多花黃精活性多糖提取分離及含量測定研究

何連軍 呂偉德 楊菊妹

1杭州職業技術學院 浙江省杭州市 310018 2磐安縣人民醫院 浙江省金華市 322300

多花黃精活性多糖提取分離及含量測定研究

何連軍1呂偉德1楊菊妹2

1杭州職業技術學院 浙江省杭州市 310018 2磐安縣人民醫院 浙江省金華市 322300

目的：對多花黃精活性多糖的提取分離方法進行試驗，確定最佳的提取分離方法，并對提取分離后的粗多糖的含量進行測定。方法：采用超聲輔助水浴提取，醇沉分離得到多花黃精粗多糖。以葡萄糖為標準品，在488nm波長處，采用苯酚-硫酸法對多糖的含量進行測定。結果：葡萄糖在20～100mg/L質量濃度范圍內呈良好的線性關系（r＞0.999），RSD為0.23%～1.51%，平均加樣回收率為100.2%。測定結果表明，不同產地的多花黃精活性多糖含量存在較大的差異。結論：本實驗所建立的方法簡便快速，準確高，可用于多花黃精多糖提取分離及含量測定的分析研究。

多花黃精；多糖；苯酚-硫酸法；紫外-可見分光光度

黃精為百合科多年生草本植物，按形狀不同，主要分為滇黃精、黃精和多花黃精等，習稱“大黃精”、“雞頭黃精”、“姜形黃精” ，其中以多花黃精的質量最佳、藥效最好[1]。多花黃精又名姜形黃精，屬于黃精中的優質品種，中藥取其干燥根莖入藥，具有補氣養陰、健脾、潤肺、益腎等功效。黃精多糖是黃精重要的化學組成部分，是黃精的主要生物活性成分。

目前，植物多糖含量測定方法尚無統一標準，常用的方法有滴定法、分光光度法(UV-Vis)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、高效毛細管電泳(HPCE)、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法（HPAEC-PAD）[2]等。多糖含量測定最經典的方法是滴定法和分光光度法，其他方法主要用于測定多糖水解后單糖的組成。黃精多糖的提取方法有熱水浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、減壓內部沸騰法等[3]，其中最常用的是熱水浸提法。

本實驗對多花黃精活性多糖的提取分離方法進行了研究，確定了最佳的提取分離條件。并以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法對多糖的含量進行測定。結果表明，該方法簡便快速，準確度高，可作為多花黃精活性多糖提取分離及含量測定的分析研究。

1 儀器、試劑與材料

UV-1800紫外-可見分光光度計；DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機；AR223CN電子天平；HP550-S數顯電加熱板；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵；TGL-16M臺式高速冷凍離心機；DZF-6050MBE真空干燥箱；DHG型電熱恒溫鼓風干燥箱；RE-52AA旋轉蒸發器；KQ3200E超聲波清洗器；旋渦振蕩器；明澈-D 24UV純水/超純水一體化系統。

乙醇、苯酚、濃硫酸等試劑均為分析純；葡萄糖標準品（純度≥99.0%）；實驗室用水為電阻率≥18.2 MΩ·cm超純水。

多花黃精根莖新鮮樣品分別購自河南、安徽、四川、浙江和江西。

2 方法與結果

2.1 葡萄糖標準儲備液的配制

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg，置于100mL量瓶中，以超純水溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為100mg/L的標準儲備液。

2.2 多花黃精粗多糖樣品的制備

取新鮮多花黃精根莖樣品洗凈，晾干，切成薄片，放在干燥箱中60℃烘干，粉碎后過60目篩，低溫保存。稱取多花黃精粉末樣品20g，加95%乙醇200mL回流2h脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以20倍量的超純水100℃水浴下超聲提取1h，過濾，減壓濃縮濾液至50mL，離心，取上清液，在攪拌下慢慢加入200mL無水乙醇，靜置過夜，離心，用無水乙醇清洗沉淀二次，真空干燥得多花黃精粗多糖。精密稱取粗多糖樣品10mg，置于100mL量瓶中，以超純水溶解并定容至刻度，搖勻，備用。

