非特異性精神發育遲滯患者外周血miRNA的差異表達及臨床診斷價值

閆 妍 高 慧 呂珍蘇 陸如平 盛嘉玲

中國.上海市民政第一精神衛生中心 201105 E-mail:yanyan19820407@163.com

非特異性精神發育遲滯患者外周血miRNA的差異表達及臨床診斷價值

閆 妍 高 慧 呂珍蘇 陸如平 盛嘉玲

中國.上海市民政第一精神衛生中心 201105 E-mail:yanyan19820407@163.com

目的:研究非特異性精神發育遲滯患者外周血miRNA的差異表達及其診斷價值。方法:檢索國內外文獻篩選與非特異性精神發育遲滯相關的10種miRNA,按照病歷號隨機選取30例非特異性精神發育遲滯患者作為病例組,同時按照體檢號入組30例身心健康者作為對照組,入組后抽取靜脈血5ml,運用實時熒光定量PCR技術檢測病例組和對照成員10種miRNAs的表達水平。結果:①病例組與對照組比較年齡、性別、城鄉、獨生子女無統計學差異(P＞0.05);②病例組與對照組比較miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363表達水平有統計學差異(P＜0.05);③ROC分析發現,miRNA-222(AUC=0.786,P=0.043)、miRNA-223(AUC=0.833,P=0.008)對特異性精神發育遲滯有一定的診斷價值。結論:miRNA-222和miRNA-223的異常表達對非特異性精神發育遲滯有一定的診斷作用,可能與非特異性精神發育遲滯的發病機制有明顯關聯。

非特異性精神發育遲滯;微小RNA;實時熒光定量PCR;外周血

精神發育遲滯按照臨床特征可分為非特異性精神發育遲滯(non—specific MR,NSMR)和智力低下伴有畸形(Specific MR,SMR)這兩大類。SMR患者智力低下與畸形有明顯關聯,NSMR只是智力低下,不伴有畸形,目前確切的病因不明。目前認為,NSMR病因復雜,與環境和遺傳基因有明顯關聯,其中遺傳是最主要的因素[1-2]。MiRNA屬于內源性非編碼RNA家族。約21～25個核苷酸長度,其基因轉錄初級產物(pri-miRNA)在核內被RNaseⅢ內切酶家族的Drosha酶切割成約70nt的發夾狀前體(pre-miRNA),轉運出核后。又被Droer酶切割成約22nt的miRNA,形成成熟miRNA。MiRNA具有較強的發育時序特異性[3]和組織特異性[4],在精神疾病的發生發展過程中起著重要的作用[5]。本研究選取30例非特異性精神發育遲滯患者和30例健康對照者進行研究,分析miRNA在非特異性精神發育遲滯患者外周血中的差異表達,并進一步分析差異表達的miRNA對非特異性精神發育遲滯的診斷價值,以期為非特異性精神發育遲滯的研究提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 病例組 為2011年9月-2012年10月確診為非特異性精神發育遲滯的患者,符合以下入組標準和排除標準。入組標準:由兩名精神學專家及心理學專家等組成的小組進行病例討論,精神發育遲滯的診斷要求符合ICD-10診斷標準,同時IQ小于60分。排除標準:①存在明確圍生期腦損傷史;②存在明確腦缺氧、缺血、中樞神經系統感染及頭顱外傷等病史;③染色體核型存在異常;④經體檢、生化代謝及頭顱影像學檢查等發現已知遺傳代謝性疾病及遺傳眭神經變性疾病線索;⑤男性患兒存在脆性x綜合征的典型臨床表現;⑥母孕期間存在明確酗酒、吸毒等不良嗜好病史;⑦合并其他精神疾病;⑧合并其他重大軀體疾病。按照上述入組標準和排除標準入組非特異性精神發育遲滯30例。

1.1.2 對照組 為當地醫院體檢證實為身心健康的人員。入組30例,均為漢族。

本研究獲得本院醫學倫理委員會批準,所有受試者或受試家屬(監護人)均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及逆轉錄 收集2 ml病人全血,放入抗凝管中。按照1:1比例,將血液緩慢加入Ficoll分離液中,2000rpm離心20min,收集單核細胞層。用PBS清洗單核細胞兩遍,加入1ml Trizol,用移液器吸打幾次。Trizol的用量應根據培養板面積而定,不取決于細胞數。Trizol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。將勻漿樣品在室溫(15～30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。每使用1ml Trizol加入0.2ml氯仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置5分鐘。2～8℃13000×g離心15分鐘。樣品分為3層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用Trizol試劑的60%。把水相轉移到新管中,如要分離DNA和蛋白質可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1m L Trizol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。2～8℃13000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。用100%乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml 100%乙醇。2～8℃不超過7500×g離心5分鐘,棄上清。室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5～10分鐘即可,不要真空離心干燥,過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25～200μl無RNase的水或0.5%SDS,用槍頭吸打幾次,55～60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應,勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲酰胺溶解, -70℃保存。取1μl RNA加入99μl dd H2O中,測定A260和A280處的吸光光度值,A260/A280必須介于1.9～2.0之間才可以進行逆轉錄。

