CDKN2B-AS1基因多態性與女性早發冠心病的相關性研究

喬琳，文星艷，竇克非，尹棟，宋衛華，張禪那，孫凱，惠汝太，王虹劍

冠心病研究

CDKN2B-AS1基因多態性與女性早發冠心病的相關性研究

喬琳，文星艷，竇克非，尹棟，宋衛華，張禪那，孫凱，惠汝太，王虹劍

目的：探討CDKN2B-AS1 基因位點rs4977574單核苷酸多態性（SNP）與女性早發冠心病的相關性。 方法：采用病例對照研究，連續入選女性早發（＜65歲發病）冠心病患者226例（病例組）和同期冠狀動脈造影陰性、年齡匹配的女性患者79例（對照組），采用小測序法（SNaPshot技術）檢測CDKN2B-AS1基因位點rs4977574多態性，同時測定血漿中總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）、血尿酸（UA）、空腹血糖（FPG）及糖化血紅蛋白（HbA1c）水平，評估rs4977574多態性與上述生物標志物的相關性。 結果：與對照組相比，病例組血TG、UA、FPG、HbA1c水平明顯升高（P＜0.05），校正年齡、體重指數、相關病史及危險因素后，高HbA1c（HbA1c＞6.2%）明顯增加女性早發冠心病的發生風險（OR=3.35，95%CI：1.41～8.00，P=0.006）； rs4977574基因型及等位基因頻率在病例組和對照組中分布有顯著差異（P＜0.05），病例組等位基因G頻率明顯高于對照組（OR=1.24，95%CI：1.05～1.48，P=0.019）。進一步分析發現，rs4977574多態性與高HbA1c相關；與AA基因型受試者相比，（GG+GA）基因型受試者中高HbA1c的發生率明顯增加（OR=2.08，95%CI：1.11～3.89，P=0.022）。 結論：CDKN2B-AS1基因SNP位點rs4977574多態性與女性早發冠心病相關，并與高HbA1c相關。

冠狀動脈疾病；基因；女（雌）性

臨床上將女性冠心病發病時年齡不超過65歲，稱為早發冠心病[1]。目前針對女性早發冠心病的研究相對較少，其相關危險因素及發病機制尚不明確。遺傳易感性是冠心病發生的獨立危險因素，研究易感基因多態性與女性早發冠心病的相關性，對于揭示女性早發冠心病的發病機制具有重要意義。既往研究發現，9p21染色體與冠心病發病的遺傳機制緊密相關[2]。其中，9p21.3區域中CDKN2B-AS1 基因單核苷酸多態性（SNP）位點rs4977574與冠心病的相關性在歐洲人群中已經得到證實[3]，但在國內少有文獻報道。本研究旨在探討CDKN2B-AS1 基因多態性與女性早發冠心病及其臨床特點的相關性。

1 資料與方法

研究對象：2014-01至2015-12期間連續入選因胸痛在中國醫學科學院阜外醫院住院并接受擇期冠狀動脈造影的女性患者305例。患者年齡均＜65歲，其中早發冠心病患者226例（病例組），入選標準：經冠狀動脈造影證實左主干狹窄＞30%或其他3支（前降支、回旋支、右冠狀動脈）及其主要分支中至少1支冠狀動脈狹窄≥50%；另有79例經冠狀動脈造影證實血管無病變（對照組）。排除標準：惡性疾病、嚴重腎功能衰竭、肝功能障礙、嚴重瓣膜病、心肌病、血液病、妊娠和急性感染。所有研究對象均于入院后詳細記錄一般特征、心血管病相關危險因素及疾病史。經由中國醫學科學院阜外醫院倫理委員會批準本項研究。

實驗室檢查指標測定：所有研究對象于冠狀動脈造影前空腹（8小時以上）采集外周靜脈血。總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）、尿酸（UA）、空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）等血液生化指標用血生化分子分析儀AUS5400（奧林巴斯，日本）進行測定。其中高TG定義為TG水平＞1.76 mmol/L，高UA定義為血UA水平＞416.5μmol/L，高FPG定義為FPG水平＞6.1 mmol/L，高HbA1c定義為HbA1c水平＞6.2%。

