載脂蛋白J在大鼠頸動脈再狹窄模型中表達規律的研究

楊寧，蘇斌，寇璐，董博，李楊，楊靖宇，秦勤

基礎與實驗研究

載脂蛋白J在大鼠頸動脈再狹窄模型中表達規律的研究

楊寧，蘇斌，寇璐，董博，李楊，楊靖宇，秦勤

目的：研究載脂蛋白J（Apo J）在大鼠頸動脈球囊擴張后血管再狹窄模型中的表達規律。 方法：40只Wistar大鼠隨機分為兩組：實驗組和對照組，每組20只。采用2F Fogarty球囊導管于右側頸總動脈進行球囊拉傷造模，術后1、2、3、4周共四個時間點，每組每個時間點5只大鼠。在各時間點，取右側頸總動脈后，采用蘇木伊紅染色法（HE）觀察其形態學變化，免疫組化檢測Apo J蛋白表達，實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測Apo J 基因的表達水平。 結果：與對照組各時間點相比，實驗組在相同時間點內膜增生明顯，Apo J蛋白及基因表達明顯上調（P＜0.05）；且實驗組隨著損傷時間延長，內膜持續增生至第四周達到最大值，Apo J蛋白及基因表達在第3周達到高峰，第4周有所下降（P＜0.05）。 結論：Apo J可能與血管損傷及損傷后內膜增生密切相關，血管中高表達的Apo J主要來源于損傷組織局部的血管平滑肌細胞（VSMC）合成，推測它可能是損傷后的一種代償，通過抑制VSMC的增值和遷移的活性對再狹窄起保護作用。為尋找新的經皮冠狀動脈介入治療術后血管再狹窄的干預提供新的靶點。

載脂蛋白J 類；頸動脈狹窄；內膜增生

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1222.)

冠心病是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病，其發病率和死亡率亦逐年攀升[1]。目前，經皮冠狀動脈腔內血管成形術（PTCA）是治療冠心病的有效方法之一，但其再狹窄率高達40%，嚴重影響了PTCA的遠期療效[2]。 雖然藥物洗脫支架（DES）及聯合雙聯抗血小板的藥物治療在某種程度上極大的降低了經皮冠狀動脈介入治療（PCI）后血管再狹窄的發生[3]，但是，DES置入術后患者再狹窄的發生率仍高于10%[4]。DES球囊損傷誘導血管平滑肌細胞遷移、增值、基質生成及重塑進而導致PCI術后再狹窄。雖然在預防PCI術后血管再狹窄技術方面已有相關研究，但并未取得有意義的進展[5]，說明PCI術后再狹窄這一病理生理過程具有復雜性及挑戰性。載脂蛋白（Apo J）可分為分泌型（s CLU）和核型（n CLU）兩種蛋白[5]，主要在肝臟合成，可與高密度脂蛋白、脂質、載脂蛋白A、對氧磷酶等多種生物分子相結合[6]，廣泛分布于心臟、腎臟、腦組織等多種組織中，通過促進細胞生存、減少氧化應激、促進脂質轉運[7]、促進泡沫細胞中膽固醇外流[8]等功能發揮對心血管的保護作用[9]。已有研究報道Apo J參與了動脈粥樣硬化斑塊的內中膜及血管成形術后再狹窄的進程[10]，但其在心血管疾病進程中是保護作用還是致病作用尚存在爭議。本研究通過建立Wistar大鼠頸動脈球囊損傷后再狹窄動物模型，檢測Apo J在血管再狹窄進程中不同時間點的表達情況，從而探討Apo J在再狹窄病程中的作用及其可能的機制，為尋找新的PCI術后再狹窄的干預靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組：SPF級雄性Wistar大鼠40只，體重350～400 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院提供。按照隨機數表法分為實驗組和對照組，每組20只。其中各組再以損傷后的第1、2、3、4周分為四個時間點，每組每個時間點5只。

