小鼠細胞差異表達蛋白SWATH定量方法的建立

胡 家 李慎濤 王勁松 李 蕾 殷愛紅*

(1.首都醫科大學中心實驗室，北京 100069；2.首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069)

·技術方法·

小鼠細胞差異表達蛋白SWATH定量方法的建立

胡 家1李慎濤1王勁松2李 蕾1殷愛紅1*

(1.首都醫科大學中心實驗室，北京 100069；2.首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069)

在生物學和臨床醫學研究中，基于質譜的蛋白質組學研究方法已成為一種強有力的工具[1-2]，目前，比較主流的蛋白質組學研究方案是使用液相色譜-串聯質譜聯用系統(liquid chromatograph with tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)，一次實驗可鑒定到上萬種蛋白質。在發現蛋白組學研究領域，穩定同位素標記和無標記相對定量的方法已被廣泛用于差異蛋白表達譜研究[3-4]，特別在最近一段時期，由于高分辨定量蛋白質組學的發展，一種基于數據非依賴采集(data-independent acquisition，DIA)模式的無標記定量方法，即SWATHTM(sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions)定量已成為新興的強大定量工具[5]。

本實驗中，提取實驗組和對照組小鼠骨髓細胞樣品蛋白質，進行基于超濾輔助樣品制備(filter-aided sample preparation，FASP)，采用液質聯用技術進行蛋白質鑒定，結合SWATHTM質譜采集技術，通過相關軟件分析數據，建立了一種對小鼠骨髓細胞樣品進行無標記差異定量的蛋白質組學研究方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1)實驗樣品：以2月齡的小鼠骨髓細胞為對照組，18月齡的小鼠骨髓細胞為實驗組，兩種細胞均由本實驗室提供。

2)主要試劑和儀器：尿素、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)和碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA)(Sigma公司，美國)；10 000超濾濃縮管(Millipore公司，美國)；胰蛋白酶(Promega公司，美國)；水、乙腈、甲醇、甲酸和三氟乙酸(Fisher公司，美國)。SpeedVac真空干燥機(Thermo公司，美國)；Easy-Nano LC液相色譜儀和Triple TOF6600質譜儀(Sciex公司，美國)；NanoDrop微量分光光度計(Thermo公司，美國)。

1.2 小鼠細胞蛋白質提取

[6-7] 的方法，向細胞沉淀中加入5倍體積的裂解液[含20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)、8 mol/L尿素、20 mmol/L DTT和蛋白酶抑制劑]，渦旋均勻，置于冰上裂解細胞2 h，期間用超聲破碎細胞(功率2 W、超聲時間2 s、間歇2 s、20個循環)，使樣品溶液澄清。將樣品置于高速離心機中4 ℃、40 000 g離心1 h。取離心上清、分裝、保存于-80 ℃，用NanoDrop微量分光光度計對裂解細胞總蛋白質進行定量。

1.3 細胞蛋白質酶切

按參考文獻[8]的方法，各取200 μg實驗組和對照組蛋白質樣品，加入DTT至終濃度10 mmol/L，37 ℃孵育2.5 h，使樣品中蛋白質的二硫鍵處于打開狀態，恢復至室溫，加入碘乙酰胺至終濃度50 mmol/L，避光放置40 min，對打開的二硫鍵進行烷基化保護。將樣品轉移至截留相對分子質量為10 000的超濾濃縮管中，10 000 g、20 ℃離心30 min，在超濾管中加入200 μL裂解液，10 000 g、20 ℃離心30 min，重復本步驟2～3次，徹底去除十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sutfate,SDS)等去污劑。在超濾管中加入200 μL 50 mmol/L NH4HCO3，10 000 g、4 ℃離心30 min，重復本步驟2～3次。換一個新的超濾管套管，在內管中加入150 μL 50 mmol/L NH4HCO3，再按照 蛋白：Trypsin=50∶1的比例加入酶液，37 ℃孵育16 h。10 000 g、4 ℃離心30 min，加入100 μL 50 mmol/L NH4HCO3，10 000 g、4 ℃離心30 min，重復該步驟3次，收集多肽樣品。最后，向樣品中加入終濃度1%(體積分數)的甲酸，凍干樣品。

