金屬蛋白酶7及金屬蛋白酶19在膽道閉鎖幼鼠動物模型肝臟組織中的表達

劉亭睜，張志波

（中國醫科大學附屬盛京醫院小兒外科，沈陽 110004）

金屬蛋白酶7及金屬蛋白酶19在膽道閉鎖幼鼠動物模型肝臟組織中的表達

劉亭睜，張志波

（中國醫科大學附屬盛京醫院小兒外科，沈陽 110004）

目的檢測金屬蛋白酶家族中金屬蛋白酶7 （MMP-7）和金屬蛋白酶19 （ MMP-19）在幼鼠膽道閉鎖動物模型中的表達情況，探討其在膽道閉鎖肝纖維化中的作用及機制。方法選取出生3 d 的Wistar幼鼠132只作為實驗組，采用肝外膽管結扎的方法制作膽道閉鎖動物模型，62只幼鼠作為對照組，僅行開腹探查術。于術后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d取肝臟組織，應用免疫組化、Western blotting及實時PCR等方法分別檢測MMP-7及MMP-19在2組肝臟組織中的分布和表達情況。結果實驗組幼鼠在術后24 h即表現出梗阻性黃疸的臨床癥狀；HE染色及Masson染色均發現肝臟組織纖維化逐漸加重；免疫組化、Western blotting、實時PCR等均發現實驗組MMP-7的表達明顯高于對照組，且逐漸升高；MMP-19在各時間段表達逐漸增強，但均低于對照組。結論MMP-7和MMP-19在膽道閉鎖肝纖維化中可能發揮重要作用。

金屬蛋白酶7； 金屬蛋白酶19； 膽道閉鎖； 肝纖維化

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是嬰幼兒梗阻性黃疸最常見的原因之一，晚期可致不可逆性肝硬化［1］，不經治療很難生存至1歲。現通過肝門空腸吻合術（Kasai術式）重建膽道，引流膽汁。但即使在Kasai術后成功建立膽汁引流通路，多數患兒肝內膽管損害和肝纖維化仍呈漸進性進展，最終發展成為終末期肝硬化。BA已成為兒童期肝移植最常見的原因［2-3］。影響BA預后的主要原因為難以控制的進行性肝纖維化，其發生原因尚不清楚。

本研究組對BA患者肝臟組織進行基因表達譜芯片研究時發現，基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）家族成員MMP-7和MMP-19表達差異顯著。本研究檢測不同處理時期的膽總管結扎（bile duct ligation，BDL）幼鼠動物模型肝臟組織MMP-7和MMP-19表達水平的變化特點，探討二者在BA肝纖維化中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 BDL動物模型及標本處理

選取出生3 d，體質量9～11 g的Wistar幼鼠132只，采用已有方法制作BDL膽道閉鎖模型［4］，全麻下于劍突左側2 mm作一長約1 cm的縱行切口，暴露膽總管并結扎；對照組62只幼鼠僅行開腹探查。動物實驗經中國醫科大學附屬盛京醫院醫學科學研究與新技術倫理委員會批準，倫理編號為2015PS229K。

于術后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d處死小鼠，左心室灌注生理鹽水至肝臟蒼白，無菌下取肝臟組織2塊（約100 mg），分別置于無菌EP管內，-80℃冰箱保存，用于提取蛋白質及RNA，其余組織浸入4%多聚甲醛內固定，用于組織學染色。

1.2 方法

1.2.1 HE及Masson染色：組織切片厚度4 μ m，常規HE及Masson染色，觀察各組肝臟組織及肝內小膽管結構的改變，行組織纖維化分析。

1.2.2 免疫組化染色：根據試劑盒說明進行免疫組化染色，一抗分別為1∶15兔抗大鼠MMP-7（美國RD公司）及1∶50兔抗大鼠MMP-19抗體（美國ProteintechTM公司）。

1.2.3 Western blotting：組織剪碎、勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。測定蛋白濃度后將各組蛋白濃度調至同一水平，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉緩沖液室溫封閉后，分別加入一抗MMP-7（1∶2 000）或MMP-19（1∶2 000），β-actin為內參照，4 ℃過夜，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶結合的二抗孵育2 h，發光。凝膠圖像處理系統（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標條帶的光密度值。

