二苯乙烯苷對神經細胞淀粉樣肽前體蛋白表達的影響及其與CREB調節相關的作用機制

尹曉敏 徐 婷 戴伍飛 錢嘉逸 陳 晨 張 蘭 李 林*

(1.首都醫科大學宣武醫院藥物研究室 北京市神經藥物工程技術研究中心，北京 100053；2.南通大學醫學院生物化學與分子生物學系，江蘇南通 226001)

·神經系統疾病的基礎和臨床研究·

二苯乙烯苷對神經細胞淀粉樣肽前體蛋白表達的影響及其與CREB調節相關的作用機制

尹曉敏1,2徐 婷2戴伍飛2錢嘉逸2陳 晨1張 蘭1李 林1*

(1.首都醫科大學宣武醫院藥物研究室 北京市神經藥物工程技術研究中心，北京 100053；2.南通大學醫學院生物化學與分子生物學系，江蘇南通 226001)

目的探討二苯乙烯苷(tetrahydroxystilbene glucoside,TSG)對培養神經細胞淀粉樣肽前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)表達的影響及其作用機制。方法應用Western blotting法檢測APP和cAMP效應元件結合蛋白(cAMP responsive element-binding protein,CREB)的表達。用Matinspector軟件分析APP啟動子區CRE順式反應元件；構建不同長度APP啟動子區熒光素酶表達質粒；用雙熒光素酶報告基因系統檢測細胞中熒光素酶活性。結果由Forskolin激活SH-SY5Y細胞中CREB的同時可下調APP表達，成功構建了含有CRE元件的APP啟動子區熒光素酶表達質粒。TSG能夠抑制SH-SY5Y細胞內APP表達，并對APP啟動子轉染細胞內含有CRE1和2的APP熒光素酶報告基因質粒表達有顯著抑制作用。結論TSG能夠下調神經細胞中APP的表達，其機制可能與影響CREB與CRE元件的結合有關。

二苯乙烯苷；淀粉樣肽前體蛋白；cAMP效應元件結合蛋白；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年人中最常見的神經退行性疾病，其患者腦內主要病理表現為細胞內大量的神經原纖維纏結的形成以及細胞外大量β-淀粉樣肽(β-amyloid,Aβ)聚集形成的老年斑[1]。其中，Aβ是由淀粉樣肽前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)經成淀粉樣肽途徑生成的小分子毒性片段[2]。有文獻[3]顯示，APP表達水平與可溶性Aβ水平增高呈正相關。

cAMP效應元件結合蛋白(cAMP responsive element-binding protein,CREB)在真核生物正常的生理調節下可調控其靶基因的轉錄。CREB可以特異性地結合到cAMP效應元件(cAMP responsive element，CRE)上。CRE廣泛存在于真核生物基因啟動子區，CREB通過與CRE結合，可以影響下游靶基因的轉錄效率。CREB在神經元生成、突觸可塑性以及學習記憶等方面都具有非常重要的調節作用[4-6]，可作為神經系統疾病的潛在藥物靶點。本研究中筆者證實了CREB對APP表達的調節作用。

二苯乙烯苷(2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-b-D-glucoside,TSG)是中藥何首烏的主要有效成分和標志成分。本課題組前期在APP轉基因小鼠模型中，發現TSG能夠改善模型鼠的學習記憶能力，減少腦顳葉皮質淀粉樣斑塊的數目和面積，減低皮質和海馬Aβ的量[7-9]。但是TSG對APP表達的影響及其作用機制尚未見報道。本文通過構建APP啟動子區雙熒光素酶報告基因質粒，研究TSG對神經細胞內APP蛋白表達的影響，并探討其與CREB調節相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

TSG購自中國食物與藥物研究所，純度>98%；Forskolin購自美國Sigma-aldrich公司，純度>98%。抗APP抗體購自德國Merck-Millipore公司，CREB及磷酸化CREB抗體購自美國Cell signaling公司，GAPDH抗體購自美國Santa cruz公司。蛋白標準品購自美國Bio-rad公司；DNA標準品購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 細胞培養

人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞培養在含10%(體積分數)胎牛血清的DMEM/F12培養基中，置37 ℃含5%(體積分數)CO2的培養箱內。人胚胎腎細胞系HEK-293FT細胞培養在含10%(體積分數)胎牛血清的高糖DMEM培養基中，置37 ℃含5%(體積分數)CO2的培養箱，每兩天換一次培養基。

