慢病毒介導的靶向干擾MEX3A基因膀胱癌穩定細胞株的建立

房超，尹晶，于秋爽，陳云云，黃瑛

（中國醫科大學附屬盛京醫院超聲科，沈陽 110004）

· 論著 ·

慢病毒介導的靶向干擾MEX3A基因膀胱癌穩定細胞株的建立

房超，尹晶，于秋爽，陳云云，黃瑛

（中國醫科大學附屬盛京醫院超聲科，沈陽 110004）

目的構建針對MEX3A基因的shRNA慢病毒載體，建立穩定干擾MEX3A基因表達的膀胱癌細胞株。方法采用實時PCR檢測膀胱癌細胞株中MEX3A基因的表達；應用GV115質粒構建重組靶向MEX3A基因的shRNA慢病毒載體，鑒定及測序合格后，與包裝載體共轉染293T細胞產生慢病毒顆粒，病毒滴度測定后轉染膀胱癌細胞，經抗生素篩選建立穩定表達siRNA的細胞株，實時PCR檢測敲減效率。結果MEX3A基因在膀胱癌5637和T24細胞中均有表達，且5637的表達量高于T24；鑒定及測序結果顯示成功構建MEX3A-shRNA慢病毒載體，包裝后病毒滴度較高，實時PCR結果表明慢病毒轉染5637細胞后能穩定抑制MEX3A基因的表達。結論應用慢病毒介導的RNA干擾技術可成功建立穩定抑制MEX3A基因表達的細胞株。

MEX3A基因； 膀胱癌； 慢病毒； 細胞株

膀胱癌的發病率和死亡率均占泌尿系統腫瘤的首位，是十大常見腫瘤之一。2009年，我國腫瘤登記地區膀胱癌發病率為6.61/10萬，其中男性發病率為9.78/10萬，約為女性發病率的3倍［1］。膀胱癌具有治愈率低、復發率高、耐藥性強、易轉移的特點，患者的5年生存率僅為50%［2］。據文獻［3］報道，低中級別膀胱癌患者術后1年復發率為20%～40%，高級別尿路上皮癌術后復發率可高達90%。膀胱癌的治療方法主要有根治性膀胱切除、放射治療、化療、膀胱灌注等，但治療效果和預后不甚理想［4］。

MEX3A基因是4種人類同源MEX3基因之一［5］，編碼的蛋白參與RNA的代謝調節［6］。研究［5］顯示，MEX3A蛋白與MEX3B是新發現的P小體的組成部分。P小體又稱細胞質處理小體，是mRNA轉錄后調控過程中的一個重要場所，在基因表達過程中起至關重要的調控作用，主要參與mRNA降解、翻譯抑制、mRNA監視以及RNA介導基因沉默等重要的生命活動過程［7-8］。研究［9］發現，MEX3蛋白中的環指結構域是泛素E3連接酶的特征結構域，推測MEX3蛋白可能通過泛素化作用參與了mRNA的降解。有文獻［10］報道MEX3A基因與胃癌細胞的增殖、凋亡及轉移有密切聯系，癌組織中該基因的表達量遠高于正常組織。目前，膀胱癌的具體發病機制尚未明確，因此，尋找一種新的相關靶基因將為膀胱癌的診斷、靶向藥物治療、預后評估提供新的思路。

本研究擬以MEX3A基因為模板，設計RNA干擾靶點序列，構建目的基因RNA干擾慢病毒載體，包裝完成后轉染膀胱癌細胞，旨在建立能夠穩定干擾MEX3A基因表達的細胞株。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌細胞株5637、T24（中國科學院上海生物所細胞庫）；慢病毒載體及包裝系統（GV115載體、pHelper1.0載體、pHelper2.0載體）、293T細胞、感染增強液（ENi.S.）、polybrene、含無義shRNA序列及GFP標記的對照慢病毒（上海吉凱基因技術有限公司）；TOP10大腸桿菌感受態細胞、質粒提取試劑盒（EndoFree Maxi Plasmid Kit）、DNA凝膠回收試劑盒（TIANgel Midi Purification Kit） （北京TIANGEN公 司）；Age I、 EcoRⅠ、CutSmart Buffer9（美 國NEB公司）；T4 DNA Ligase （美國Fermentas公司）；Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）；RPMI-1640培養基、胎牛血清（美國GIBCO公司）；氨芐青霉素 （上海Genebase公司）；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、SYBR Real-time PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。

實時熒光定量PCR儀（lightcycler 480，瑞士羅氏公司）；熒光顯微鏡N-STORM（日本尼康公司）；數顯式穩壓電泳儀、 凝膠成像儀（上海天能公司）；分光光度計Nanodrop 2000（美國Thermo Scientific公司）。