1.2 建模方法：所有大鼠適應性飼養一周。實驗組：手術當天稱重，使用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）進行腹腔注射麻醉。頸部備皮，取頸正中切口約2～3 cm，經皮鎖骨下靜脈穿刺（天津市胸科醫院動物實驗室提供技術支持）并注射肝素（200 IU/kg）。于原擬定切口切開皮膚，逐層鈍性分離，充分暴露頸內動脈、頸外動脈，永久結扎頸外動脈遠心端，輕微向頭部牽拉血管，用止血夾臨時夾閉頸總動脈近心端及頸內動脈起始部。用眼科剪在頸外動脈剪“V”型切口，然后插入2F Fogarty球囊導管（江蘇世泰實驗器材有限公司,中國）約3 cm，給予2～3個大氣壓，輕微回拉球囊至動脈切口處，以出現摩擦感而又能拉動球囊為合適壓力，以此方法反復損傷3次，撤除2F Fogarty球囊導管，永久結扎頸外動脈近心端，解除頸總動脈、頸內動脈止血夾，觀察頸內動脈血流情況，可見明顯搏動表明血流通暢。觀察術野有無活動性出血，無則逐層縫合傷口，硫酸慶大霉素注射液2萬單位肌肉注射預防感染。對照組：進行假手術處理，除不插入2F Fogarty球囊，其他步驟均同實驗組。

1.3 實驗動物的處死及標本獲取：10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，將其仰臥固定于動物手術臺上，鎖骨下靜脈穿刺注射10%氯化鉀溶液2～3 ml處死動物，沿頸正中切口切開皮膚，逐層分離，暴露右側頸總動脈，并取下頸總動脈全段，剪下大約0.3 cm放入10%中性福爾馬林固定以備蘇木伊紅染色法（HE） 病理檢查，余下血管放入凍存管并放入液氮中速凍，24 h后放入-80℃冰箱中長久保存，為免疫組化和實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）備用。本實驗已通過我院動物倫理審查。

1.4 蘇木伊紅染色觀察頸總動脈血管形態學變化：標本在10%甲醛溶液中固定3～4 h，進行常規脫水、石蠟包埋，間斷均勻切片，切片厚度4 μm。HE染色，光學顯微鏡下觀察血管損傷的情況。

1.5 免疫組化檢測頸總動脈血管Apo J蛋白的表達：采用免疫組化S-P二步法檢測頸總動脈中是否有Apo J蛋白表達。常規切片、烘片、脫蠟、滅活內源性過氧化物酶、蒸餾水沖洗及抗原修復、一抗、二抗孵育、最后二氨基聯苯胺（DAB）方法顯色。一抗（兔抗人Apo J IgG多克隆抗體，美國Santa Cruz公司）。二抗（快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，福州邁新生物技術開發公司）。所有照片使用IS Capture系統拍攝并保存，使用Image Pro Plus 6.0進行數據采集及分析。使用平均光密度值（MOD）對Apo J蛋白的陽性表達做半定量分析。在400倍光鏡下進行測量，選取血管的中膜及內膜為待測區域，通過測量獲得待測區域的面積（Area）及積分光密度值（IOD），以平均光密度值表示Apo J蛋白表達的強弱。MOD計算公式如下：MOD=累積光密度值(sum of IOD)/累積面積(sum of Area)。

1.6 qRT-PCR檢測頸總動脈血管中Apo J mRNA的表達：用Trizol一步法提取RNA，然后按試劑盒說明書操作進行逆轉錄操作。逆轉錄反應條件：37℃1 h，95℃ 5 min，4℃ 10 min。Apo J引物上游 5’-TAA GGA GAT TCA GAA CGC CG-3’， 下 游 5’-ATC CCT GGT GTC ATC TAG AG-3’；GAPDH 引物上游5’- GTG ATG CTG GTG CCG AGT AG-3’，下游5’-GGT GGC AGT GAT GGC GTG C-3’。 按 SYBR?Premix Ex Taq?system （Perfect Real -time）試劑盒（日本Takara公司）進行Real-time PCR操作。在ABI7500實時定量PCR儀中進行擴增（美國Applied Biosystems公司）。擴增條件：預變性95℃ 30 s，變性 95℃5 s，退火60℃ 34 s，進行40個循環，每個樣本設置3個重復。2-ΔΔCt的分析方法比較各組mRNA的差異。

1.7 統計學方法：使用SPSS 20.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差表示，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗，組內比較采用重復測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建模存活率及成功率：實驗組20只大鼠中1只因術中操作不慎壓迫氣道致窒息死亡，1只因血管切口剪開大小不當，無法插入球囊導管，造模失敗，1只因動脈出血于術后12 h死亡，最終存活大鼠17只，存活率85%。實驗組病理檢查均出現內膜增生增厚，成活的大鼠均造模成功。平均手術時間（34.19±6.09）min。

