欖香烯乳聯合更昔洛韋對C6腦腫瘤干細胞侵襲能力及TIMP-1 mRNA表達的影響

陳強，段青（德州市中醫院神經外科，山東德州253000）

欖香烯乳聯合更昔洛韋對C6腦腫瘤干細胞侵襲能力及TIMP-1 mRNA表達的影響

陳強＊，段青（德州市中醫院神經外科，山東德州253000）

目的：研究欖香烯乳聯合更昔洛韋對C6腦腫瘤干細胞（BTSCs）侵襲能力及組織金屬蛋白酶抑制物1（TIMP-1）mRNA表達的影響。方法：從大鼠C6惡性膠質瘤細胞株中分離培養傳代3次的細胞，采用免疫細胞化學法檢測其中干細胞標志物CD133、Nestin蛋白表達情況。將20只大鼠隨機分為空白對照組（生理鹽水）、更昔洛韋組（ig，216 mg/kg）、欖香烯乳組（尾iv，36 mg/kg）和聯用組（ig更昔洛韋216 mg/kg+尾iv欖香烯乳36 mg/kg），每組5只，每天給藥1次，連續給藥10 d。于末次給藥后2 h采集各組大鼠血液并分離血清，分別與C6 BTSCs在體外培養基中共同培養24 h。采用Boyden侵襲試驗檢測C6 BTSCs的細胞侵襲能力，實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法測定C6 BTSCs的TIMP-1 mRNA表達情況。結果：傳代3次后的細胞中CD133、Nestin蛋白有明顯表達，表明其為BTSCs。與空白對照組比較，更昔洛韋組、欖香烯乳組和聯用組C6 BTSCs的細胞侵襲率均明顯下降、TIMP-1 mRNA表達均明顯增強，差異有統計學意義（P＜0.05）；與更昔洛韋組和欖香烯乳組比較，聯用組C6 BTSCs的細胞侵襲率明顯下降、TIMP-1 mRNA表達明顯增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：欖香烯乳聯合更昔洛韋可明顯抑制C6 BTSCs的細胞侵襲，其作用機制可能與促進TIMP-1的生成有關，且聯用效果強于單用。

C6惡性膠質瘤細胞株；腦腫瘤干細胞；欖香烯乳注射液；更昔洛韋分散片；細胞侵襲；組織金屬蛋白酶抑制物1

腦腫瘤干細胞（Brain tumor stem cells，BTSCs）是從腦腫瘤（尤其是惡性腦腫瘤）中分離的具有“干細胞”特征的種子細胞[1]。不同于干細胞的是，BTSCs的增殖與自我更新能力更強，離體培養時傳代次數也更多，因此被認為是引發腦腫瘤并維持其浸潤性生長、復發及轉移的主要細胞源[2]。目前，對于腦腫瘤的治療主要依靠化療、放療及手術等手段。有研究表明，含烷化劑的藥物聯合化療方案治療后患者2年內生存率低于30%，中位生存時間也不足15個月；放療雖然可以提高治療效果，但其受到放療劑量的限制，且某些腫瘤細胞對放療敏感性低；手術并無法對腫瘤進行徹底有效的根治，加上腦腫瘤復發率極高，因此眾多療法在腦腫瘤方面的臨床療效仍不能令人滿意[3]。近年來，神經細胞學及電子顯微技術的重大進步，極大地豐富了國內外學者對腦腫瘤發生、發展機制的認識，自2002年最早發現并成功分離BTSCs后，國內外學者便致力于對BTSCs進行研究。隨著中醫藥在醫學領域的發展，雙氫青蒿素、喜樹堿、山豆根等中藥成分已被證實具有明顯的抗癌作用[4]。欖香烯為中藥溫郁金中的主要活性成分，研究證實其細胞毒性小、不易產生耐藥現象、無骨髓抑制，且由于欖香烯分子量較小，極易透過血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）[5]，近年來已成為主治腫瘤的處方藥物[6]。更昔洛韋為目前臨床常用的廣譜抗病毒藥，可在多個靶點抑制病毒DNA進行復制，抗病毒活性極強，加之其分子量不大，同樣也極易透過BBB[7]。有研究表明，莪術、白花蛇舌草等中藥復方提取物與更昔洛韋聯合應用對于腫瘤血管的生成抑制效果顯著[8]。本研究將欖香烯乳與更昔洛韋聯合應用，觀察其對BTSCs侵襲能力以及組織金屬蛋白酶抑制物1（TIMP-1）mRNA表達的影響，初步探討欖香烯乳聯合更昔洛韋是否可以抑制腫瘤細胞侵襲及其分子調控機制，以期為臨床抗腦腫瘤治療提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器