MEX3A及GAPDH上下游引物由上海生工生物公司設計并合成，dsDNA oligo、鑒定引物（R&F）由捷瑞公司提供，DNA測序委托美季公司完成。

1.2 MEX3A-shRNA慢病毒載體的構建

1.2.1 RNA干擾靶點設計：根據RNA干擾序列設計原則，以GenBank中的MEX3A基因序列為模板，設計多個19～21nt RNA干擾靶點序列。經設計軟件評估測定后，選取合適序列作為干擾靶點，靶點序列為GCAAGGCTGCAAGATTAAG。

1.2.2 DNA oligo序列合成與制備：根據已選靶點序列設計shRNA干擾序列，并在兩端添加合適的限制性內切酶酶切位點。除此之外，在正義鏈3’端添加TTTTT終止信號，而反義鏈5’端添加終止信號互補序列（表1）。設計完成后，送捷瑞公司合成單鏈DNA oligo。將合成的單鏈DNA oligo干粉溶解于退火緩沖液中（終濃度20 μ mol/L），90 ℃水浴15 min。自然冷卻至室溫后，形成帶黏性末端的雙鏈。

1.2.3 線性化載體制備：按照NEB說明書配制50 μ L反應體系，使用AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切GV115載體使其線性化。37 ℃（最適溫度）反應1 h后，切膠回收目的片段。

表1 shRNA干擾序列Tab.1 The shRNA interference sequence

1.2.4 dsDNA oligo與線性化載體連接：按照Fermentas T4 DNA Ligase說明書配制20 μ L反應體系，將雙鏈DNA oligo與線性化的載體相連。于16 ℃反應1～3 h，之后行轉化實驗。

1.2.5 連接產物轉化：將10 μ L連接產物加至100 μ L大腸桿菌感受態細胞中，冰浴30 min，42 ℃熱激90 s，冰浴2 min；加入無抗生素的LB液體培養基，于37℃震蕩培養1 h；取菌液均勻涂抹在含有氨芐青霉素的LB固體培養基上，于37 ℃培養箱中過夜培養。

1.2.6 陽性克隆的PCR鑒定與測序：配制20 μ L PCR反應體系，用無菌槍頭挑取單個菌落為模板，進行PCR擴增，反應條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 30 s，循環22次；72 ℃ 5 min。鑒定引物-F序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATAPCR-3’，鑒定引物-R序列 ： 5’-GTAATACGGTTATCCACGC G-3’。結束后，取5 μ L產物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。以鑒定引物-F進行陽性克隆測序，挑選測序結果與目標序列完全一致的克隆用于下一步實驗。

1.2.7 質粒提取：將測序正確的菌液轉接于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃搖床震蕩培養過夜。按照EndoFree Maxi Plasmid Kit說明書提取質粒，取樣電泳，用分光光度計測定質粒濃度，將合格的質粒進行病毒包裝。

1.3 慢病毒載體的包裝及滴度測定

將提取的GV115質粒與pHelper1.0質粒、pHelper2.0質粒用脂質體瞬時轉染包裝細胞293T，于24 h和48 h收集病毒上清，觀察細胞形態和GFP表達，將提取的病毒純化和濃縮，采用梯度稀釋法測定病毒滴度，將制備完成的病毒濃縮液分裝于-80 ℃保存。

1.4 MEX3A基因在5637和T24細胞株中的表達

5637細胞和T24細胞均用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基于37 ℃、5%CO2條件下培養。將2種細胞分別接種于6孔板中（2×105/孔）培養，1 d后收集細胞。提取總RNA，反轉錄獲得cDNA，行實時PCR。MEX3A引物序列：5’-CGGAGTGGACTCTGG CTTTGAG-3’（上游引物），5’-CAGAGGAGAAGAGCA CGGAGGT-3’（下游引物）。以GAPDH基因為內參，PCR 引物序列 ： 5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’（上游引物） ， 5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’（下游引物）。PCR 反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環；65 ℃ 15 s。實時PCR采用Δ ΔCt法進行相對定量分析。選取目的基因表達量較高者進行慢病毒轉染實驗。