1.4 液質聯用方法

將酶切樣品用A相溶液[含0.1%(體積分數)甲酸及2%(體積分數)乙腈]重溶后，經NanoDrop定量，18 000 g離心10 min，取4 μL上清進行納升級液相與Triple TOF 6600質譜聯用分析。色譜柱：C18除鹽柱(3 μm，120 ?，350 μm×0.5 mm)、C18分析柱(3 μm，120 ?，75 μm×150 mm)，柱溫為40 ℃，系統柱壓小于6 000 Psi；流速：300 nL/min；1 h分析梯度：0 min，5%(體積分數)B[B相溶液：含0.1%(體積分數)甲酸及98%(體積分數)乙腈]；0～0.1 min，5%～9% B；0.1～32 min，9%～22% B；32～48 min，22%～32% B；48～51 min，32%～40% B；51～51.1 min，40%～80% B；51.1～56 min，80% B；56～56.1 min，80%～5% B；56.1～60 min，5% B。質譜條件：ESI源、正離子掃描模式、噴霧電壓2.3 kV、離子源溫度150 ℃。蛋白質鑒定質譜掃描模式：一級全掃描，質荷比(mass to charge,m/z)范圍350～1 500；二級挑選40個強度高的前體離子進行誘導碰撞解離(collision induced dissociation,CID)；掃描范圍m/z 100～1 500，動態排除掃描，動態排除時間10 s。SWATH蛋白質定量模式：一級全掃描，m/z范圍350～1 500；二級掃描窗口根據蛋白質鑒定的液相TIC圖在m/z 400～1 225的范圍設置了60個可變二級掃面窗口，在前體離子密集時，使用窄質量數窗口，增強選擇性，在前體離子密度較低時，使用寬質量數窗口，以覆蓋更廣泛的前體離子；CID動態碎裂，依次均勻掃描。

1.5 數據處理

用Sciex提供的搜索引擎“Protein Pilot Software 5.0”對鑒定模式所產生的數據進行搜索，使用Uniprot Mus musculus數據庫(更新于2016年8月)，設置一級質量偏差10 ppm、二級質量偏差20 ppm，獲得置信度較高(假陽性率<1%)的譜圖庫。利用PeakView2.2軟件提取數據依賴采集方式(data dependent analysis,DDA)建立的譜圖庫中的母離子和碎片離子的保留時間，對相應SWATH產生碎片離子的保留時間進行匹配，提取相應肽段的碎片離子色譜峰，并根據色譜峰的強度和保留時間積分計算峰面積。PeakView2.2軟件中設定條件如下：每種蛋白質包含肽段數至少為10且是特有肽段;每種肽段的碎片離子(transition)為6;假陽性率設為10%;提取窗口6 min;在不同的洗脫時間內，選取豐度、峰形較好的肽段對其他肽段進行保留時間的校正。結果以報告的形式輸出，其中包含碎片離子峰面積、肽段峰面積和組裝成相應蛋白的峰面積。采用MarkView1.2軟件對數據進行差異分析，P>0.05可接受，t檢驗得出差異2倍以上的蛋白質。

2 結果

2.1 建立SWATHTM圖譜采集方法及小鼠細胞樣品的蛋白質離子文庫(ion library)

對實驗組和對照組2個樣品進行了酶切，將酶切后各樣品等量混合，上樣量為800 ng，進行60 min梯度液相色譜，質譜用數據依賴采集模式(DDA-MS)。采集結束后，依據本次實驗的液相總離子流圖(total ions chromatograph,TIC)(圖1)確定樣品合適的液相分離梯度，并在質荷比(m/z)400至1 225之間設置60個SWATHTM采集可變窗口，如圖2，在前體離子密集時，使用窄質量數窗口，增強選擇性，在前體離子密度較低時，使用寬質量數窗口以確保覆蓋更廣泛的前體離子。通過可變窗口的設置，期望采集到檢測范圍內所有前體離子和二級產物離子信息。由此建立本次實驗的SWATHTM采集方法。

圖1 蛋白質鑒定液相總離子流圖(TIC)Fig.1 Total ions chromatograph (TIC) of protein identification

圖2 設置60個SWATHTM采集窗口Fig.2 Set 60 SWATHTM acquisition windows

The blue line represents the ion density,the orange line represents the width of the variable windows；SWATHTM：sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions；m/z:mass to charge.