G16型高速離心機（北京白洋醫用離心機有限公司，離心半徑：5.60 cm）；Prism?7000型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）儀（美國應用生物系統公司）；CX23型熒光顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]；4XCTV型光倍顯微鏡（萊州萊華試驗儀器廠）；U-1810DS型紫外分光光度儀[屹譜儀器制造（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

欖香烯乳注射液（大連華立金港藥業有限公司，批號：H10960114，規格：20 mL∶0.1 g）；更昔洛韋分散片（湖北東信藥業有限公司，批號：H20110082，規格：每片0.25 g）；兔抗人干細胞標志物CD133一抗、兔抗大鼠肝細胞標志物Nestin一抗和Matrigel基質膠（美國BD公司）；Alexa Fluor 488標記的羊抗人免疫球蛋白G（IgG）、Alexa Fluor 610標記的羊抗兔IgG二抗（美國Molecular Probes公司）；多聚甲醛、結晶紫、Hoechst 33342染色液（上海遠慕生物科技有限公司）；Gibco?胎牛血清（FBS，美國Thermo Fisher公司）；DMEM/F12培養基（上海博升生物科技有限公司）；Transwell小室（美國Millipore公司）；堿性成纖維生長因子、表皮生長因子（美國Sigma公司）；B-27添加劑（美國Invitrogen公司）；RT-PCR試劑（威斯騰生物醫藥科技有限公司）；Trizol試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.3 細胞與動物

大鼠C6惡性膠質瘤細胞株（上海細胞所）。SD大鼠，♂，體質量240～260 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產合格證號：SCXK（京）2011-0011，使用許可證號：SYXK（魯）2011-0034。本實驗在我院實驗動物倫理委員會審核并同意的情況下進行。

2 方法

2.1 細胞培養

先用普通培養基（含10%優質胎牛血清的DMEM/F12培養基）對C6惡性膠質瘤細胞在37℃、相對濕度95%、5%CO2的培養箱中培養。當細胞生長達到對數生長期時，按照3×103個/cm2的密度在無血清培養基（質量濃度均為20 ng/mL的堿性成纖維生長因子與表皮生長因子、質量濃度為20 μg/mL的B-27添加劑）中再繼續培養，2～3 d換液1次；6 d時消化制備成單細胞懸液，并以相同的密度接種在24孔板中。傳代3次后作為C6 BTSCs進行下一步試驗。

2.2 免疫細胞化學法檢測細胞中CD133、Nestin蛋白的表達

為了證實“2.1”項下傳代3次后的細胞已經是BTSCs，筆者將分離得到的細胞倒去培養基后用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次，多聚甲醛固定30 min，再用PBS洗滌3次。加封閉液進行封閉，1 h后加兔抗人CD133一抗于濕盒中，4℃條件下孵育過夜。然后繼續加入Alexa Fluor 488標記的羊抗人IgG、Alexa Fluor 610標記的羊抗兔IgG二抗于37℃條件下孵育1 h。最后再加Hoechst 33342染色液，10 min后用PBS洗滌3次并用蓋玻片進行封固，用熒光顯微鏡進行觀察細胞中CD133、Nestin蛋白表達情況。