1.5 慢病毒轉染及穩定表達MEX3A-shRNA的細胞株篩選

感染前1 d將細胞接種于6孔板中（2×105細胞/孔），培養24 h后加入病毒稀釋液：實驗組（shMEX3A組）加入含MEX3A-shRNA慢病毒的病毒稀釋液，6.68 μ L/孔，病毒滴度為3×108TU/mL（ 預實驗確定最佳感染復數為10）；對照組（shCtrl組）加入含陰性對照慢病毒的病毒稀釋液（5.00 μ L/孔），病毒滴度為4×108TU/mL。培養12 h后更換培養基，繼續培養72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達情況。當轉染效率≥70%時，加入含氨芐青霉素（2 μ g/mL）的培養基進行篩選。選用正常癌細胞作為對照，48 h后，可見陽性克隆，繼續氨芐青霉素篩選2周，挑出單細胞克隆擴大培養即可獲得穩定細胞株。

1.6 實時PCR檢測MEX3A基因敲減效率

收集轉染慢病毒的實驗組和對照組細胞，按照1.4中的步驟進行操作。實時PCR采用Δ ΔCt法進行相對定量分析。

1.7 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，采用t檢驗比較2組間差異，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。同一實驗重復3次以上，取其平均值。

2 結果

2.1 MEX3A-shRNA慢病毒載體的鑒定及測序

dsDNA oligo與線性化載體連接后進行PCR擴增，擴增結束后凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示，連接入shRNA片段的陽性克隆PCR片段大小為341 bp，未連接入shRNA片段的空載體克隆PCR片段大小為307 bp，與預期值相符。鑒定完成后，送交上海美季公司以鑒定引物-F進行陽性克隆測序，測序結果表明重組的慢病毒載體與參考序列相一致，說明合成的MEX3A-shRNA核苷酸序列插入正確，慢病毒載體構建成功。

圖 1 重組MEX3A-shRNA慢病毒載體PCR電泳圖Fig.1 Electrophoresis of the PCR products obtained from the recombinant lentiviral vector MEX3A-shRNA

2.2 慢病毒載體的包裝及滴度測定

將慢病毒載體包裝系統的3個質粒共轉染293T細胞24 h后，顯微鏡下可見細胞生長良好，形態規則，細胞碎片少，繼續培養72 h后熒光視野下細胞內有明顯的綠色熒光，說明綠色熒光蛋白表達正常。將收集的病毒液純化濃縮后，用梯度稀釋法測定病毒滴度為2×109TU/mL，病毒包裝成功。

2.3 MEX3A基因在膀胱癌細胞的表達

實時PCR檢測顯示MEX3A基因在人膀胱癌5637細胞株和T24細胞株中均有表達，且5637細胞的表達量高于T24細胞（圖2），因此，選擇5637細胞進行慢病毒轉染和篩選。

圖 2 MEX3A基因在膀胱癌細胞的表達Fig.2 Expression of MEX3A gene in bladder cancer cells

2.4 慢病毒轉染5637細胞株及MEX3A基因的敲減效率

慢病毒轉染5637細胞3 d后，熒光顯微鏡下觀察發現細胞內可見明顯的綠色熒光，熒光強度良好、均勻一致，與白光圖譜對比顯示，慢病毒的轉染效率≥70%（圖3）。實時PCR結果顯示，與轉染空載慢病毒的對照組（shCtrl）相比，實驗組（shMEX3A）5637細胞中MEX3A mRNA的表達水平受到抑制，敲減效率達74%（圖4）。

3 討論

MEX3蛋白最早于1996年在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans）中被發現，該線蟲中只含有1種MEX3同源蛋白，MEX3基因的突變會導致胚胎的前后不對稱，從而使其死于囊胚期［11］。人類MEX3蛋白是一類在進化中高度保守的RNA結合蛋白，與秀麗隱桿線蟲中的MEX3蛋白高度相似，但這4種蛋白在組織中分布并不一致，hMEX3D蛋白在全身的表達較為均一，而另外3種蛋白在不同組織的表達水平不同。4種MEX3蛋白都主要集中在細胞質內，并能通過CRM1通道在胞質與胞核之間穿梭［5］。有文獻［12］報道hMEX3A和3B蛋白是2種新發現的P小體的組成部分，P小體是儲存和降解mRNA的場所，聚集了大量無法進行翻譯的mRNA鏈，而MEX3A和3B蛋白在P小體集中并能與hDcpla脫帽因子相互作用，由此可見MEX3同源基因參與了某些mRNA的調節。除此之外，MEX3A和3B蛋白也與Ago蛋白存在聯系，Ago1和Ago2是RNA誘導沉默復合體的關鍵成分，這類蛋白已被證實參與了癌癥的發生發展。然而，到目前為止MEX3蛋白在癌癥中的作用仍然未知。

圖 3 慢病毒轉染后熒光圖 ×100Fig.3 Fluorescence observed after lentiviral transfection ×100

圖 4 實時PCR檢測MEX3A基因mRNA的表達量Fig.4 Detection of MEX3A mRNA expression by real-time PCR