1.2.2 實時定量PCR驗證篩選的miRNA 使用TaqmanmiRNAPCRAssays進行miRNA反轉錄和熒光定量PCR檢測,具體操作按照試劑盒說明書進行,檢測儀器為ABI 7900 HT熒光定量PCR儀,熒光定量PCR反應條件為:95℃10 min,然后95℃15 S、60℃1 min,40個循環。

1.3 統計處理

全部數據使用SPSS 20.0、MedCalc12.70統計軟件進行統計分析和作圖。以miRNA與內參U6之間閾值環(threshold cycle,Ct)之差計算ΔCT值,作為統計分析的指標。對照和病例組一般情況除年齡采用獨立樣本t檢驗外,其它變量采用卡方檢驗;病例組和對照組miRNA表達水平的比較采用獨立樣本秩和檢驗,對差異表達的miRNA進一步構建ROC曲線,分析其對特異性精神發育遲滯的診斷價值。所有統計分析均為雙側顯著性檢驗,以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 病例組與對照組一般情況的描述和比較

采用獨立樣本t檢驗比較病例組和對照組年齡,結果表明,病例組和對照組的年齡無統計學差異(t=0.279,P=0.782);運用卡方分析比較病例組和對照組性別、城鄉、獨生子女的分布,結果表明,病例組和對照組的性別、城鄉、獨生子女分布無統計學差異(P＞0.05)。

表1 病例組和對照組一般情況比較(±s,n)

表1 病例組和對照組一般情況比較(±s,n)

項 目 病例組(n=30)對照組(n=30)t/χ2P年齡(歲) 31.49±10.86 30.61±11.32 0.279 0.782性別(女/男) 18/12 14/16 0.603 0.438城鄉(城市/農村) 13/17 18/12 1.068 0.301獨生子女(是/非) 16/14 13/17 0.267 0.605

2.2 特異性精神發育遲滯患者與正常人的miRNA表達水平比較

對篩選出的10種miRNA,采用兩獨立樣本的秩和檢驗分析其在病例組和對照組間的差異,表2表明,miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363的表達有統計學差異(P＜0.05),miRNA-1、miRNA-1207-5p、miRNA-1228-5p、miRNA-3141、miRNA-4507的表達無統計學差異(P＞0.05)。

2.3 差異表達的miRNA對非特異性精神發育遲滯的預測價值

分別以非特異性精神發育遲滯患者外周血中差異表達的miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363為檢測變量,試驗分組為狀態變量(對照組為0,病例組為1),構建ROC曲線,見表3和圖1。miRNA-222和miRNA-223對非特異性精神發育遲滯有一定的診斷價值(P＜0.05),miRNA-125b、miRNA-132和miRNA-363對非特異性精神發育遲滯的診斷價值不明顯(P＞0.05)。

表2 病例組與對照組miRNA表達水平比較(±s)

表2 病例組與對照組miRNA表達水平比較(±s)

miRNA 病例組(n=30)對照組(n=30)Z P miRNA-1 4.023±1.587 5.573±3.786-0.767 0.443 miRNA-125b 5.410±1.380 7.962±3.747-2.043 0.041 miRNA-132 3.485±1.382 7.084±3.590-2.155 0.031 miRNA-222 2.344±1.400 6.038±3.060-3.915＜0.001 miRNA-223 -2.686±1.406 5.147±2.653-4.086＜0.001 miRNA-363 4.124±1.273 6.655±3.161-2.383 0.017 miRNA-1207-5p-0.218±0.116 1.240±0.247-1.873 0.061 miRNA-1228-5p-1.336±0.211-1.397±0.838 0.000 1.000 miRNA-3141 0.113±0.350 0.223±0.900 0.000 1.000 miRNA-4507 1.295±0.795 2.625±1.413-0.511 0.610

表3 差異表達的miRNA對非特異性精神發育遲滯的預測價值

圖1 非特異性精神發育遲滯患者外周血差異表達miRNA的ROC曲線

3 討 論

精神發育遲滯(mental retardation,MR)是一組在中樞神經系統發育成熟(18歲)以前起病,依據目前研究發現生物、社會和心理因素是造成患者智力發育低于一般常人的主要因素,其中生物因素占79.2%[6]。MR是造成我國耳洞殘疾的首要影響因素,該疾病不僅對我國人口素質提高不利,還給家庭、社會、國家帶來沉重的負擔。非特異性精神發育遲滯(NSMR)又稱非特異性弱質,是指不伴隨其它臨床體征的單純性智力低下。對NSM的患病程度進行過分析發現,NSMR存在著明顯的遺傳異質性,遺傳占主要因素[7]。