1.3 Western blotting分析

細胞裂解后，細胞總蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，然后電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%(質量分數)脫脂牛奶封閉30 min，一抗(抗APP、CREB或p-CREB抗體)在室溫下孵育過夜。然后用含0.5% (體積分數)Tween-20的Tris-HCl緩沖液(TBST)洗滌，與辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育2 h。再經TBST洗滌后，加入ECL化學發光試劑(美國Thermo Fisher公司)進行膠片曝光顯影。

1.4 質粒構建

熒光素酶報告基因質粒pGL3/APP的構建：通過分析APP啟動子區的評分較高的CRE元件的位置，筆者構建了3種不同長度的APP啟動子熒光素酶報告基因質粒pGL3/APP，其中APP1含有順式作用元件CRE 1～4，APP2含有CRE 3～4，APP3只含有CRE4。

1.5 聚合酶鏈式反應(PCR)

以人cDNA為模板進行PCR擴增反應，APP所用的引物為：上游，5′-CAC TTT GTG ATT CCC TAC CGC-3′，下游，5′-CAC CAG ACA TCC GAG TCA TCC-3′；GAPDH所用的引物為：上游，5′-TCA ACG GAT TTG GTC GTA TT-3′，下游，5′-CTG TGG TCA TGA GTC CTT CC-3′。各APP啟動子區的引物分別是：APP1上游引物，5′-GGG GTA CCT GGG CCT CCT AAA GTG CTG-3′；APP2上游引物，5′-GGG GTA CCA GGC ACC CTT GTC AGC G-3′；APP3上游引物，5′-GGG GTA CCA ACC CAA GCC CAG AAC C-3′；所有的下游引物均為5′-GAA GAT CTA GGG CTG GGC CGA AAG-3′。反應條件設定為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物用1.5%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.6 細胞轉染

轉染前一天將HEK-293FT細胞以50%密度接種于細胞培養板，轉染當天待細胞密度約80%左右，按照Lipofectamine 3000(Invitrogen公司，美國)說明書進行操作，將熒光素酶報告基因質粒pGL3/APP轉染入細胞。

1.7 雙熒光素酶報告基因系統分析

根據雙熒光素酶報告基因檢測系統(購自美國Promega公司)說明書進行操作，測定熒光素酶激發所釋放的熒光值(A1)，樣品中內參質粒(pRL-TL)所攜帶的海腎熒光素酶激發底物所釋放熒光值(A2)。每一個樣品的A1/A2比值即為該質粒轉染細胞后所表達的熒光素酶的相對活性。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 TSG對神經細胞內APP表達的影響

TSG(100 μmol/L)與人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y細胞孵育48 h，然后應用Western blotting和RT-PCR方法檢測內源性APP蛋白表達量的變化，結果顯示無論在蛋白水平還是mRNA水平，TSG可明顯降低神經細胞內APP的表達水平(圖1A，1.000±0.043vs0.612±0.044,P<0.001；圖1B,1.000±0.032vs0.750±0.047,P<0.01)。

圖1 TSG對SH-SY5Y細胞內APP表達的影響Fig.1 Effect of TSG on APP expression in SH-SY5Y cells

SH-SY5Y cells were incubated with 100 μmol/L TSG for 48 h.The endogenous APP level was determined by Western blotting (A) and RT-PCR (B),and GAPDH was used as a reference.Data were presented as mean ±SE,n=4.**P<0.01***P<0.001vscontrol group;TSG:tetrahydroxystilbene glucoside;APP:amyloid precursor protein.

2.2 CREB對SH-SY5Y細胞內APP表達的影響

筆者在上述研究中發現，TSG對SH-SY5Y細胞內CREB磷酸化水平有一定升高作用(圖2A)，提示其對CREB有一定激活作用。為了進一步研究CREB對APP表達的影響，筆者用PKA激活劑Forskolin(10 μmol/L)與SH-SY5Y細胞孵育12 h，以此來活化CREB。通過Western blotting分析，筆者檢測到磷酸化CREB(p-CREB)表達明顯升高(圖2B，1.000±0.042vs1.423±0.063,P<0.01)，表明CREB被激活，同時發現APP表達明顯降低(圖2B，1.000±0.057vs0.684±0.043,P<0.01)。這些結果提示CREB通過與CRE元件結合，對APP的表達有下調作用。