有研究者［10］通過RNAi技術沉默胃癌細胞的hMEX3A基因，發現癌細胞增殖明顯受到抑制，且抑制作用主要出現于細胞分裂的G1/M期。同時，還發現hMEX3A基因沉默后，胃癌細胞在軟瓊脂的集落形成能力明顯降低，提示hMEX3A基因參與了細胞轉化。此外transwell chamber和wound healing assays檢測顯示，hMEX3A基因敲除顯著影響了癌細胞的轉移能力，臨床相關分析顯示癌組織的hMEX3A基因表達量顯著高于正常組織，這些都表明MEX3A基因可能參與了癌癥的發展與轉化。尾型同源盒轉錄因子CDX2在腸細胞的正常發育以及癌化方面起至關重要的作用，但其調節機制非常復雜，PEREIRA等［13］研究發現MEX3A基因抑制了CDX2的表達，并由此介導了腸細胞的分化，說明該基因可能參與了癌癥的轉化。此外，KREPISCHI等［14］通過微陣列比較基因組雜交技術（Array-CGH）發現，MEX3A基因在腎母細胞瘤中呈過表達，提示MEX3A基因同樣與泌尿系統腫瘤存在關聯。

RNA干擾（RNAi）技術是近幾年發展起來的一種基因阻斷技術，其本質是由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的同源mRNA高效特異性降解，目前公認的作用機制為生物體內的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA（約21～23 bp），即siRNA。siRNA在細胞內解鏈成正義鏈和反義鏈，反義siRNA再與體內一些酶結合形成RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）。RISC與外源性基因表達的mRNA同源區進行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發宿主細胞針對這些mRNA的降解反應［15］。本研究采用慢病毒載體進行RNA干擾，相對于其它載體，慢病毒具有轉染效率高、安全性高、可感染非分裂期細胞的特點，但其最主要的優勢在于能夠將目的基因整合到宿主基因組，實現穩定轉染，從而能進一步篩選出所需細胞株［16］。

本研究應用GV115質粒成功構建了針對MEX3A基因的shRNA慢病毒表達載體，PCR鑒定及測序結果均顯示目的基因正確插入至質粒載體中，經包裝后產生了較高滴度的病毒懸液。此外，還驗證了MEX3A基因在膀胱癌細胞的表達，同時發現目的基因在5637細胞和T24細胞的表達量有較大差異，但造成這種差異的分子機制及其影響還有待進一步研究。本研究選取MEX3A基因表達量較高的5637細胞株進行慢病毒感染，熒光顯微鏡下可見轉染效率較高，實時PCR結果也顯示MEX3A的表達受到顯著抑制，經抗生素篩選及培養后，獲得了能穩定干擾MEX3A基因表達的細胞株，為進一步研究MEX3A基因對腫瘤細胞的影響及其作用機制奠定了實驗基礎。

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Establishment of a Bladder Cancer Cell Line with Stable Knockdown of MEX3A Gene via Lentiviral-mediated Interference

FANG Chao，YIN Jing，YU Qiushuang，CHEN Yunyun，HUANG Ying
（Department of Ultrasound，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo construct an shRNA lentiviral vector targeting the MEX3A gene and establish a bladder cancer cell line with stable MEX3A gene knockdown.MethodsReal-time PCR was performed to detect the MEX3A gene expression. The recombinant lentiviral vector targeting the MEX3A gene was constructed using the GV115 plasmid. After identification and sequencing，the vectors were co-transfected with the packaging vector into 293T cells to produce lentiviral particles，which were then transduced into bladder cancer cells after viral titer determination. The cell line stably expressing the siRNA was established by antibiotic selection，and real-time PCR was carried out to detect the efficiency of the knockdown.ResultsBoth bladder cancer cell lines，5637 and T24，expressed the MEX3A gene，and its expression was higher in 5637 than in T24. The identification and sequencing results showed that the MEX3A-shRNA lentiviral vector was successfully constructed，and the virus titer was observed to be higher after packaging. The results of the real-time PCR showed that MEX3A gene expression was stably inhibited in 5637 cells after lentiviral transduction.ConclusionLentivirus-mediated RNAi technology could successfully establish a cell line with stable MEX3A gene knockdown.

MEX3A gene； bladder cancer； lentivirus； cell line

R737.14

B

0258-4646（2017）12-1057-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1758.002.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.001

國家自然科學基金（81371552）

房超（1990-），男，碩士研究生.

黃瑛，E-mail：huangying712@163.com

2017-02-23

網絡出版時間：2017-11-30 17:58

（編輯 王又冬）