DNA提取及基因SNP檢測：采集生化指標檢測用血同時，使用EDTA抗凝真空采血管采集4ml外周血，應用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血DNA，-80℃保存。SNP檢測采用分型技術（SNaPshot技術，也稱小測序），首先將包含目的SNP位點的基因片段擴增，然后通過延伸反應將SNP位點堿基再次擴增（二次擴增）。延伸反應中引物延伸一個堿基即終止，經測序儀檢測，根據峰的顏色得知摻入的堿基種類，從而確定樣本基因型。擴增反應：以DNA為模板擴增含有SNP位點的DNA片段，使用引物為F：GGGTTATGGGAAATGCCATG，R：TTGCTGAAGGGACTCAATGAGAG，聚合酶鏈式反應（PCR）總反應體系10 μl，包含2.5倍標準緩沖液Ⅳ 4 μl，10～20 ng/μl DNA 液 2 μl，5 μmol引物 1.5μl，5U/ μl卡帕熱啟動 DNA 聚合酶 0.15 μl，蒸餾水補齊至 10 μl，反應條件為 95℃、5 min；95℃、30 s，53℃、30 s，72℃、30 s，30 個循環；72℃，10 min。擴增產物質檢：取2 μl上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳。擴增產物純化：于15 μl PCR產物中加入5 μl蝦堿性磷酸酶和2 μl核酸外切酶Ⅰ，純化程序為37℃、1.0 h，75℃、20 min。延伸反應（二次擴增）：使用引物為F：GGGTACATCAAATGCATTCTATAGC，總反應體系5 μl，包含純化后擴增產物 1.2 μl，0.2 μmol/L 引物混合物2 μl，熒光混合物0.5 μl，10倍標準緩沖液I 0.4 μl，蒸餾水補齊至 5 μl，反應條件為 96℃、10 s，53℃、5 s，60℃、30 s，30個循環。延伸產物純化：取延伸反應產物10 μl，加入1 μl小牛腸堿性磷酸酶，純化程序為37℃、1.0 h，75℃、15 min。DNA測序儀測序：96孔板中每孔加入分子量內標和甲酰胺混合液（0.5：8.5）9 μl，延伸反應純化產物 1.0 μl，總體積10 μl，95℃變性5 min，迅速冰冷4 min，于ABI 3730XL型DNA序列檢測儀上進行毛細管電泳。

統計學分析：應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計數資料以頻數和百分比表示，計量資料以平均值±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗或χ2檢驗。Hardy-Weinberg平衡檢驗、各組間基因型頻率分布和等位基因頻率分布比較使用χ2檢驗。危險因素分析應用多元Logistic回歸，把年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病病史、吸煙史、飲酒史作為校正因素引入分析。雙側P值＜0.05視作差異有統計學意義。

2 結果

兩組受試者的一般臨床特征比較（表1）：本研究共入選研究對象305例，其中病例組226例，對照組79例。兩組在年齡、體重指數、TC、LDL-C及HDL-C等方面的差異均無統計學意義（P均＞0.05）。與對照組相比，病例組高血壓病、高脂血癥及糖尿病的患病率明顯增高，血壓、TG、UA、FPG及HbA1c水平亦明顯升高，差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

表1 兩組受試者的一般臨床特征比較

表1 兩組受試者的一般臨床特征比較

注：1 mmHg=0.133 kPa

生物標志物與女性早發冠心病的相關性分析（表2）：校正年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病史、體重指數、早發冠心病家族史、吸煙史和飲酒史后，高 HbA1c（OR=3.35，95%CI：1.41～8.00，P=0.006） 和 高 FPG（OR=3.49，95%CI：1.38～8.84，P=0.008）明顯增加女性早發冠心病的發生風險。

表2 生物標志物與女性早發冠心病的相關性分析[例(%)]

兩組受試者rs4977574基因型和等位基因頻率分布：兩組經擬合優度χ2檢驗均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。病例組rs4977574的GG、GA、AA3種基因型分布與對照組比較（30.5% vs 22.8%；50.4% vs 44.3%；19.0% vs 32.9%），差異有統計學意義（P=0.036）；病例組等位基因G頻率明顯高于對照組（55.8% vs 44.9%，P＜0.05）。

rs4977574基因多態性與女性早發冠心病的相關性分析：校正年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病史、體重指數、早發冠心病家族史、吸煙史、飲酒史等潛在混雜因素后，（GG+GA）基因型受試者相對于AA基因型受試者發生早發冠心病的風險升高（OR=1.87，95%CI：1.03～3.39，P=0.040）；攜帶等位基因G的受試者發生早發冠心病的風險明顯增加（OR=1.24，95%CI：1.05～1.48，P=0.019）。

rs4977574多態性與生物標志物的相關性分析（表3）：進一步分析rs4977574多態性與TG、UA、FPG及HbA1c等生物標志物之間的關系發現，rs4977574多態性與高HbA1c顯著相關。在全部研究對象中，（GG+GA）基因型（236例）和AA基因型（69例）的HbA1c水平分別為（6.48±1.38）% 和（6.30±1.44）%，差異無統計學意義（P＞0.05）；校正年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病史、體重指數、早發冠心病家族史、吸煙史、飲酒史后，（GG+GA）基因型受試者出現高HbA1c的風險明顯增高（OR=2.08，95%CI：1.11～3.89，P=0.022）。