2.3 最大吸收波長的確定

精密吸取葡萄糖標準儲備液和多花黃精粗多糖樣品溶液各1.0mL置于10mL具塞刻度比色管，分別加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻后迅速加入5.0mL濃硫酸（與液面垂直懸空加入，勿接觸試管壁，以便與反應液充分混勻），放在旋渦振蕩器上使反應液充分混勻，然后將比色管放在100℃水浴中反應20min，取出后用冰水浴迅速冷卻至室溫，在200～600nm波長范圍內用分光光度計進行掃描，確定最大吸收波長。結果表明，標準溶液和樣品溶液均在488nm 波長處有最大吸收峰，故選488nm作為本實驗的測定波長。

2.4 標準曲線的制備

精密吸取上述葡萄糖標準儲備液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL分 置 于 10mL具塞刻度比色管中，補加水至1.0mL，配制成濃度分別為0.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0mg/L的標準系列溶液。分別加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻后迅速加入5.0mL濃硫酸，靜止10min。放在旋渦振蕩器上使反應液充分混勻，然后將比色管放在100℃水浴中反應20min，取出后用冰水浴迅速冷卻至室溫。以空白溶液為參比，在488nm波長處測定吸光度，以葡萄糖糖質量濃度c(mg/L )為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制校準曲線，得到線性回歸方程為A=0.0081c-0.0192，相關系數r= 0.9991。結果表明，葡萄糖質量濃度在20～100mg/L范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

分別精密吸取上述葡萄糖標準儲備液0.60mL6份置于10mL具塞刻度比色管中，按2.4項下的方法顯色，以空白溶液為參比，在488nm處測定吸光度，計算吸光度值的RSD為0.23%。結果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取多花黃精粗多糖樣品溶液1.0mL，按2.4項下的方法顯色，在488nm波長處，以空白溶液為參比，每隔半小時測定一次吸光度，連續測定3h，計算吸光度值的RSD為0.57%，結果表明，在3h內樣品溶液吸光度穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取多花黃精粗多糖樣品10mg至100mL量瓶中，平行6份，用超純水稀釋并定容至刻度，搖勻。分別精密吸取樣品溶液1.0mL，按2.4項下方法顯色，以空白溶液為參比，在488nm波長處測定吸光度，計算吸光度值的RSD為1.51%。結果表明，方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取多花黃精粗多糖樣品10mg，置于100mL容量瓶中，用超純水稀釋并定容至刻度，搖勻。精密吸取粗多糖樣品溶液0.50mL共6份置于10mL具塞刻度比色管中，分別 精密加入葡萄糖標準儲備液0.50mL，混勻后，按2.4項下的方法顯色，以空白溶液為參比，在488nm波長處測定吸光度，計算葡萄糖的回收率，結果見表1。由表中可知，葡萄糖的加樣回收率在98.5%～102.3%，RSD為1.56%，表明本方法有良好的準確度。

2.9 多花黃精提取分離方法試驗

2.9.1 提取方法的選擇

取多花黃精粉末20g，加95%乙醇200mL回流2h 脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以20倍量的超純水，分別采用煎煮、加熱回流和100℃水浴超聲提取1h，過濾，減壓濃縮濾液至50 mL，離心，取上清液，在攪拌下慢慢加入200mL無水乙醇，使含醇量達80%，靜置過夜，離心，用無水乙醇清洗沉淀二次，真空干燥得多花黃精粗多糖。稱取粗多糖樣品10mg，按上述2.4項下方法顯色，在488nm波長處，以空白溶液為參比測定吸光度，計算多糖的含量，并按下式計算多糖得率：

結果表明煎煮提取多糖得率最低，加熱回流和超聲水浴得率差不多，但超聲水浴在1h內就能達到較好的提取效果，而加熱回流需要較長的時間才能達到相同的效果，操作也相對復雜。因此，本實驗選用沸水浴超聲輔助提取多花黃精中的多糖。