miRNA在生物的各種生命過程中發揮著重要的調節功能,如調節細胞發育的時序調控過程,參與細胞增殖、分化和凋亡,同時在造血系統、神經系統的模式形成等過程中也扮演著重要的角色。miRNA在腦皮層發育過程中起著關鍵作用,大腦皮層發育過程中細胞增殖、傳導通路的建立以及區域性分化均有miRNA參與并調控[8-9]。由此可見,miRNA在大腦發育過程中起著至關重要的調控作用。miRNA與神經細胞的分化也有著密切相關,miRNA可以從細胞分化的起始就調控祖細胞分化為特定的神經細胞,還能維持該神經細胞的特征。有研究表明,miRNA不僅參與多種神經功能調節[10],還與突觸可塑性有關[11]。由于MiRNA在神經系統發育分化以及神經系統功能調節和突觸可塑性方面起著重要作用,因此MiRNA表達和調控的異常可能與精神發育遲滯的發生發展有著密不可分的關系。脆性x綜合征與脆性X智力低下蛋白(FMXP, Fragile X MentalRetardation Protein)的缺失有明顯關聯,外周血淋巴細胞FMRP免疫細胞化學檢測是兒童脆性X綜合征的一種可靠診斷和篩查方法[12]。研究發現,FMRP可以通過某些特殊的m RNAS來調節miRNA[13],如miRNA-1和miRNA -281。唐氏綜合征即21三體綜合征,對唐氏綜合征的研究發現,與21號染色體來源有明顯關聯的miRNAs可能引起患者腦部神經生化的異常,21號染色體來源的miRNA失活可能是導致唐氏綜合癥的主要原因[14]。

本研究發現,非特異性精神發育遲滯患者外周血中的表達有統計學差異,在非特異性精神發育遲滯患者外周血中miRNA-125b、miRNA-132、miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363顯著上調。這5種miRNA與非特異性精神發育遲滯的發生和發展可能有明顯關聯。有研究發現,脆性X智力低下蛋白(FMRP)可以通過miRNA-125b、miRNA-132調節突觸的結構與精神發育遲滯的發生有明顯關聯[15]。Chen等人選取464名非特異性X連鎖精神發育遲滯患者進行研究發現,與正常對照者比較x染色體相關聯miRNAs(miRNA-222、miRNA-223和miRNA-363)的核苷酸序列有明顯改變,這些改變可能與患者智力低下有關[16]。趙林[17]等人,通過miRNA芯片掃描和選取部分差異表達的miRNA進行PCR驗證發現,非特異性精神發育遲滯患者外周血中miRNA-664a-5p,miRNA-1207-5p,miRNA-3141,miRNA-1228-5p,miRNA-4505顯著上調。本研究與正常對照者比較,非特異性精神發育遲滯患者外周血中miRNA-1207-5p,miRNA-3141和miRNA -1228-5p沒有明顯改變,可能與本研究選取的樣本是成人,而上述研究選取的是兒童有關,具體機制有待進一步研究。

為了探究差異表達的miRNA對非特異性精神發育遲滯的診斷價值,本研究進一步構建ROC曲線,結果發現:miRNA-222和miRNA-223對非特異性精神發育遲滯有一定的診斷價值,當miRNA-222≤2.788CT時,約登指數的最大值0.583,此時的敏感度為58.3%,特異度為100.0%;當miRNA-223≤-2.275CT時,約登指數的最大值0.667,此時的為敏感度66.7%,特異度為100.0%。該研究結果進一步證實了,miRNA-222和miRNA-223在非特異性精神發育遲滯中可能扮演著重要的角色,具體作用機制有待進一步研究。

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http://www.cjhp.com.cn/

The Differential Expression of MiRNA in Peripheral Blood of Patients with Non-specific Mental Retardation and Its Clinical Diagnostic Value

YAN Yan,GAO Hui,LV Zhensu,et al
First Mental Health Center of Shanghai Civil Ddministration,Shanghai 201105,China

Objective:To research the differential expression of miRNA in the peripheral blood of the non-specific mental retardation patients and analyze its diagnostic value for non-specific mental retardation.Methods:30 nonspecific mental retardation patients and 30 healthy controls were selected to measure the 10 miRNAs chosen from the domestic and international literature by real-time fluorescence quantitative PCR.Results:①There were no significant differences in age,gender,urban and rural between the control group and the case group(P＞0.05).②Compared with contrals,the expression levels of miRNA-125b,miRNA-132,miRNA-222,miRNA-223 and miRNA -363 were significant different in patients with non-specific mental retardation(P＜0.05);③ROC analysis showed that miRNA-222(AUC=0.786,P=0.043),miRNA-223(AUC=0.833,P=0.008)could be used to distinguish non-specific mental retardation patients from healthy controls.Conclusion:The abnormal expression of miRNA-222 and miRNA-223 may have some diagnostic value to non-specific mental retardation,which may be related to the pathogenesis of non-specific mental retardation.

Non-specific mental retardation;MiRNA;Real-time fluorescence quantitative PCR;Peripheral blood

R749.05

A

1005-1252(2017)01-0004-04

10.13342/j.cnki.cjhp.2017.01.002

2016-08-06)