2.3 分組、給藥及含藥血清制備

將20只SD大鼠按隨機數字表法分為空白對照組、更昔洛韋組、欖香烯乳組和聯用組，每組5只。更昔洛韋組大鼠ig給予以生理鹽水溶解稀釋的更昔洛韋分散片，給藥劑量為216 mg/kg；欖香烯乳組大鼠尾iv給予欖香烯乳注射液，給藥劑量為36 mg/kg，藥物劑量均參考《藥理實驗方法學》大鼠與人臨床等效劑量表設定；聯用組大鼠先ig給予更昔洛韋216 mg/kg進行抗病毒治療，間隔0.5 h后，尾iv給予欖香烯乳36 mg/kg；空白對照組大鼠給予等量生理鹽水。各組大鼠每天給藥1次，連續給藥10 d，于末次給藥2 h后采集大鼠血液并分離血清。

2.4 C6 BTSCs與給藥血清的體外培養

用無血清培養基對C6 BTSCs進行培養，當細胞生長達到對數生長期時分別加入10%的空白對照組、更昔洛韋組、欖香烯乳組和聯用組大鼠的分離血清，繼續培養24 h。

2.5 Boyden侵襲試驗檢測細胞侵襲率

用100 μL Matrigel基質膠將Transwell小室上室的底膜包被，分別在2個下室中添加200 μL的趨化液，將包被Matrigel基質膠底膜的上室套入其中一個下室，并以沒有鋪Matrigel基質膠的上室作為對照組。調整并配制細胞密度為2.5×108個/L的含藥血清C6 BTSCs單細胞懸浮液，取200 μL分別加入2個上室中，37℃條件下培養20 h后，取出上室，棄去殘留細胞及Matrigel基質膠，并加入300 μL的70%甲醇進行固定，0.5 h后用PBS洗滌3次。加300 μL的蘇木精染液進行染色，10 min后用雙蒸水漂洗3次，蓋玻片封膜，使用光倍顯微鏡放大400倍觀察并計數，計算細胞侵襲率（%）[試驗組穿膜細胞數/對照組（無Matrigel基質膠）穿膜細胞數×100%]。試驗重復5次。

2.6 RT-PCR法檢測細胞中TIMP-1 mRNA表達

按照Trizol試劑盒說明書用氯仿提取細胞的總RNA，反轉錄成cDNA并以此為模板進行PCR擴增。反應參數：95℃預變性15 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min終止反應。用紫外分光光度儀測定吸光度。以β-肌動蛋白（β-actin）為內參，以TIMP-1與內參吸光度的比值表示TIMP-1 mRNA相對表達量。PCR反應擴增引物序列見表1。

表1 PCR反應擴增引物序列Tab 1Primer sequence of PCR reaction amplification

2.7 統計學方法

圖1 免疫熒光染色圖（×400）Fig 1Immunofluorescence staining（×400）

3 結果

3.1 細胞中CD133與Nestin蛋白表達

經免疫熒光染色后，CD133表達呈強綠色熒光，Nestin呈強紅色熒光。傳代3次后的細胞中CD133、Nestin蛋白有明顯表達，表明細胞確為C6 BTSCs。免疫熒光染色圖見圖1。

3.2 細胞侵襲率

與空白對照組比較，更昔洛韋組、欖香烯乳組和聯用組C6 BTSCs的細胞侵襲率均明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與更昔洛韋組和欖香烯乳組比較，聯用組C6 BTSCs的細胞侵襲率明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。各組C6 BTSCs的細胞侵襲率結果見表2。

表2各組C6 BTSCs的細胞侵襲率和TIMP-1 mRNA表達情況比較（±s，n＝5）

Tab 2Comparison of invasive rate of C6 BTSCs and TIMP-1 mRNA expression in each group（±s，n＝5）

注：與空白對照組比較，＊P＜0.05；與更昔洛韋組和欖香烯乳組比較，#P＜0.05Note：vs.blank control group，＊P＜0.05；vs.ganciclovir group and Elemene emulsion injection group，#P＜0.05