1.2.4 實時PCR：試劑盒購自日本TaKaRa公司，采用Primer5.0軟件參考GeneBank設計引物，由TaKaRa公司合成。TRIzol 法提取肝臟組織RNA，經紫外分光度法檢測濃度，逆轉錄獲得cDNA，GAPDH作為內參照。PCR反應體系20 μ L，包括cDNA 2 μ L，SYBR Premix Ex Taq（ Tli RNaseH Plus）10.0 μ L，ROX Reference DyeⅡ（50×） 0.4 μ L，上游引物 0.4 μ L，下游引物 0.4 μ L，ddH2O 6.8 μ L 。PCR反應條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。檢測各樣品的Ct值，相對定量每個樣品的ΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因，根據ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組計算2-ΔΔCt。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行獨立樣本的t檢驗，數據以±s表示，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物模型大體表現

術后24 h實驗組皮膚黃染（圖1A），隨后出現毛發油亮（圖1B）、尿黃、白便等梗阻性黃疸的癥狀，且生長發育明顯落后于對照組。

術后3 d解剖肝外膽管，見實驗組肝臟變黃、表面粗糙結節狀、質地變硬，結扎線以上膽管明顯擴張（圖1C），正常對照組肝臟表面光滑、質地柔軟、膽管呈透明管狀結構（圖1D）。

圖1 動物模型大體表現Fig.1 General physical characteristics of the animal model

2.2 HE染色

術后3 d實驗組肝臟組織肝細胞條索及膽管上皮細胞水腫明顯，細胞脹大，結構紊亂，包膜不清楚；術后7 d結構紊亂進一步加重，部分細胞表現為皺縮、壞死、結構破壞，纖維細胞增多，肝細胞條索不清；術后14 d水腫消失，壞死范圍增大，小葉間纖維組織增生，分割肝細胞，形成假小葉；21 d、28 d纖維病變進一步加重，假小葉形成更為明顯，見圖2。

圖2 各組肝臟組織HE染色結果 ×200Fig.2 HE staining of liver tissues in each group ×200

2.3 Masson 染色結果

術后3 d開始匯管區可見少許藍色纖維，術后14 d小葉間纖維樣條索出現，開始形成假小葉；術后21 d纖維條索增多，連接成纖維分隔，假小葉形成；28 d肝細胞纖維病變進一步加重，假小葉形成更加明顯。對照組肝細胞間及小葉間無纖維條索形成，見圖3。

2.4 免疫組化染色結果

圖3 各組肝臟組織Masson染色結果 ×100Fig.3 Masson staining of liver tissues in each group ×100

實驗組肝臟組織及膽管組織中MMP-7的表達水平高于正常對照組，且隨著術后時間的延長表達水平總體呈增高趨勢（圖4）。實驗組各時間段中MMP-19表達均低于對照組（圖5）。

圖4 各組肝臟MMP-7免疫組化結果×200 Fig.4 Immunohistochemical staining analysis of MMP-7 in liver tissues of each group ×200

圖5 各組肝臟MMP-19免疫組化結果×200Fig.5 Immunohistochemical staining analysis of MMP-19 in liver tissues of each group ×200

2.5 Western blotting檢測結果

除14 d外，實驗組各時間段MMP-7的蛋白表達量均高于對照組（圖6A）；而實驗組MMP-19的蛋白表達量均低于對照組，14 d時差異尤為明顯（圖6 B）。

2.6 實時PCR結果

MMP-7 mRNA在實驗組的表達均高于正常對照組，實驗組MMP-19 mRNA的表達均低于對照組，見表1。

圖6 各組肝臟Western blotting結果Fig.6 Western blotting for MMP-7 and MMP-19 carried out on liver samples from each group

表1 MMP-7 mRNA及MMP-19 mRNA在幼鼠肝臟中的表達Tab.1 Expression of MMP-7 and MMP-19 mRNAs in the liver from each group

