楊梅素潛在作用靶點及機制計算機虛擬篩選研究

何侃亮，李 博，袁秋貞

陜西省中醫醫院藥劑科(西安710003)

楊梅素潛在作用靶點及機制計算機虛擬篩選研究

何侃亮，李 博，袁秋貞△

陜西省中醫醫院藥劑科(西安710003)

目的：探討楊梅素發揮藥理活性的作用靶點及其分子機制。方法：利用Pharmmapper及DRAR-CPI平臺分別預測楊梅素潛在作用靶點，對所得靶蛋白進行文獻挖掘分析；用STRING平臺對預測靶點進行生物信息學分析，獲得靶蛋白的注釋、蛋白互作信息并進行通路富集分析。結果：楊梅素發揮抗癌作用的潛在作用靶點可能為Pim-1、EGFR，此外還與PI3K-Akt及MAPK通路有關。討論：楊梅素可能通過膽堿酯酶和β-分泌酶，以及影響Neurotrophin、ErbB通路發揮改善認知功能及抑郁樣行為的作用。

楊梅素(3，5，7，3'，4'，5'，-六羥基黃酮，Myricetin)又名楊梅樹皮素，是黃酮醇類化合物，常見于茶葉、漿果以及草藥中。近年來隨著研究的深入，人們發現楊梅素具有抗癌、保護神經、抗氧化、抗炎等多種藥理學活性[1]。眾多研究表明，楊梅素對多種腫瘤細胞具有抑制生長、增殖及侵襲的作用，同時具有神經保護、抗炎等作用[2-3]。計算機輔助藥物設計是指利用計算機進行理論計算，以減少采用傳統實驗手段篩選藥物的工作量，提高新藥研發成功的概率，主要包括虛擬篩選和藥效團設計[4]。通常從天然中草藥中分離得到的單體化合物可能具有藥理學作用，但是需要大量細胞及動物實驗加以驗證或排除，費時費力；另一方面，某些已經上市銷售多年的藥物，因為對其分子靶標的認識程度不夠，而沒有認識到它的其他不良反應或者新作用。因此采用計算機虛擬篩選技術對天然產物進行研究十分有必要。為了探討楊梅素的藥理學效應，本研究將基于計算機虛擬篩選的方法，利用Pharmmapper和DRAR-CPI平臺獲得楊梅素可能的作用靶點，采用String平臺對楊梅素的預測靶蛋白之間的相互作用進行分析，報告如下。

材料與方法

1 楊梅素分子結構的構建和準備 在SybylX2.0軟件中構建楊梅素分子(圖1A)，并對其進行預處理，對分子構象加載Gasteiger-Huckel電荷，采用Tirpos力場Minimize程序進行能量最小化，以最大次數1000，0.001kcal/mol作為收斂標準的Powel能量梯度法進行優化，得到穩定構象。

2 楊梅素潛在靶點預測 將楊梅素分子的mol2格式文件提交到Pharm mapper數據庫，選擇人類蛋白靶標數據庫進行分析。Pharm mapper將對配體小分子和數據庫中的藥效團自動匹配，按照匹配分值 (fitscore)的大小輸出分析結果。將楊梅素分子的mol2格式文件提交到服務器，平臺運算后下載計算結果進行分析。服務器建議選取藥物分子與蛋白質相互作用(chemical-protein)的Z-score<-0.5納入為潛在靶點。

3 潛在作用靶點的生物過程和代謝通路分析 將篩選所得楊梅素靶點導入STRING平臺，經平臺進行分析獲得蛋白質-蛋白質之間的相互作用，以及蛋白質的生物功能注釋。通過提供PubMed相關信息摘要以及鏈接NCBI等其他數據庫對蛋白靶點網絡進行分析，如根據染色體臨近、基因融合、基因共表達等多方面對結果進行綜合評分，并根據分數高低對相關蛋白進行排序。同時，應用STRING進行靶蛋白的GO分析及KEGG信號通路富集分析。

結 果

1 基于Pharmapper的靶點預測 利用Pharm mapper對其數據庫的7000余靶蛋白進行運算，結果按照Fit Score從大到小進行排序。得分排名前30的疾病相關蛋白靶點信息(圖1)。配體與各靶蛋白的藥效團匹配情況(圖2)。

