葡萄籽原花青素對腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中Caspase-3和TRAF6表達的影響Δ

宋云梅（南陽醫學高等專科學校基礎部，河南南陽473000）

葡萄籽原花青素對腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織中Caspase-3和TRAF6表達的影響Δ

宋云梅＊（南陽醫學高等專科學校基礎部，河南南陽473000）

目的：研究葡萄籽原花青素對腎缺血再灌注損傷（RIRI）大鼠腎組織中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和腫瘤壞死因子相關受體（TRAF6）表達的影響，探討葡萄籽原花青素對RIRI的保護機制。方法：將50只大鼠隨機分為假手術組、模型組、腎復康膠囊組（陽性對照，600 mg/kg）和葡萄籽原花青素低、高劑量組（100、150 mg/kg），每組10只。每天ig給藥1次，連續7 d。給藥結束后，除假手術組的其余各組大鼠均復制RIRI模型。造模成功24 h后，檢測各組大鼠血清中肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）水平以及腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達，并測定腎小管上皮細胞凋亡率。結果：與假手術組比較，模型組大鼠血清中Cr、BUN水平明顯升高（P＜0.05），腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達明顯增強（P＜0.05），腎小管上皮細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中Cr、BUN水平均明顯降低（P＜0.05），腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達均明顯減弱（P＜0.05），腎小管上皮細胞凋亡率均明顯降低（P＜0.05），且葡萄籽原花青素高劑量組作用優于葡萄籽原花青素低劑量組和腎復康膠囊組（P＜0.05）。結論：葡萄籽原花青素能減輕大鼠RIRI，這可能是通過下調腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白的表達，從而抑制腎小管上皮細胞凋亡來實現的。

葡萄籽原花青素；腎缺血再灌注損傷；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；腫瘤壞死因子相關受體；大鼠

腎缺血再灌注損傷（RIRI）可在腎移植術、腎切除術等手術中發生，嚴重的可導致急性腎功能衰竭，患者病死率較高[1]，因此臨床上有必要采取防治措施。RIRI的發生機制復雜，如缺血缺氧環境使組織細胞內酸性代謝產物增加，pH值降低，缺血后突然的復流造成了細胞內外巨大的pH濃度差等，這些因素均可導致的共同結果，就是腎細胞，尤其是腎小管上皮細胞的壞死和凋亡，故腎小管上皮細胞凋亡在RIRI發生發展中有重要作用[2]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）屬于半胱氨酸蛋白酶，具有特異性切割天冬氨酸的特性，在細胞凋亡中起著非常重要的作用[3]；而腫瘤壞死因子相關受體（TRAF6）在活性氧介導的細胞凋亡中發揮重要作用。葡萄籽原花青素是從葡萄籽中提取的一種有效活性營養成分，具有抗氧化、消除細胞內游離氧自由基等作用[4-7]，可減輕RIRI，但其機制并不十分清楚。本研究擬通過考察腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達，探討葡萄籽原花青素對RIRI大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響，從細胞凋亡層面闡明葡萄籽原花青素改善RIRI的機制。

1 材料

1.1 儀器

M15全自動酶標分析儀（上海纖檢儀器有限公司）；Allegerx-12離心機（美國Beckman公司）；FA1104電子天平（上海天平儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