3 討論

BA是一種累及肝內外膽管的嚴重疾病，主要病理表現為肝內外膽管炎癥、纖維化、消失，肝臟發生漸進性加重的膽汁淤積性肝硬化。雖然目前對BA研究很多，但其病因仍不清、病理發生機制不詳。有研究認為，出生前后的病毒感染與BA的發生有關，并推測在此過程中，病毒感染誘發了針對膽管上皮細胞的特異性炎癥反應，導致膽管上皮細胞持續破壞、修復，最終纖維化、消失，在此過程中涉及炎癥、免疫、凋亡等多個病理過程，多個信號通路系統與該過程密切相關。

眾多研究［5-7］證明，組織器官慢性損傷、炎癥纖維化過程中，MMPs發揮著重要作用。MMPs調節的蛋白水解是損傷的上皮重塑過程中改變細胞-基質連接狀態的重要調節機制，MMPs降解細胞外基質、分泌鈣黏蛋白、整合素等黏連分子，使細胞獲得移位功能、參加組織修復。本研究發現BDL幼鼠動物模型肝臟組織發生了纖維化，隨著梗阻時間的延長，纖維化程度逐漸加重，MMP-7表達水平也隨之逐漸增加，相反，MMP-19表達持續低于正常組。

有研究［8-11］表明MMP-7在不同的細胞反應過程中發揮關鍵作用，而且是多種纖維化疾病的重要調節因子。文獻［7，9-10］報道中提出將MMP-7作為術后檢測肝纖維化程度的一個指標，認為MMP-7可以作為進展期及晚期肝纖維化的重要指標。其他組織器官特異性纖維化過程進展的研究［6］也發現了MMP-7表達水平的升高，且與較差的預后相關，如特發性肺纖維化、腎小管上皮纖維化等。MMP-19是MMPs相應較新的成員，關于MMP-19在纖維化中的作用機制尚不清楚，目前認為MMP-19對組織器官的纖維化有保護作用［11-13］。

綜上所述，組織器官損傷的修復過程是一個復雜過程，其中涉及到細胞外基質的降解和重塑、細胞遷移能力的增強和創面重新上皮化，在此過程中MMPs成員作為重要的纖維化調節家族參與其中，各自發揮的作用不同，而纖維化促進因素的增強與纖維化保護因素的表達減弱是與膽汁淤積性肝損傷過程中肝纖維化的逐漸進展密切相關的。在組織器官慢性纖維化的研究中，怎樣保持兩者的平衡，使損傷的組織器官得到適當修復、且又不過度纖維化將是進一步研究的重點內容。

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Expression of Matrix Metalloproteinase-7 and -19 in Liver Tissues of Rats with Biliary Atresia

LIU Tingzheng，ZHANG Zhibo
（Department of Pediatric Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo detect the expression of matrix metalloproteinase （MMP）-7 and MMP-19 in the liver tissue of young rat models with biliary atresia （BA） and to explore their roles in progressive fibrosis.MethodsTotally 132 Wistar newborn rats were subjected to common bile duct ligation （BDL） at day 3 after birth to establish animal models of biliary atresia. Sixty-two young rats served as the control group. Liver tissues were collected at days 3，7，14，21，and 28. Immunohistochemistry，Western blotting，and RT-PCR were used to detect the expression of MMP-7 and MMP-19.ResultsThe BA models manifested cholestasis as early as 24 h after BDL. HE and Masson staining revealed progressive hepatic fibrosis. The expression of MMP-7 was observed to increase with time and was significantly higher in the experimental group when compared to control. The expression of MMP-19 was also found to gradually increase with time；however，it was lower than the control group.ConclusionMMP-7 and MMP-19 may be involved in the fibrosis of biliary atresia.

matrix metalloproteinase-7； matrix metalloproteinase-19； biliary atresia； hepatic fibrosis

R765.2

A

0258-4646（2017）12-1071-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1758.008.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.004

國家自然科學基金（81270437）

劉亭睜（1989-），女，醫師，碩士研究生.

張志波，E-mail：zhangzb@sj-hospital.org

2017-04-10

網絡出版時間：2017-11-30 17:58

（編輯 于 溪）