兩種γ-干擾素釋放試驗方法對結核性胸膜炎診斷價值的探討

漆 沄，謝 君，遲 旭，蔡華鋒，李衛星 , 劉 媛,羅阿麗

1.西安市胸科醫院內3科(西安 710100),2.西安市胸科醫院檢驗科(西安 710100),3.西安市胸科醫院病理科(西安 710100)

兩種γ-干擾素釋放試驗方法對結核性胸膜炎診斷價值的探討

漆 沄1，謝 君1，遲 旭1，蔡華鋒1，李衛星1, 劉 媛2,羅阿麗3

1.西安市胸科醫院內3科(西安 710100),2.西安市胸科醫院檢驗科(西安 710100),3.西安市胸科醫院病理科(西安 710100)

目的：探討酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT)和全血γ-干擾素釋放試驗(QFT-GIT)在結核性胸膜炎診斷中的臨床價值。方法：對90例結核性胸膜炎患者與50例非結核性胸膜炎患者外周血分別用ELISPOT和QFT-GIT兩種γ-干擾素釋放試驗進行檢測，分析兩種檢測方法對結核性胸膜炎的準確性、敏感性、特異性、陽性預測值以及陰性預測值。結果：ELISPOT檢測和QFT-GIT檢測的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值比較均無統計學差異(P>0.05)，而ELISPOT檢測的準確性明顯大于QFT-GIT檢測，比較有顯著性差異(P<0.05)。結論：ELISPOT和QFT-GIT兩種γ-干擾素釋放試驗用于結核性胸膜炎均有較好的診斷結果，但ELISPOT的準確性更高，且成本低。

全血γ-干擾素釋放試驗(QFT-GIT)和T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)是γ-干擾素釋放試驗(IGRA)中檢驗結核菌的發熱兩種較成熟方法，但國內對QFT-GIT與ELISPOT間的診斷結果研究很少，我院應用QFT-GIT和酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT)分別檢測結核性胸膜炎與非結核性胸膜炎患者血中γ-干擾素的表達，以評價這兩種方法在結核性胸膜炎診斷中的臨床價值。

資料與方法

1 一般資料 結核組患者選自我院2016年1月1日至2017年5月1日入我院治療的結核性胸膜炎90例患者，排除其他因素造成的胸腔積液，經胸腔鏡活檢、胸膜針刺活檢、胸膜組織病理學檢查確診為結核病變，且接受抗結核治療<2周。其中男51例，女39例；平均年齡(39.9±7.1)歲。非結核組患者選自同期我院呼吸及腫瘤內科治的非結核性胸膜炎患者50例，經檢查PPD結果為陰性，其中腫瘤性胸腔積液36例，肺炎旁積液10例，原發胸膜惡性病變4 例。腫瘤病理均經過病理細胞學證實，其他疾病經常規檢驗、影像學及療效等證實；其中男28例，女22例；平均(42.1±11.6)歲；排除存在結核病及結核接觸史患者。兩組一般情怳無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

2 方 法

2.1 ELISPOT檢測：無菌方法下采集患者靜脈血，室溫下即刻離心，分離外周血單個核細胞，將分離出細胞重懸于細胞培養基AIM-V中并調整濃度為2.5×106個/ml的細胞懸液。操作嚴格按照T細胞ELISPOT診斷試劑盒(南通表源生物技術有限公司)說明書執行，即：每一細胞懸液樣本取PVDF板3孔，每孔注入100 μl，陰性對照內加入無血清細胞培養液50 ml，陽性對照內加入植物血凝素(PHA)50 ml，檢測孔加入ESAT-6/CFP-10特異性抗原融合蛋白50 ml,輕輕震蕩、混勻，在37C 5%CO2培育箱中孵育16～20 h。進行孵育、清洗、加生物素標記抗體IFN-γ-biotion反應、避光顯色等步驟，直至肉眼可見斑點形成后洗板以終止反應，于通風處自然晾干，孔內紫色斑點用肉眼或酶聯斑點分析儀計數。結果判定：①陰性對照孔紫色斑點為0-5個，檢測孔斑點數-陰性對照孔斑點數≥5個時，則結果為陽性；②陰性對照孔紫色斑點≥6個，檢測孔斑點數≥2倍的陰性對照孔斑點數時，則結果為陽性。

2.2 QFT-GIT檢測：采用QFT-GIT試劑盒(Cellestis公司)檢測。QFT-GIT試劑盒提供陰性對照管(陰性管)、陽性對照管(陽性管)、結核抗原管(抗原管)3種采血管，操作步驟按說明書進行，即：靜脈采血，在6 h內將肝素抗凝血加入以上3種管中，1 ml/管，振搖、混勻，豎直置于37C培養箱中培育24 h，離心后取上清液，用ELISA檢測并用Multiskan GO酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司)定量分析IFN-γ水平。結果判定：①陰性：當陽性管>0.5 IU/ml,抗原管-陰性管<0.35 IU/ml時，②陽性：當抗原管-陰性管≥0.35 IU/ml時；③不定：當陽性管<0.35 IU/ml, 抗原管-陰性管<0.35 IU/ml或陰性管≥8.0 IU/ml時。分析ELISPOT檢測和QFT-GIT檢測的準確性、敏感性、特異性、陽性預測值及陰性預測值。