圖1 構建楊梅素分子及排名前30的疾病相關蛋白靶點信息

圖2 楊梅素與靶蛋白藥效團疊合圖

2 基于DRAR-CPI的靶點預測 DRAR-CPI結果中，依據Chemical-protein打分值共有98個蛋白靶點。楊梅素可能的作用靶點中，涉及細胞過程、代謝過程、免疫系統的靶點較多，如MAPK、TNK2、CDK2、PPAR等，我們進一步針對楊梅素與這幾個蛋白的關系進行探討，DRAR-CPI平臺提供了楊梅素分子與靶蛋白的分子對接結果(圖3)。結果顯示，楊梅素與MAPK1的Docking Score為-43.8814，Z-Score為-1.80118，表明楊梅素與MAPK1可能有較好的結合；楊梅素與TNK2的Docking Score為-40.3406，Z-Score為-2.15523。相比MAPK1，TNK2的Docking Score值略高，但Z-Score值略低，但均處于小于平臺推薦的-0.5范圍內，且對接結果顯示均有較好的結合。楊梅素與CDK2的Docking Score為-40.4291，Z-Score為-1.42111，同樣存在較穩定的相互作用。以上結果表明，MAPK1、TNK2、CDK2可能是楊梅素發揮抗腫瘤活性的潛在重要作用靶點。

圖3 楊梅素與靶蛋白的分子對接情況

3 潛在作用靶蛋白網絡的構建及分析 我們使用STRING平臺構建了楊梅素靶蛋白相互作用的網絡圖，如圖4。圖中共產生76個節點和229個邊，每個節點代表一個預測的靶蛋白，線的顏色代表每種來自不同類型的證據，提示楊梅素潛在作用靶點間通過多條相互作用通路進行調節。從圖中可以看出，MAPK1、EGFR、SRC、AKT1、PRKACA、SYK、NR3C1、GSK3B、PAK、PPAR等位于關鍵的節點位置，在蛋白互作網絡中有著十分重要的地位，提示楊梅素可能通過這些蛋白發揮其藥理學活性。

圖4 DRAR-CPI預測所得靶蛋白的互作網絡

4 靶點代謝通路分析 為楊梅素預測靶點的KEGG通路富集分析。部分通路情況如下：9個靶點蛋白參與ErbB信號通路(KEGG ID: 04012),12個靶點蛋白參與MAPK信號通路(KEGG ID: 04010)，8個靶點蛋白參與Neurotrophin信號通路(KEGG ID: 04722)，10個靶點蛋白參與癌癥相關通路(KEGG ID: 05200)，15個靶點蛋白參與NF-κB信號通路(KEGG ID: 04064)，9個靶點蛋白參與PI3K-Akt信號通路(KEGG ID: 04151)。

討 論

中國知網、Pubmed及Web of Science數據庫中研究楊梅素的藥理學活性，并與虛擬篩選平臺所預測的靶點進行分析，結果顯示Pharmmapper中得分最高的Pim-1(Z-score=1.05447)是基因Pim家族中的一員，調控細胞凋亡、分化、增殖進而參與腫瘤形成過程[5]。目前大量證據表明，楊梅素可劑量依賴性的抑制腫瘤細胞的生長、增殖與轉移、促進腫瘤細胞凋亡等途徑，發揮抗腫瘤作用。EGFR(Z-score=0.664508)是EGFR酪氨酸激酶家族的成員之一，其與配體結合導致構象變化，引發自身磷酸化，轉導下游信號，進而調節細胞的增殖、凋亡等過程[6]。EGFR在腫瘤細胞中過度激活狀態，使細胞周期失去調控，導致腫瘤細胞無限制生長。目前EGFR抑制劑已成為臨床腫瘤病人治療的重要藥物，如酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼和厄洛替尼。預測結果提示，楊梅素可能通過調控Pim-1、EGFR進而發揮抗腫瘤作用，而這一機制仍需進一步利用動物和細胞水平實驗進行驗證。