葡萄籽原花青素原料藥（陜西方晟科技有限公司，批號：2014BZ016，純度：96%）；血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20150629、20150220）；兔抗Caspase-3免疫組化試劑盒、山羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號：201509、201509）；腎復康膠囊（吉林敖東集團力源制藥股份有限公司，批號：201412，規格：0.3 g/粒）；TRAF6酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海拜力生物科技有限公司，批號：201511）；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康清潔級Wistar大鼠50只，♀♂各半，體質量200～250 g，由鄭州大學實驗動物中心提供[動物生產許可證號：SCKX（豫）2015-0004]，購入后基礎飼料飼養。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將50只大鼠稱體質量后采用隨機數字表法隨機分為5組，分別為假手術組、模型組、腎復康膠囊組（陽性對照，600 mg/kg，根據臨床用量等效換算而得）和葡萄籽原花青素低、高劑量組（100、150 mg/kg，分別根據臨床成人劑量的6、9倍換算而得），每組10只。于造模前1周，假手術組和模型組大鼠每天ig 1次生理鹽水，各給藥組大鼠每天ig 1次含相應藥物的生理鹽水溶液。給藥7 d后，模型組和各給藥組大鼠按照文獻[8]中方法進行造模：造模前大鼠禁食不禁水6 h，然后采用3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）ip麻醉，當用鉗夾大鼠鼠尾無疼痛后，將大鼠固定于手術臺上，備皮后常規消毒手術區域。采用腹部正中切口，推開肝、腸管等組織，暴露雙側腎組織，對腎筋膜進行鈍性分離，游離腎蒂后分離腎動靜脈，無創動脈夾把雙側腎動脈阻斷60 min復制RIRI模型。造模成功后（造模成功標志：5 min內腎從紫黑色轉為紅色）縫合切口，涂抹紅霉素軟膏預防切口感染。假手術組大鼠處理、分離腎動靜脈后，不夾閉腎動脈。

2.2 血清中Cr、BUN水平的測定

造模成功24 h后，各組大鼠分別從下腔靜脈穿刺取血2 mL，1 000×g低溫離心10 min，分離血清，置于－20℃冰箱中保存。按照試劑盒說明書操作檢測大鼠血清中Cr、BUN水平。

2.3 腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達的檢測

大鼠取血后，ip 3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，處死大鼠，取出腎組織，清洗處理后將部分腎組織制備成10%組織勻漿。采用ELISA法檢測大鼠腎組織中TRAF6表達，具體操作方法按照試劑盒說明書進行。另取部分腎組織，采用免疫組化法檢測大鼠腎組織中Caspase-3蛋白表達，具體操作如下：將石蠟包埋的組織切片置于120℃微波爐中烤片40 min，脫蠟、水化，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，之后進行封閉，分別進行一抗（1∶300）和二抗（1∶500）的孵育；二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片，每張切片隨機采集5個高倍視野，輸入醫學圖像分析系統BI-2000進行圖像處理，檢測Caspase-3的平均光密度值。

2.4 腎小管上皮細胞凋亡率的檢測

采用TUNEL法測定大鼠腎組織中腎小管上皮細胞凋亡率。將經4%多聚甲醛溶液固定的腎組織細胞石蠟切片脫蠟至水，蛋白酶K消化，然后置于37℃濕盒中孵育30 min，并加混合液，37℃濕盒中孵育60 min。玻片放入20×SSC雜交處理溶液的染色缸中終止反應，室溫放置15 min；3%過氧化氫室溫處理30 min，加稀釋的抗生物素蛋白鏈菌素辣根過氧化物酶溶液，室溫反應30 min，DAB顯色，封片。觀察、拍照，腎小管上皮細胞核棕黃色染色為陽性，采用BI-2000圖像處理系統對總細胞和凋亡細胞計數。將每個標本隨機取3張切片，每張切片隨機選取6個不同視野，取平均值，計算細胞凋亡率（凋亡細胞數/總細胞數×100%）。

2.5 統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠血清中Cr、BUN水平測定結果

與假手術組比較，其余各組大鼠血清中Cr、BUN水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中Cr、BUN水平均明顯降低，且葡萄籽原花青素高劑量組大鼠血清中Cr、BUN水平明顯低于葡萄籽原花青素低劑量組和腎復康膠囊組，差異均有統計學意義（P＜0.05），結果見表1。