3.3 細胞中TIMP-1 mRNA表達

與空白對照組比較，更昔洛韋組、欖香烯乳組和聯用組C6 BTSCs中TIMP-1 mRNA表達均明顯增強，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與更昔洛韋組和欖香烯乳組比較，聯用組C6 BTSCs中TIMP-1 mRNA表達明顯增強，差異具有統計學意義（P＜0.05）。各組C6 BTSCs中TIMP-1 mRNA表達結果見表2。

4 討論

腦腫瘤（尤其是惡性膠質瘤）是臨床致死率比較高的腫瘤之一。目前常用的臨床療法包括手術、放療、化療、加壓氧療以及基因靶向療法等，但由于惡性膠質瘤呈侵襲性生長，造成其與正常腦組織的界限并不能完全區分，因此給手術切除治療造成極大的困難，即使憑借神經細胞學及影像學等高度發展的現代醫學，手術治療也無法徹底完整切除腫瘤組織；放療、化療等療法對骨髓、消化道等的副作用大，某些腫瘤細胞對此也并不敏感，造成如今腦腫瘤臨床效果均不佳，加之復發率較高，給患者的生理與心理造成極大的消極影響[9]。腦腫瘤的高復發率主要依賴于膠質瘤細胞可以迅速增殖，并且具有較強的浸潤性及耐受性。研究發現，在腫瘤早期某些膠質瘤細胞已經沿血管外間隙、白質束及室管膜等進行浸潤[10]。而有研究表明，BTSCs具有類似“神經干細胞”的生物學特征，可以在體內分化成神經元，進而表達CD133與Nestin等表面標記物[11]。因此，成功分離獲得BTSCs并以此為靶標找到有效治療方法，對于膠質瘤的治療與預后將有重要的臨床意義。

溫郁金是中藥中行氣活血化瘀的藥物。中醫認為，血瘀是腫瘤形成的重要原因之一，瘀血是腫瘤的病理產物。欖香烯乳注射液是中藥溫郁金主要抗癌成分欖香烯的注射劑，欖香烯是一種小分子化合物，分子量為204.36。已有大量文獻表明，欖香烯可以透過BBB，臨床治療腦惡性膠質瘤有效率可以達到70%以上；且其毒性甚微，對骨髓幾乎無毒副作用，不易產生耐藥，既可以殺傷腫瘤組織，又能保證正常器官不被傷害，因而是臨床化療的理想藥物[5]。更昔洛韋作為一種廣譜性抗病毒藥，可通過病毒腺激酶對DNA聚合酶進行競爭性抑制，被病毒所誘生的蛋白酶磷酸化后可直接滲入病毒DNA鏈阻止其延長；由于更昔洛韋分子量也較小，因此極易透過BBB。目前，已有研究表明欖香烯乳注射液對惡性腦腫瘤患者療效滿意[6]，但聯合更昔洛韋對C6 BTSCs的細胞侵襲能力及TIMP-1 mRNA的表達影響如何目前尚未見報道。本研究通過培養大鼠C6 BTSCs，觀察欖香烯乳聯合更昔洛韋對其侵襲能力以及TIMP-1 mRNA表達的影響，初步探討聯用后是否可抑制腫瘤細胞侵襲及分子調控機制，以期為欖香烯乳臨床抗腦腫瘤治療提供實驗基礎。

CD133與Nestin是具有增殖及多向分化能力的神經干細胞的特異性標記物[10]。在本實驗中，首先從原代腫瘤組織中成功分離并純化出BTSCs，并用免疫細胞化學法對CD133及Nestin進行了檢測，以確定傳代細胞的干細胞特征。

Boyden侵襲試驗是模擬腫瘤細胞體外侵襲能力的可靠模型，多用于侵襲機制的研究，該模型中的Matrigel膠質膠與人類基底膜的基本成分相似，因而含有層黏蛋白、Ⅳ型膠原等成分。在惡性腫瘤的侵襲與轉移過程中，腫瘤細胞必須通過形態的改變及分泌蛋白酶使細胞外基質（Extracellular matrixc，ECM）降解從而穿透基底膜，方可進入血管、淋巴進行轉移[12]。本研究采用Boyden侵襲小室技術，測定了C6 BTSCs在空白對照、更昔洛韋、欖香烯乳、聯用藥4種血清干預下侵襲基底膜情況，結果表明欖香烯乳與更昔洛韋聯用可以顯著抑制C6 BTSCs的體外侵襲能力。