膽堿酯酶(Z-score=0.645846)作為治療阿爾茨海默癥的重要靶點，被認為可影響乙酰膽堿的合成、釋放及攝取進從而導致記憶力衰退。基于這一理論，多奈哌齊、石杉堿甲等乙酰膽堿酶抑制劑已被研制成功并成為目前主要的臨床治療藥物。β-分泌酶(Z-score=0.460382)是一種Ⅰ型跨膜蛋白，通過在腦內切割β淀粉樣蛋白前體蛋白形成β淀粉樣蛋白，參與阿爾茨海默癥的發生發展[7]。已有證據表明，楊梅素在大鼠中可以發揮神經保護的作用，但其涉及的分子機制有待進一步闡明。結合預測結果，我們可以認為楊梅素可能通過調控膽堿酯酶以及β-分泌酶的活性，影響下游的乙酰膽堿和β淀粉樣蛋白，從而發揮保護神經的作用。

研究表明神經系統疾病的發病機制與Neurotrophin信號通路、ErbB信號通路密切相關[8]。其中ErbB通路的平衡對中樞神經系統的發育至關重要，ErbB4突變小鼠表現出與精神分裂癥小鼠模型相同的行為學改變[9]。Ma等報道，給予楊梅素可以改善慢性應激后小鼠小鼠抑郁樣行為，上調海馬組織中腦源性神經營養因子(BDNF)表達水平[10]；Wang等最新研究同樣表明，注射楊梅素可以改善慢性應激后小鼠的認知障礙，緩解學習能力的下降，升高海馬組織BDNF蛋白表達量。BDNF為Neurotrophin信號通路中重要的上游因子，動物水平實驗結果與我們虛擬篩選結果是一致的，表明楊梅素可以通過調控Neurotrophin信號通路發揮其保護神經作用。 但楊梅素與ErbB通路的研究目前尚無相關報道，這一機制有待進一步闡明。

大量研究表明，楊梅素可通過抑制腫瘤細胞的生長、增殖等途徑發揮抗腫瘤作用。PI3K/AKT通路在腫瘤的發生、發展過程中發揮著重要作用，研究證實該通路的過度表達和活化能夠引起腫瘤細胞增殖、凋亡及侵襲的異常。Yang等[3]最新研究表明，楊梅素可通過PI3K/AKT通路與MAPK通路，抑制人胎盤絨膜癌細胞侵襲遷移，并促進細胞凋亡。Phillips等研究發現，楊梅素可抑制Akt磷酸化，影響PI3K信號通路，從而抑制胰腺癌細胞的生長。本研究中通路分析預測，楊梅素的潛在靶點中9個參與PI3K-Akt通路。以上結果提示，楊梅素可以通過調控PI3K-Akt通路影響腫瘤細胞發揮抗腫瘤作用。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK信號轉導途徑參與了細胞的生長、發育、分裂死亡以及細胞間多種生化反應信號的識別傳遞過程。本研究中分子對接結果提示，楊梅素與MAPK1有較好的結合；靶點通路富集分析顯示，楊梅素潛在作用靶點中有12個參與MAPK通路。 Kang等人報道，在鼠肺纖維細胞中，楊梅素可以通過調節MAPK通路發揮抗氧化作用，進而發揮保護細胞的作用。Fu等人研究發現，楊梅素也可以通過抑制MAPK通路的活化，從而降低鼠樹突細胞的活化水平。結合本研究預測結果及文獻報道可推測，楊梅素通過抑制MAPK通路中ERK、JNK及p38的活化發揮抗癌作用。

綜上所述，我們利用不同的計算機虛擬篩選平臺對楊梅素可能的作用靶點進行了分析，所得篩選結果與文獻報道中針對楊梅素的分子機制研究一致，但仍有較多潛在作用靶點并未被動物或細胞水平實驗所研究。楊梅素發揮神經保護作用的機制，可能與其對膽堿酯酶、β-分泌酶以及Neurotrophin、ErbB信號通路的調控有關；而其抗癌作用機制與重要潛在作用靶點Pim-1、EGFR有關，此外還可能通過調控PI3K-Akt、MAPK通路影響癌細胞生長、增殖及侵襲過程。本研究可為楊梅素發揮藥理學活性作用機制的深入研究提供重要的理論依據和線索。

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△ 通訊作者

楊梅素 抗腫瘤藥 計算機模擬 神經保護

R96

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.003

(收稿：2017-08-20)