2.9.2 提取用水量試驗

取多花黃精粉末20g，加95%乙醇200 mL回流2 h 脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以10、20、30倍量的超純水，100℃水浴超聲提取1h，再按2.9.1項下方法處理并測定多糖的含量，計算多糖得率。結果表明，以10倍量水提取多糖得率較低，以20和30倍水量提取多糖得率差不多。因此，本實驗選用20倍水量作為提取溶劑。

2.9.3 提取溫度試驗

取多花黃精粉末20g，加95%乙醇200 mL回流2 h 脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以20倍量的超純水，分別以40℃、60℃、80℃、100℃水浴超聲提取1h，再按2.9.1項下方法處理并測定多糖的含量，計算多糖得率。結果表明，100℃水浴超聲提取多糖得率最高。

2.9.4 提取時間及次數試驗

取多花黃精粉末20g，加95%的乙醇200mL回流2h 脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以20倍量的超純水，以100℃水浴超聲提取，分別提取0.5h、1h、2h，提取次數分一次河兩次，再按2.9.1項下方法處理并測定多糖的含量，計算多糖得率。結果表明，以1h提取兩次多糖得率最高。

2.9.5 醇沉濃度試驗

取多花黃精粉末100g，加95%乙醇1000mL回流2h 脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以20倍量的超純水100℃水浴下超聲提取兩次，每次1h，過濾，合并濾液，減壓濃縮濾液至250mL，離心，取上清液，平均分為5份，在攪拌下分別慢慢加入無水乙醇，使含醇量達50%、60%、70%、80%、90%，再按2.9.1項下方法處理并測定多糖的含量，計算多糖得率。結果表明含醇量達80%時，多糖得率最高。

2.10 樣品的測定

精密稱取六批不同產地的多花黃精粗多糖樣品各10mg，置于100mL量瓶中，用超純水稀釋并定容至刻度，搖勻。分別精密吸取樣品溶液1.0mL，按2.4項下的方法顯色，以空白溶液為參比，在488nm波長處測定吸光度，計算粗多糖中多糖的含量，并按2.9.1項下的公式計算多糖得率，結果見表2。

結果表明，不同產地和來源的多花黃精活性多糖含量和得率存在較為明顯的差異，其中以河南伏牛山野生的多花黃精多糖含量和得率最高。

表1：加樣回收率試驗（n=6）

表2：不同產地多花黃精多糖含量和得率

3 討論

本實驗對多花黃精活性多糖的提取分離方法進行了實驗研究。結果表明，多花黃精經無水乙醇回流脫脂后，以20倍量的超純水100℃水浴下超聲提取兩次，每次1h，濾液經減壓濃縮，離心，取上清液加無水乙醇使含醇量達80%左右時，得到的粗多糖得率最高。同時，采用苯酚-硫酸法對多花黃精粗多糖的含量進行了測定，考察了方法的線性關系、精密度、穩定性、重復性和加樣回收率等。結果表明，本實驗方法簡便快速，精密度高，重復性好，準確可靠，可作為多花黃精活性多糖提取分離和含量測定的分析研究。

本實驗還對不同來源和產地的多花黃精多糖的含量進行了測定。結果表明，不同產地和來源的多花黃精活性多糖含量和得率存在較為明顯的差異，其中以河南伏牛山野生多花黃精含量和得率最高。由于不同產地的多花黃精品種不同，而且生長地域海拔、氣候等條件千差萬別，造成其多糖含量也各不相同，不同產地及品種的多花黃精其多糖活性和臨床作用是否一致，還需要作進一步研究。

[1]中國藥典[S].一部,2015.

[2]何連軍,干雅平,呂偉德,饒君鳳,楊菊妹,余家勝.高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法測定多花黃精多糖的單糖組成[J].中草藥,2017,48(08):1671-1676.

[3]任奕. 黃精多糖提取工藝研究進展[J].農業科技與裝備,2017(07):57-58.

浙江省科技廳分析測試科技計劃項目(2015C37020)。

何連軍（1971-），男，碩士學位。高級實驗師/高級工程師。研究方向為色譜、光譜分析技術研究。