表3 rs4977574多態性與生物標志物的相關性分析

表3 rs4977574多態性與生物標志物的相關性分析

注：HbA1c：糖化血紅蛋白；FPG：空腹血糖；UA：血尿酸；TG：甘油三酯。-：無。校正因素：年齡、高血壓病史、高脂血癥病史、糖尿病史、體重指數、早發冠心病家族史、吸煙史、飲酒史

3 討論

本研究發現，CDKN2B-AS1基因位點rs4977574多態性與女性早發冠心病相關，攜帶等位基因G的女性更易發生早發冠心病；另外，SNP位點rs4977574多態性與血糖水平相關，（GG+GA）基因型受試者中高HbA1c的發生率明顯增加。因為高HbA1c和高FPG可增加女性早發冠心病的發生風險，我們推測rs4977574多態性可能通過影響血糖代謝而與女性早發冠心病易感性相關。

本研究目標基因CDKN2B-AS1位于9p21.3染色體上，該基因全長126.3kb，可轉錄成一段長約3834bp的與INK4b-ARF-INK4a基因座呈轉錄反義方向的RNA，即ANRIL。相關研究表明，含有風險SNP位點的外周血單核巨噬細胞內CDKN2BAS1 基因表達水平升高，并可發生細胞增殖、黏附增加等能導致動脈粥樣硬化形成的生物學行為[4]。

國內外研究發現，CDKN2B-AS1基因多態性（rs4977574）可能參與冠心病的發生、發展。Rivera等[5]和Pechlivanis等[6]針對加拿大和部分歐洲人群開展的研究顯示，SNP位點rs4977574與冠心病的嚴重程度以及糖尿病相關。在中國人群中，rs4977574與心肌梗死密切相關[7]。黃毅[8]對浙江寧波漢族人群的研究發現，rs4977574與冠心病顯著相關，且在該地區65歲以下女性人群中表現出了高致病風險（基因型P=0.01, 等位基因P=0.01, OR=1.70）。這與本研究結果相似。然而，rs4977574參與冠狀動脈粥樣硬化特別是女性早發冠心病發生、發展的機制尚不清楚。周香等[9]對早發冠心病與晚發冠心病危險因素的研究顯示，血糖代謝異常（OR=1.98）增加早發冠心病的風險。既往關于女性早發冠心病的研究表明，高HbA1c水平是發病的危險因素（OR=4.341）[10]。另有研究推測，糖尿病、高脂血癥可通過引起外周血白細胞端粒縮短而與早發冠心病相關[11]。本研究發現，rs4977574多態性與HbA1c水平相關，推測rs4977574多態性可能參與血糖代謝的調節。有研究發現，受風險SNP位點的影響，CDKN2B-AS1 基因的某些特定轉錄產物可調節ADIPORl、VAMP3、C11ORF10等基因的表達，而上述基因在血糖、血脂等代謝活動調控中發揮重要作用[12]。由此我們推測，rs4977574可能通過相關信號通路影響血糖代謝而參與女性早發冠心病的發生、發展。

綜上所述，CDKN2B-AS1基因rs4977574多態性與女性早發冠心病相關，等位基因G是女性早發冠心病的易感基因，SNP位點rs4977574多態性與血糖水平相關，攜帶等位基因G的患者更易出現血糖水平升高。

本研究存在一定的局限性。首先，本研究采取連續入選的方式入選住院進行冠狀動脈造影的女性患者，研究對象較少，樣本量相對有限，有可能使結果的外推有一定局限性；其次，本研究入選病例大多為居住在北方地區的漢族人群，不能排除地域分布、種族差異對基因多態性造成的影響；第三，本研究為橫斷面研究，只能探討基因多態性和疾病的相關性而不能推出因果關系。

因此，我們計劃在今后的研究中進一步擴大樣本量，在不同種族的人群中進行驗證，并完成病例隨訪，以明確CDKN2B-AS1 基因多態性、相關生物標志物與女性早發冠心病患者遠期預后的關系，為女性早發冠心病的發現和治療提供更多的理論依據。

[1] National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel. Third report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on detection, evaluation, and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel III) final report. Circulation, 2002,106: 3143-3421.

[2] Roberts R, Stewart AF. 9p21 and the genetic revolution for coronary artery disease. Clin Chem, 2012, 58: 104-112.

[3] Helgadottir A, Thorleifsson G, Manolescu A, et al. A common variant on chromosome 9p21 affects the risk of myocardial infarction. Science,2007, 316: 1491-1493.