目前，國內外學者的研究表明，ECM纖維所生成的網狀結構對腫瘤細胞的生成、浸潤與轉移具有阻礙作用[13]。基質金屬蛋白酶家族中的基質金屬蛋白酶9（Matrix metalloprotein，MMP-9）則是調節ECM代謝的最主要限速酶，可以降解ECM及基底膜，增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。TIMP-1是MMP-9的高特異性抑制劑，通過與酶原MMP-9以非共價的方式結合，可延緩或阻礙后者向激活型MMP-9的轉化，從而抑制MMP-9參與降解ECM，達到減緩腫瘤細胞的侵襲和轉移的目的[14]。本研究發現，欖香烯乳注射液與更昔洛韋聯用可以通過促進TIMP-1 mRNA的表達，從而抑制MMP-9對ECM的降解，最終起到抑制C6 BTSCs侵襲和轉移的作用，為欖香烯乳與更昔洛韋聯用于抗BTSCs的侵襲轉移提供了初步的實驗依據。

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Effect of Elemene Emulsion Injection Combined with Ganciclovir on Invasive Ability and TIMP-1 mRNA Expression in C6 Brain Tumor Stem Cells

CHEN Qiang，DUAN Qing（Dept.of Neurosurgery，Dezhou City Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shandong Dezhou 253000，China）

OBJECTIVE：To study the effect of Elemene emulsion combined with ganciclovir on invasive ability and TIMP-1 mRNA expression in C6 brain tumor stem cells.METHODS：Cells with 3 generations were isolated and cultured from rats’C6 malignant glioma cell lines，and immunocytochemistry was adopted to detect the protein expressions of stem cell markers CD133，Nestin.20 rats were randomly divided into blank control group（normal saline），ganciclovir group（intragastrically administrated，216 mg/kg），Elemene emulsion injection group（intravenously injected in tail，36 mg/kg）and combination group（intragastrically administrated 216 mg/kg of ganciclovir+intravenously injected 36 mg/kg of Elemene emulsion injection in tail），5 in each group，once every day，for 10 d.After 2 h of last administration，the blood of rats in each group was collected，serum was isolated and co-cultured 24 h with C6 BTSCs in in vitro culture medium.Boyden invasion test was used to detect the invasive ability of C6 BTSCs，and real-time quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）method was used to determine the TIMP-1 mRNA expression of C6 BTSCs.RESULTS：Cells with 3 generations had obvious protein expressions in CD133 and Nestin，indicating they were BTSCs.Compared with blank control group，the cell invasion rates of C6 BTSCs in ganciclovir group，Elemene emulsion injection group and combination group were obviously decreased，TIMP-1 mRNA expression was obviously enhanced，with statistical significances（P＜0.05）.Compared with ganciclovir group and Elemene emulsion injection group，the cell invasion rate of C6 BTSCs in combination group was obviously decreased，TIMP-1 mRNA expression was obviously enhanced，with statistical significances（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Elemene emulsion injection combined with ganciclovir can obviously inhibit the cell invasion of C6 BTSCs，the mechanism may be associated with promoting the TIMP-1 generation，and combination use shows better effect than single use.

C6 malignant glioma cell lines；Brain tumor stem cells；Elemene emulsion injection；Ganciclovir dispersible tablets；Cell invasion；Tissue inhibitor of metalloproteinase 1

R965；R361+.3

A

1001-0408（2017）34-4826-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.19

＊副主任醫師。研究方向：神經外科。電話：0534-2725036。E-mail：pansirr@126.com

2017-04-21

2017-07-20）

（編輯：鄒麗娟）