3.2 大鼠腎組織中TRAF6蛋白表達水平測定結果

與假手術組比較，其余各組大鼠腎組織中TRAF6蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中TRAF6蛋白表達水平均明顯降低，且葡萄籽原花青素高劑量組大鼠腎組織中TRAF6表達水平明顯高于葡萄籽原花青素低劑量組和腎復康膠囊組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。假手術組、模型組、腎復康膠囊組和葡萄籽原花青素低、高劑量組大鼠腎組織中TRAF6蛋白表達測定結果依次為（0.86±0.58）、（8.46±2.65）、（4.64±0.21）、（3.14±0.16）、（5.82±0.23）ng/L（n＝10）。

表1 各組大鼠血清中Cr、BUN水平測定結果（±s，n＝10）Tab 1Determination results of the levels of Cr，BUN in serum of rats in each group（±s，n＝10）

表1 各組大鼠血清中Cr、BUN水平測定結果（±s，n＝10）Tab 1Determination results of the levels of Cr，BUN in serum of rats in each group（±s，n＝10）

注：與假手術組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與葡萄籽原花青素低劑量組和腎復康膠囊組比較，ΔP＜0.05Note：vs.shamoperationgroup，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.procyanidins low-dose group and Shengfukang capsules group，ΔP＜0.05

組別假手術組模型組腎復康膠囊組葡萄籽原花青素低劑量組葡萄籽原花青素高劑量組BUN，mmol/L 8.45±0.57 42.60±3.96＊28.21±3.04＊#29.49±2.43＊#21.23±3.56＊#Δ劑量，mg/kg 600 100 150 Cr，μmol/L 42.29±6.05 115.90±18.98＊74.21±5.47＊#86.27±4.11＊#61.03±3.16＊#Δ

3.3 大鼠腎組織中Caspase-3蛋白表達水平測定結果

與假手術組比較，其余各組大鼠腎組織中Caspase-3表達水平均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織中Caspase-3表達水平明顯降低，且葡萄籽原花青素高劑量組大鼠腎組織中Caspase-3表達水平明顯低于葡萄籽原花青素低劑量組和腎復康膠囊組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。假手術組、模型組、腎復康膠囊組和葡萄籽原花青素低、高劑量組大鼠腎組織中Caspase-3蛋白檢測平均光密度值依次為0.190±0.07、0.564±0.02、0.436±0.06、0.422±0.03、0.377±0.02（n＝10）。免疫組化圖見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織中Caspase-3蛋白檢測免疫組化圖（×400）Fig1ImmunohistochemistryoftheCaspase-3 proteinexpressioninrenaltissueof rats in each group（×400）

3.4 大鼠腎小管上皮細胞凋亡率測定結果

與假手術組比較，其余各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎小管上皮細胞凋亡率明顯降低，且葡萄籽原花青素高劑量組大鼠腎小管上皮細胞凋亡率明顯低于葡萄籽原花青素低劑量組和腎復康膠囊組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。假手術組、模型組、腎復康膠囊組和葡萄籽原花青素低、高劑量組大鼠腎小管上皮細胞凋亡率依次為（3.3±0.9）%、（24.4±2.6）%、（19.6±3.2）%、（20.8±31）%、（13.9±2.1）%。切片圖見圖2。

圖2 各組大鼠腎小管上皮細胞凋亡率切片圖（×400）Fig 2Section pictures of the apoptotic rate ofrenaltubularepithelialcellsof rats in each group（×400）

4 討論

RIRI可導致腎功能衰竭，其發生機制與氧源性自由基的產生、腎細胞凋亡等因素相關。血清中Cr、BUN和胱抑素C水平是反映腎小球濾過率的敏感標志物。腎復康膠囊治療RIRI的效果在臨床應用中已經得到了肯定[9]，故以此為陽性對照藥。本研究結果顯示，夾閉腎蒂后大鼠腎顏色由鮮紅色變為暗紅色，夾閉一定時間后，松開動脈夾，之后腎顏色逐漸恢復鮮紅色，且各手術組大鼠血清中Cr、BUN水平均明顯升高，這提示腎組織發生明顯病理損傷，表明RIRI大鼠模型制備成功。