結 果

ELISPOT檢測和QFT-GIT檢測的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值比較均無統計學差異(P>0.05)，而兩組在準確性方面具有顯著性差異(P<0.05)，提示結核性胸膜炎診斷輔以ELISPOT檢測具有更高的臨床價值，見表1。

表1 兩組患者分別應用ELISPOT檢測和QFT-GIT檢測診斷結果比較

注：與ELISPOT組比，*P=0.019，?P=0.681，▲P=0.134，☆P=0.188，eP=0.505.

討 論

結核性胸膜炎是淋巴細胞介導的免疫疾病，感染者機體自身對結核菌有一定的抗性，有多種免疫細胞參與在機體免疫過程中，并能產生多種淋巴因子，如IL-2、γ-干擾素等[1]。γ-干擾素可促進前體T細胞分化為Th1細胞，提高Th1細胞的免疫應答能力分泌多種細胞因子，并能活化機體單核細胞使其集聚至病灶，以防止感染的發展、散播，促進肉芽腫的形成[2]。IGRA是近年來結核病診斷方面的一項重要突破，采用結核 菌抗原刺激PBMC產生效應T細胞或病變部位免疫細胞分泌γ-干擾素，以評判是否有結核菌感染。T-SPOT.TB采用結核菌復合群差異區基因RDI(Rv3871-Rv3879c)中編碼的早期分泌的抗原靶(ESAT-6)和培養濾液蛋白(CFP-10)的多肽抗原，此外，QFT-GIT在以上基礎上還加用了RD11區TB7.7(Rv2654)的部分多肽，這些多肽抗原僅存于結核菌復合群中，特異性極高，但其合成成本高，限制了其在發展中國家及結核病流行國家中的應用、推廣[3]。ELISPOT應用的ESAT-6/CFP-10融合蛋白是通過基因工程合成而來，可大量生產，相對于多肽有明顯的價格優勢，且與T-SPOT.TB的檢驗結果一致[4]，有好的檢驗效果。

本文結果顯示：兩種檢驗方法的敏感性、特異性、陽性預測值和陰性預測值比較均無統計學差異，而兩組在準確性方面具有顯著性差異。此結果可能與兩者的檢測原理有關，ELISPOT檢測的是經抗原刺激后可分泌γ-干擾素的效應T細胞，而QFT-GIT檢測的是效應T細胞分泌的γ-干擾素水平，但致病菌誘導的機體免疫應答存在時效性，其產生的細胞因子也存在時效性，因此ELISPOT輔助診斷具有更好的優勢。無法尋找到細菌學依據已成為結核菌感染診斷的難題，而杜鳳嬌[5]等報道指出，機體只要有結核菌感染，就可通過測定機體細胞免疫功能評判結核菌的感染情況，避免了結核菌素皮膚試驗(TST)因PPD與卡介苗交叉蛋白而造成的假陽性檢出。此外，本研究ELISPOT采用ESAT-6/CFP-10融合蛋白大大降低了臨床診斷費用，使結核菌感染的ELISPOT檢測在我國基層醫院普及成為可能。但IGRA也存在一定的缺陷，不能區分患者結核病是近期還是有既往感染史、活動性還是潛伏性，當檢出為陰性時不能排除感染，又或是結核菌受機體免疫限制，但依然有可能發展成活動性結核病，因而IGRA常作為輔助檢測用于臨床診斷。

綜上，ELISPOT和QFT-GIT用于結核性胸膜炎均有較好的診斷結果，但ELISPOT的準確性更高，且成本低，更適合臨床推廣。

[1] 劉紅艷，張 燕. 瀉肺逐飲方治療結核性胸膜炎療效觀察[J]. 陜西中醫，2014,35(10)：1286-1287.

[2] 王 君，李季春，陳瑞琳，等.內科胸腔鏡檢查在結核性胸膜炎診斷中的應用價值[J]. 陜西醫學雜志，2014,43(7)：858-859.

[3] 張 娟，印 璞，孫炳奇，等. 對比研究ELISPOT與QFT-GIT對于結核病診斷的應用價值[J]. 中國試驗診斷學，2013,17(10)：1839-1842.

[4] 王曉偉，程筱雯，張 焰，等. 結核分枝桿菌CFP10、ESAT6蛋白的原核表達、純化及ELISPOT檢驗方法的建立與應用[J]. 安徽醫科大學學報，2015,50(9)：1347-1350.

[5] 杜鳳嬌，傅 瑜，吳雪瓊，等. 結核分枝桿菌RD1區編碼蛋白ELISPOT輔助診斷活動性結核病的應用價值[J]. 臨床肺科雜志，2012,17(2)：264-266.

胸膜炎/診斷 @QFT-GIT @IGRA

R561.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.075

(收稿：2017-07-16)