2.3 APP啟動子區CRE元件分析及雙熒光素酶報告基因質粒的構建

為了研究人APP的表達調控，筆者由轉錄起始點開始，分析APP轉錄起始位點上游2 000 bp左右的啟動子區，用Matinspector軟件分析了該區域的CRE元件，篩選出4個評分較高的CRE元件，分別位于 -1 972～-1 952(CRE1)，-1 886～-1 866(CRE2)，-1 031～-1 011(CRE3)，-711～-691(CRE4)(圖3A)。按照其分布，筆者構建了3個不同長度的APP啟動子截斷體，命名為APP 1～3，其中APP 1含有順式作用元件CRE 1～4；APP 2含有CRE 3～4；APP3只含有CRE4(圖3B)。然后將它們分別連接到pGL3載體中，對pGL3/APP質粒進行酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示酶切的條帶長度均符合預期(圖3C)，進一步的測序鑒定結果也提示熒光素酶報告基因質粒構建成功。

圖2 CREB對SH-SY5Y細胞內APP表達的影響Fig.2 Effect of CREB on APP expression in SH-SY5Y cells

A:SH-SY5Y cells were incubated with 100 μmol/L TSG for 48 h.The endogenous CREB，phosphorylated CREB (p-CREB) and GAPDH protein levels were determined by Western blotting.The data are presented as mean ±SE,n=4.*P<0.05vscontrol group;B: SH-SY5Y cells were incubated with 10 μmol/L Forskolin (a PKA activator) for 12 h.The endogenous p-CREB,CREB,APP and GAPDH levels were determined by Western blotting assay.Quantitative data are presented as mean ±SE,n=4.**P<0.01vscontrol group;CREB:cAMP responsive element-binding protein;APP:amyloid precursor protein.

圖3 APP啟動子區CRE元件的分析及雙熒光素酶報告基因質粒的構建Fig.3 Analysis of CRE elements in APP promoter and construction of luciferase double reporter gene plasmids

A：The promoter of human APP gene was analyzed by matinspector software.There were four highly ranked CRE elements named as CRE 1 to 4 listed in the panel；B：According to their positions,we generated three deletion mutant forms of APP promoter；C：The APP promoter deletion mutants was amplified by PCR and cloned into pGL3 vectors.The plasmids were digested by restriction enzymes and subjected for agarose gel electrophoresis；APP:amyloid precursor protein；CRE：cAMP responsive element.

2.4 TSG對APP啟動子質粒轉染細胞中APP雙熒光素酶報告基因表達的影響

將pGL3/APP1～3質粒分別和pRL-TK質粒(作為內參)共同轉染至HEK-293FT細胞中，48 h后用熒光雙報告基因檢測系統分析APP啟動子區各截斷體中熒光素酶表達的情況。結果顯示，與對照組(pGL3空載體)相比，pGL3/APP1～3的熒光素酶表達量有不同程度的增高，其中含有CRE數目最多的APP1熒光素酶表達最高，表明含有CRE的APP啟動子區可以很好地驅動熒光素酶基因的表達，并且與CRE的量呈正相關(圖4)。TSG(100 μmol/L)與pGL3/APP1～3轉染細胞孵育48 h后，APP啟動子區驅動熒光素酶表達的能力有所下降，尤其是TSG對APP1組的抑制作用最為明顯，與未處理組相比差異有統計學意義(235.5±2.50vs177.0 ±4.00,P<0.01；圖4),而TSG對APP其他兩個截斷體2和3無顯著影響(P=0.21，P=0.11)，結果提示TSG可能影響CREB與CRE1和CRE2元件的結合。

圖4 TSG對APP啟動子質粒轉染細胞中APP雙熒光素酶報告基因表達的影響Fig.4 Effect of TSG on luciferase double reporter gene expression of APP in APP promoter plamid-transfected cells

The pGL3/APP or pGL3-basic vectors were transfected into HEK-293FT cells together with pRL-TK (as a reference).The drug treated groups were incubated with 100 μmol/L TSG since transfection.After 48 h,the cells were lysed,and luciferase activity assay was measured by luciferase double reporter gene system.Data were presented as mean ±SE,n=4.**P<0.01vsthe non-TSG treated pGL3/APP1 group.