當缺血再灌注時，可通過多種途經使細胞發生病理改變，這其中首先就是線粒體途徑。當外界刺激過于劇烈時，線粒體膜結構遭到破壞，三磷酸腺苷生成量顯著減少，線粒體功能喪失，將直接誘導細胞的凋亡。在死亡受體通路中，死亡受體Fas可與Fas相關結構死亡域（Fas-associated death domain，FADD）結合，FADD又參與了Caspase-3的激活，從而造成細胞凋亡。TRAF6在氧自由基介導的細胞凋亡中也發揮著重要的作用，減少氧自由基的產生或減少TRAF6蛋白的表達，均可減少氧自由基導致的細胞凋亡[10-11]。葡萄籽原花青素為從葡萄籽中提取的帶酚羥基的多酚化合物，具有極強的抗氧化活性[12]。本研究結果顯示，大鼠腎缺血再灌注期間，腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達明顯增強，腎小管上皮細胞凋亡率明顯升高；預防性給予葡萄籽原花青素后，大鼠腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白表達明顯減弱，腎小管上皮細胞凋亡率降低，同時血清中Cr、BUN水平也顯著降低。這說明葡萄籽原花青素可以減輕大鼠RIRI，可能是通過抑制腎小管上皮細胞的凋亡來實現的。

綜上所述，葡萄籽原花青素減輕RIRI可能與下調腎組織中Caspase-3、TRAF6蛋白的表達，從而抑制腎小管上皮細胞的凋亡有關，但其更確切的作用機制有待進一步驗證。

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Effect of Grape Seed Procyanidins on Protein Expressions of Caspase-3 and TRAF6 in Renal Tissue of Rats with Renal Ischemia-reperfusion Injury

SONG Yunmei（Dept.of Basic，Nanyang Medical College，Hennan Nanyang 473000，China）

OBJECTIVE：To study the effect of grape seed procyanidins on protein expressions of cysteine aspartic protease 3（Caspase-3），tumor necrosis factor-related receptors（TRAF6）in renal tissue of rats with renal ischemia-reperfusion injury（RIRI），and explore the protective mechanism of procyanidins on RIRI.METHODS：50 rats were randomly divided into sham operation group，model group，Shenfukang capsules group（positive control，600 mg/kg），procyanidins low-dose，high-dose groups（100，150 mg/kg），10 in each group.All rats were intragastrically administrated once a day，for 7 d.After administration，rats in other groups except for sham operation group were established the RIRI model.After the modeling successed of 24 h，levels of creatinine（Cr），urea nitrogen（BUN）in serum，and protein expressions of Caspase-3，TRAF6 in renal tissue of rats in each group were detected，and apoptotic rate of renal tubular epithelial cells was determined.RESULTS：Compared with sham operation group，levels of Cr，BUN in serum in model group were significantly increased（P＜0.05）；protein expressions of Caspase-3，TRAF6 in renal tissue were obviously enhanced（P＜0.05）；apoptotic rate of renal tubular epithelial cells was obviously increased（P＜0.05）.Compared with model group，levels of Cr，BUN in serum in each administration group were obviously decreased（P＜0.05）；protein expressions of Caspase-3，TRAF6 in renal tissue were obviously weakened（P＜0.05）；apoptotic rate of renal tubular epithelial cells was obviously decreased（P＜0.05）；and procyanidins high-dose group showed superior effect to low-dose group and Shenfukang granules group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Grape seed procyanidins can relieve the RIRI of rats，which may be achieved by reducing protein expressions of Caspase-3 and TRAF6 to inhibit the apoptotic rate of renal tubular epithelial cells.

Grape seed procyanidins；Renal ischemia-reperfusion injury；Cysteine aspartic protease 3；Tumor necrosis factor-related receptors；Rats

R285

A

1001-0408（2017）34-4811-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.15

南陽市科技攻關項目（No.2014GG040）

＊講師，碩士。研究方向：腎缺血再灌注。電話：0377-63526123。E-mail：songsm@163.com

2017-04-10

2017-10-17）

（編輯：林靜）