前，SNP標記已被廣泛用于遺傳圖譜構建、分子標記輔助選擇育種[16]和全基因組關聯分析[17-20]。VERDE等[21]通過對56個桃進行測序，獲得了大量SNP位點，分布于桃的8對染色體，平均約每26.7 Kb一個SNP。本研究參考桃基因組數據，利用親本全基因組深度測序數據開發SNP標記，多態率為40%。本研究基于初步定位的區間，利用雙親重測序數據有助于開發更多SNP標記，解決了親本親緣關系較近時，難以獲得多態的SNP標記的問題；且獲得的SNP標記具有針對性，更準確、有效，有利于高效、精確地定位抗蚜基因。

桃蚜是春季危害桃樹最常見的害蟲之一，4—5月為蚜蟲繁殖高峰期，其群集于新梢嫩葉背面危害，抑制新梢生長，危害幼果，導致果實畸形，品質下降[22]。關于桃蚜的防治已有多種報道，化學農藥的殘留會對環境產生威脅、蚜蟲的抗藥性等問題的出現，使得化學防治在桃園管理方面的作用逐漸減小，生物防治對桃蚜蟲的控制也具有很大的局限性[23-25]。因此，研究桃抗蚜遺傳機制，培育抗蚜新品種是防治蚜蟲的一種有效途徑。已有報道表明甜瓜、番茄、蘋果等多種植物中存在抗蚜基因[26-29]。Monet等[30]最早發現桃‘Weeping Flower Peach’具有抗蚜性狀，受顯性單基因控制，并將該抗蚜基因命名為。隨后法國農業科學院（INRA）對抗蚜資源‘Rubira?’進行抗性遺傳特征及基因定位研究，發現其受顯性單基因控制，并將抗性基因定位在pchgms29與UDAp-467兩標記之間，位于LG1末端Pp01_ 43499521—Pp01_46502361區間內，物理距離約3 Mb[12,31]。PASCAL等[32]研究發現來源于‘Weeping Flower Peach’的抗蚜基因也位于LG1末端，定位區間為物理距離2 880 352 bp（遺傳距離7.2 cM），并認為與位于染色體的同一位點。本研究以來源于中國的重要抗性資源‘粉壽星’為材料，將抗蚜基因定位至Pp01，物理距離僅460 kb的區間內（遺傳距離約3.5 cM），但來源于‘粉壽星’的抗蚜基因與與是否位于Pp01的同一位點二者是否存在不同的變異形式以及來源是否相同，還需進一步研究。另外，雖然將精細定位區間縮小至460 Kb（包含52個候選基因），但控制抗蚜性狀的候選基因還不能確定，仍需進一步研究。

GY表示感蚜，KY表示抗蚜；黃色表示基因型為Rr；綠色表示基因型為rr；紅色表示重組單株

圖4 基于HRM抗蚜C/T（藍色曲線）和感蚜T/T（紅色曲線）位點的SNP鑒定

A：抗蚜基因型G/T；B：感蚜基因型G/G A: Aphid resistant genotype-G/T; B: Aphid susceptibility genotype-G/G

M表示DNA標記500；R表示抗蚜；S表示感蚜；♀：母本；♂：父本

抗蚜性狀鑒定具有多種途徑。其中，傳統的田間觀察是最直觀、簡便的方法，但由于抗蚜表型易受外界環境影響，且蚜蟲的發生具有季節性[22]，表型鑒定耗時長，且需對群體單株逐一調查，需投入大量人力物力[33]。分子標記是一種有效的性狀鑒定方法，本研究基于精細定位區間，開發了與性狀連鎖的InDel標記，缺失大小為2 bp，準確、有效地完成了表型的分子鑒定。

4 結論

本研究基于親本全基因組深度測序與SNP分型相結合的方法，對目標性狀進行基因定位。通過基因定位初步將目標性狀定位在桃基因組Pp01，物理區間約9.22 Mb。在初步定位區域內利用重測序數據開發與抗蚜表型一致的SNP標記，利用基于高分辨率熔解曲線（HRM）結合Sanger測序進一步進行精細定位，將目標基因縮小至Pp01_45665389—Pp01_46120950區域內，物理距離460 kb，包含56個轉錄本，52個候選基因。

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（責任編輯 趙伶俐）

Gene Mapping of Aphid-resistant for Peach Using SNP Markers

Zhang NanNan, Lu ZhenHua, Cui GuoChao, Pan Lei, Zeng WenFang, Niu Liang, Wang ZhiQiang

(Zhengzhou Fruit Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Peach and Grape Improvement Center/ Key Laboratory of Fruit Breeding Technology of Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450009)

The objective of this study is to identify the SNP loci tightly linked to peach((L.) Batsch ) aphid((Sulzer)) resistance traits, revealing its genetic basis and laying a foundation for the marker assistant selection in resistance breeding of peach.In this study, the population used for the mapping study consisted of141 individuals which were obtained from a cross between female parent (‘01-77-3’ ) and male parent (‘CN13’). Referencing the peach genome and using Sanger sequencing, single nucleotide polymorphism (SNP) markers were developed in female and male parents and 8 progenies to obtain markers linked to the target loci which were tested on the whole population. Subsequently, using whole genome re-sequencing data of two parents, SNPs for fine mapping were selected based on the genotype of two parents, andemployed to conduct genotyping to obtain the SNP marker linked to resistance traits. Ultimately, the fine mapping region was validated by using an InDel marker to verify the genotype of F1population generated from ‘96-5-1’ × ‘10-7’.As a result of phenotypeidentification of 141 progenies, the segregation ratio of resistance to aphid to susceptible ones showed 1﹕1 (: 0.556; χ2: 0.348). Using Sanger sequencing we mapped the resistant gene to an approximate 9.92 Mb physical distance between two SNP markers, Pp01_38011783 and Pp01_47231340 on Pp01. For fine mapping, a total of 17.109 Gb clean data was generated from genome re-sequencing and the average coverage depth is 75.19×. 11 of 29 pairs of primers which were designed based on genome re-sequencing data were effective and linked to target trait. As a result of genotyping, we obtained two SNP makers tightly linked to desired trait, SNP_Pp01_45665389 and SNP_Pp01_46120950, with genetic distance of 1.4 cM and 2.1 cM, respectively. The target locus was between these two markers, an approximate physical distance of 460 Kb, and the gene was co-segregating with another marker SNP_Pp01_45712702. With fine gene mapping region, an InDel marker, KYYZ_Pp01_45799758, was designed and used to verify the phenotype of 92 individuals generated from an F1segregation population of ‘96-5-1’ ב10-7’ with 98.91% accuracy.The SNP loci and candidate genes related closely with aphid-resistant gene of peach were identified in this study. The resistant gene had been mapped to an approximate 460 kb physical distance between two SNP markers, SNP_Pp01_45665389 and SNP_Pp01_46120950 at the bottom of Pp01 which contains 56 transcripts (52 candidate genes).

; SNP markers; aphid-resistant; gene mapping

2017-06-02；

2017-09-07

國家自然科學基金（31470679）、中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ASTIP-2016-ZFRI）、河南省科技計劃項目（152102110110）

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