2.2 形態學檢查結果：

2.2.1 各組血管切片形態學顯微鏡檢測及大鼠頸總動脈內膜/中膜面積比（I/M）的比較結果：血管切片形態學顯微鏡檢測詳見圖1～5。大鼠頸總動脈I/M的比較（表1），對照組的I/M接近于0。實驗組1、2、3、4周的I/M較同時間點的對照組均升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。實驗組損傷后各時間點間的I/M逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2.2 各組大鼠頸總動脈Apo J蛋白表達情況：免疫組化實驗結果顯示Apo J蛋白主要在細胞漿中表達，對照組血管全層中未見Apo J蛋白的表達，實驗組各時間點均可檢測到Apo J表達（圖6）。

以MOD表示Apo J蛋白表達的情況（表2），對照組的MOD接近于0，實驗組各時間點Apo J蛋白的表達均高于其對照組， 3周Apo J蛋白表達最強， 4周表達強度減弱，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 ～5 蘇木伊紅染色法染色檢查各組大鼠頸總動脈血管切片形態意圖

表1 各組大鼠頸總動脈I/M的比較

表1 各組大鼠頸總動脈I/M的比較

注: I/M：總動脈內膜/中膜面積比。與實驗組1周比較aP＜0.05;與實驗組2周比較 b P＜0.05; 與實驗組3周比較 cP＜0.05。*：存活大鼠

表2 各組大鼠勁總動脈Apo J蛋白表達水平

表2 各組大鼠勁總動脈Apo J蛋白表達水平

注： Apo J：載脂蛋白J；與實驗組1周比較aP＜0.05;與實驗組2周比較bP＜0.05; 與實驗組3周比較 cP＜0.05。*：存活大鼠

圖6 免疫組化檢測各組大鼠頸總動脈Apo J蛋白表達情況(x400)

2.2.3 各組大鼠頸總動脈Apo J mRNA表達情況（表3）：與對照組相比，Apo J mRNA在實驗組1周未升高（P＞0.05）， 2周顯著升高， 3周達到最高，約為對照組的8倍， 4周開始下降，但仍高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

表3 qRT-PCR比較各組大鼠勁總動脈Apo J mRNA表達水平

表3 qRT-PCR比較各組大鼠勁總動脈Apo J mRNA表達水平

注：qRT-PCR：實時定量聚合酶鏈式反應；Apo J：載脂蛋白J。與實驗組1周比較aP＜0.05;與實驗組2周比較 bP＜0.05; 與實驗組3周比較cP＜0.05。*：存活大鼠

3 討論

目前，大量的研究結果提示Apo J/CLU可以通過抑制p53和p21的表達，刺激敲除CLU-KO小鼠的血管平滑肌細胞（VSMC）增殖和遷移[11]，進而促進PCI術后血管再狹窄的發生[12]。而Orlandi等[13]通過誘導Apo J亞型轉變的深入研究發現， n CLU對VSMC有促進凋亡、抑制增殖的作用，而Kim等[14]卻提出高表達的s CLU能抑制VSMC的遷移、增殖，及抑制細胞的凋亡，但他們的研究并沒有直接的證實s CLU和n CLU各自對于VSMC的作用。

VSMC的增殖和遷移是導致PCI術后再狹窄的主要原因。VSMC又分為分化型（收縮型）和未分化型（合成型）兩種亞型。正常血管壁中的VSMC為分化型，無DNA的合成及增殖和遷移的能力，細胞中富含肌纖維，主要維持血管的彈性和收縮。心肌細胞及骨骼肌細胞一旦分化后就失去增殖的能力，但是VSMC與這些細胞不同，分化型的VSMC在應激性刺激的誘導下出現表型轉化而變為未分化型。未分化型的VSMC肌纖維的含量較少，結構蛋白少，合成和分泌細胞外基質的能力強，有較強的增殖活性和向內膜遷移的生物學特性[15]。VSMC表型的轉化使VSMC獲得了增殖和遷移的能力，進而導致了PCI術后再狹窄的發生發展。