SWATHTM定量是一種質譜數據非依賴采集模式(DIA-MS)，并依賴二級質譜信息對蛋白質進行定量的方法。DDA-MS采集數據的質量較高，但SWATHTM采集的數據信息比DDA-MS要豐富一些[9]，因此通過DDA-MS采集數據建立SWATHTM定量的蛋白質離子文庫，并且為了確保SWATHTM定量分析不遺漏數據信息，將多次DDA-MS采集的小鼠樣品數據一并通過ProteinPilot軟件(Sciex)搜索Uniprot的Mus musculus蛋白質數據庫，共鑒定到3 043種蛋白質，將這些蛋白質多肽的二級質譜信息和液相離子保留時間構建成本次SWATHTM定量的蛋白質離子文庫。

2.2 SWATHTM采集

調用已建立的SWATHTM采集方法，每個樣品進3針，圖3為2個樣品的3次重復進樣TIC圖，橫坐標為質譜采集時間、縱坐標為樣品離子強度，彩色曲線為2個樣品各重復3次進樣的總離子流圖?？梢姌悠分貜托院?，且質譜檢測離子強度高、出峰很多，樣品制備和液相分離效果理想。

2.3 差異蛋白質鑒定

將SWATHTM數據經過PeakView2.2及MarkView1.2軟件分析，共鑒定到97種顯著表達差異2倍以上的蛋白質，如圖4，其中上調蛋白質43種，其中上調3倍以上的蛋白質有15種；下調蛋白質54種，其中下調0.3倍以上的蛋白質有16種，變化越明顯說明蛋白質表達差異越大。經過蛋白質功能分析顯示，鑒定的這些差異蛋白有一些與細胞衰老有關。本文重點介紹實驗方法，涉及所鑒定蛋白的具體數據將在另一篇文章詳細描述。

圖3 SWATHTM采集兩個樣品3次重復進樣的TIC圖Fig.3 TIC of 3 repeated injections of 2 samples with SWATHTM MSTIC：total ions chromatograph；MS:mass spectrometry.

圖4 SWATHTM定量兩個樣品的差異表達蛋白數Fig.4 Differentially expressed proteins identified by SWATHTM MSMS:mass spectrometry；SWATHTM：sequential windowed acquisition of all theoretical fragment ions.

3 討論

SWATHTM技術通過均勻掃描和采集檢測范圍內所有前體離子及二級產物離子信息，并依據二級產物離子峰面積進行蛋白質定量，能有效規避DDA定量模式中由于高豐度信號影響和動態排除等引起的定量靈敏度不高和重現性差等問題，同時提高了高分辨質譜的定量通量[10-11]。SWATHTM技術自2012年推出以來，在蛋白質組學研究中得到了廣泛的應用。Huang等[12]用SWATHTM采集方法對鼠細胞裂解液蛋白質組進行分析，在沒有進行樣品預分離的條件下，鑒定到3 600種蛋白質，并對這些蛋白質進行了絕對定量。Lambert 等[13]利用親和純化結合SWATHTM技術(AP-SWATHTMMS)研究蛋白質相互作用，能夠特異性地富集到靶蛋白的相互作用蛋白，實現了復合蛋白質的準確鑒定。Sidoli等[14]采用重標同位素標記組蛋白翻譯后修飾多肽，再用SWATHTM定量分析，檢測到組蛋白H3多肽豐度差異極大，跨越了4個數量級。由此可見TripleTOF質譜儀搭配SWATHTM采集模式分析樣品，可以全面、準確定量分析所獲得的二級質譜信息，在高通量蛋白質組學層面實現了與針對特定蛋白質定量質譜技術(如SRM等)相當的定量能力[10,15]。

本實驗以兩個樣品為例，介紹了一種大規模非標定量蛋白質的方法。通過對實驗組和對照組樣品進行FASP酶切，建立SWATHTM采集方法，對樣品各進行3次SWATHTM采集，通過軟件分析實驗結果，可一次性對兩組樣品的幾千種差異蛋白質進行定量分析。該實驗流程適用于多組樣品的高通量蛋白質組學定量分析，比如不同時間點、不同藥物、不同濃度試劑處理的樣品等等，由于版權所限不在此展示。

實驗流程中應用的高分辨質譜系統Triple-TOF 6600，搭載SWATHTM2.0采集技術，掃描速度快且質量數窗口可變。在前體離子密集時，使用窄質量數窗口，增強選擇性，在前體離子密度較低時，使用寬質量數窗口，以覆蓋更廣泛的前體離子。與傳統的LC-MS/MS系統方案相比，SWATHTM采集模式能夠將掃描區間內所有的肽段母離子經過超高速掃描并進行二級碎裂，從而獲得完整的肽段信息。在對大規模蛋白質進行定量分析時，無需對樣品進行預分離和標記，一次實驗能實現多組樣品中幾千種蛋白質的相對定量，省時省力并節省實驗成本。

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*Corresponding author，E-mail：yinhong87@sina.com

時間：2017-12-13 21∶09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2109.036.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.031]

2017-03-24)

編輯 陳瑞芳