3 討論

二苯乙烯苷(TSG)是中藥何首烏的主要有效成分。筆者以前的研究[10]結果顯示，TSG十二指腸給藥可在家兔血漿和腦脊液中檢測到，表明TSG能夠透過血-腦脊液屏障，這為TSG防治AD提供了可行性。本課題組自行研制的中藥5類新藥泰思膠囊(二苯乙烯苷)獲得國家食品藥品監督管理總局(China Food and Drug Administration,CFDA)臨床研究批件，已完成治療AD的Ⅱ期臨床試驗，證明有效安全，目前正在進行Ⅲ期臨床試驗。在臨床前藥效學研究中，本課題組在應用APP轉基因小鼠模型的實驗中發現，TSG灌胃給藥能夠改善模型鼠的學習記憶能力，減少腦顳葉皮質淀粉樣斑塊的數目和面積，減低皮質和海馬Aβ量；在體外實驗中，TSG能明顯抑制β分泌酶活性[7-9]。這些前期研究結果提示TSG與APP-Aβ通路關系密切。因此，在本實驗中筆者研究了TSG對神經細胞內APP表達的影響及其作用機制，發現TSG顯著抑制神經細胞內APP表達；進一步通過克隆APP啟動子區熒光素酶報告基因質粒，發現TSG可能通過影響CREB與CRE元件的結合，從而下調APP的表達。

CREB通過結合啟動子從而調節其下游基因的轉錄。CREB活性受其自身絲氨酸133位點磷酸化調控，該位點的磷酸化是由蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)調控的[11]。CREB在神經系統的作用至關重要，可參與學習記憶、細胞周期調控、神經元誘導分化等生理活動，還影響神經退行性疾病的發生發展[12-13]。作為細胞內的重要轉錄因子之一，已有研究[14-16]報道CREB調節與AD發病相關的多個基因的表達。由此提示，在AD的發病過程中，CREB通路活性的改變可能影響AD患者病理的進展。

本研究中，筆者發現隨著APP啟動子區CRE數目的減少，熒光素酶質粒的熒光強度也隨之下降，說明CRE元件對于APP表達至關重要。此外，TSG處理對于APP1的影響明顯大于其他兩個截斷體，這提示TSG對CRE1和CRE2的影響對APP表達更為重要，筆者推測TSG可能通過調節CREB與CRE元件的結合從而下調APP表達，這也將是筆者下一步需要探討和證實的問題。

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EffectsoftetrahydroxystilbeneglucosideonamyloidprecursorproteinexpressioninnervecellsanditsmechanismrelatedtoCREBregulation

Yin Xiaomin1,2,Xu Ting2,Dai Wufei2,Qian Jiayi2,Chen Chen1,Zhang Lan1,Li Lin1*

(1.DepartmentofPharmacology,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingEngineeringResearchCenterforNerveSystemDrugs,Beijing100053,China;2.DepartmentofBiochemistry,MedicalSchoolofNantongUniversity,Nantong226001,JiangsuProvince,China)

ObjectiveTo explore the effects of tetrahydroxystilbene glucoside (TSG) on the expression of amyloid precursor protein (APP) and its mechanism in cultured nerve cells.MethodsThe expression of APP and cAMP responsive element-binding protein (CREB) was detected by Western blotting assay.The CRE cis-elements of APP promoter were analyzed by Matinspector software.The plasmids expressing serial deletion mutants of APP promoter were constructed.The luciferase activity in cells was measured by luciferase double reporter gene system.ResultsActivation of CREB by Forskolin down-regulated APP expression in SH-SY5Y cells.The luciferase expression plasmids of APP promoter containing CRE elements were successfully constructed.TSG treatment decreased APP level in SH-SY5Y cells,and reduced luciferase activity of APP reporter gene containing CRE1 and CRE2 cis-elements in APP promoter plasmids-transfected cells.ConclusionTSG down-regulated APP expression in nerve cells,and its mechanism may be related to affecting the binding of CREB with CRE cis-elements.

tetrahydroxystilbene glucoside;amyloid precursor protein;cAMP responsive element-binding protein;Alzheimer’s disease

國家自然科學基金(81273498,81473373,81503077)，國家重大新藥創制重大專項(2015ZX09101016001)，江蘇省大學生創新訓練計劃項目(201610304095x)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81273498,81473373,81503077),National Science and Technology Major Project for New Drug Research and Development of China (2015ZX09101-016),Jiangsu Students’ Innovation and Entrepreneurship Training Program (201610304095x).

*Corresponding author，E-mail：linlixw@126.com

時間：2017-12-13 21∶25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2125.054.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.012]

R749.1

2017-10-01)

編輯 陳瑞芳