本研究發現在Wistar大鼠頸動脈球囊損傷術后，血管內膜于第1周時開始出現增生，并于第2周明顯可見大量的VSMC向內膜遷移，內膜中的VSMC數量較多，細胞核密集、排列紊亂，提示其轉化為增殖活躍狀態的未分化型，而與之伴隨的是Apo J mRNA的表達水平開始顯著升高，其蛋白質的表達水平亦顯著升高。第3周時內膜的增生更加明顯，I/M面積比進一步的增大，同時Apo J mRNA及蛋白的表達均達到最高，這提示Apo J的表達與平滑肌細胞的增殖、遷移有密切的關系。在第4周時血管內膜增生達到最大，而在其增生內膜的管腔側仍可發現未分化型的VSMC，但是其管壁側的VSMC的排列開始趨向于整齊，多平行于管壁排列，細胞核趨向于成熟且數目減少，而細胞外基質開始增多，表明VSMC再次轉化為無內分泌及增殖活性的分化型，此時，Apo J mRNA及蛋白的表達水平開始下降，但仍是高于對照組，進一步說明血管增生內膜內的Apo J表達與未分化型的VSMC密切相關。

Apo J是一種應激蛋白，多在有損傷、應激的情況下表達增加。結合本研究的結果，我們認為球囊損傷作為機械刺激，誘導VSMC由分化型向未分化型轉變，未分化型的VSMC大量地向內膜遷移并增殖，同時合成和分泌大量含Apo J的細胞外基質。Apo J表達的持續增加可能作為一種應答機制，反饋性地抑制VSMC的增殖和遷移，隨著VSMC增殖活性的降低，Apo J的表達開始減少。因此，我們進一步推測Apo J有望作為干預術后血管再狹窄的一個靶點，通過局部或系統地調節Apo J的表達，從而減少血管再狹窄的發生，但需要進一步的研究來證實這些推測。本研究尚存在一些不足之處，實驗所使用的抗體主要用于檢測s CLU，而未能探討n CLU在再狹窄過程中的變化，因此，針對不同的Apo J蛋白表達在PCI術后再狹窄進程中的作用及分子機制的研究將是解決PCI術后再狹窄的關鍵。

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Expression Pattern of Apolipoprotein J in Rat’s Model of Carotid Artery Restenosis

YANG Ning, SU Bin, KOU Lu, DONG Bo, LI Yang, YANG Jing-yu, QIN Qin.
Department of Cardiology, Tianjin Chest Hospital, Tianjin (300051), China

QIN Qin, Email: qinqin6351@163.com

Objective: To study the expression pattern of apolipoprotein J (Apo J) in rat’s model of vascular restenosis after cartid balloon dilation.

Methods: A total of 40 Wistar rats were randomly divided into 2 groups: Experimental group, the rat’s model of carotid artery injury was established by 2 F Fogarty balloon catheter scratching in right carotid artery and Control group, the rats received sham operation without catheter scratching. n=20 in each group. Right carotid artery tissue was taken at 1, 2, 3, 4 weeks after the operation respectively and 5 rats were used for each time point. The morphological changes were measured by HE staining, protein and gene expressions of Apo J were examined by immunohistochemistry and qRT-PCR.

Results: Compared with Control group, at each time point Experimental group had obvious intimal hyperplasia and upregulated protein and gene expressions of Apo J, P＜0.05. In Experimental group, with prolonged time of injury, consistent endometrial hyperplasia was observed and it reached the maximum at 4 weeks after operation; the peak protein and gene expressions of Apo J was found at 3 weeks after operation, then decreased at certain point at 4 weeks after operation, P＜0.05.

Conclusion: Apo J might be closely related to intimal hyperplasia after vascular injury, high expression of vascular Apo J was mainly derived from vascular smooth muscle cell synthesis, it could be a kind of compensation with protective role and might be used as a new biological target for treating vascular retenosis after percutaneous coronary intervention.

Apolipoprotein J; Carotid stenosis; Intimal hyperplasia

天津市衛計委重點攻關項目（13KG131）；天津市衛計委科技基金重點項目（2015KR07）

300051 天津市胸科醫院 心內科

楊寧 主治醫師 碩士 主要從事冠心病防治的臨床與基礎研究 Email：mengshateng@163.com 通訊作者：秦勤 Email：qinqin6351@163.com

R541

A

1000-3614（2017）12-1222-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017. 12.019

2016-12-25）

（編輯：曹洪紅）