[4] Holdt LM, Hoffmann S, Sass K, et al. Alu elements in ANRIL noncoding RNA at chromosome 9p21 modulate atherogenic cell functions through trans-regulation of gene networks. PLoS Genet, 2013, 9:e1003588.

[5] Rivera NV, Carreras-Torres R, Roncarati R, et al. Assessment of the 9p21. 3 locus in severity of coronary artery disease in the presence and absence of type 2 diabetes. BMC Med Genet, 2013, 14: 11.

[6] Pechlivanis S, Mühleisen TW, M?hlenkamp S, et al. Risk loci for coronary artery calcification replicated at 9p21 and 6q24 in the Heinz Nixdorf Recall Study. BMC Med Genet, 2013, 14: 23.

[7] Wang Y, Wang L, Liu X, et al. Genetic variants associated with myocardial infarction and the risk factors in Chinese population. PLoS One, 2014, 9: e86332.

[8] 黃毅. 多個候選基因單核苷酸多態性與冠心病的關聯分析. 寧波:寧波大學, 2013.

[9] 周香, 施尚鵬, 曾力群. 早發冠心病與晚發冠心病的危險因素及冠狀動脈病變特點比較. 中國循環雜志, 2017, 32: 638-641.

[10] 付麗, 吳其明, 宋毓青, 等. 女性早發冠心病相關危險因素分析.心肺血管病雜志, 2016, 35: 29-33.

[11] 田然, 張磊楠, 張婷婷, 等. 外周血白細胞端粒長度與早發冠心病的相關性及其影響因素分析. 中國循環雜志, 2016, 31: 541-545.

[12] Bochenek G, H?sler R, El Mokhtari NE, et al. The large non-coding RNA ANRIL, which is associated with atherosclerosis, periodontitis and several forms of cancer, regulates ADIPOR1, VAMP3 and C11ORF10. Hum Mol Genet, 2013, 22: 4516-4527.

Correlation Study Between CDKN2B-AS1 Gene Polymorphism and Female Premature Coronary Artery Disease Occurrence

QIAO Lin, WEN Xing-yan, DOU Ke-fei, YIN Dong, SONG Wei-hua, ZHANG Chan-na, SUN Kai, HUI Ru-tai, WANG Hong-jian.
Department of Cardiology, National Center for Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037),China

WANG Hong-jian, Email: wanghongjianfw@hotmail.com

Objective:To explore the relationship between single nucleotide polymorphism (SNP) rs4977574 in CDKN2B-AS1 gene and female premature coronary artery disease (pCAD) occurrence.

Methods: Our research included 2 groups: pCAD group, n=226 consecutive patients≤65 years of age and Control group,n=79 subjects with matched age,without CAD. The genotype of CDKN2B-AS1 SNP rs4977574 was detected by SNaPshot.Blood levels of total cholesterol (TC), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C), high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C), triglycerides (TG), uric acid (UA), fasting plasma glucose (FPG) and glycosylated hemoglobin (HbA1c) were examined; relationships between rs4977574 polymorphism and the above parameters were assessed.

Results: Compared to Control group, pCAD group had increased blood levels of TG, UA, FPG and HbA1c, P＜0.05.With adjusted age, body mass index (BMI), relevant disease history and risk factors, elevated HbA1c (HbA1c＞6.2%)obviously increased the risk of female pCAD occurrence (OR=3.35, 95%CI 1.41-8.00, P=0.006). The genotype and allele frequency of rs4977574 were different between pCAD group and Control group, P＜0.05. Compared to Control group, pCAD group had the higher frequency of G allele(OR=1.24, 95%CI 1.05-1.48, P=0.019); further analysis found that rs4977574 polymorphism was related to high HbA1c. Compared to AA genotype, GG+GA genotype had the increased incidence of high HbA1c(OR=2.08, 95%CI 1.11-3.89, P=0.022).

Conclusion: CDKN2B-AS1 SNP rs4977574 was related to female pCAD occurrence and it was also related to high HbA1c.

Coronary artery disease; Gene; Female

國家自然科學基金青年科學基金項目（81300156）；協和青年基金和中央高校基本科研業務費專項資金（3332015103）

100037 北京市，北京協和醫學院 中國醫學科學院 國家心血管病中心 阜外醫院 心內科

喬琳 碩士研究生 研究方向：女性早發冠心病 Email:1262796884@qq.com 通訊作者：王虹劍 Email: wanghongjianfw@hotmail.com

R54

A

1000-3614（2017）12-1154-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.12.003

(Chinese Circulation Journal, 2017, 32:1154.)

2017-05-04）

（編輯：朱柳媛）