面向組織工程的多細胞結構三維自組裝成形方法的研究進展

朱曉璐,楊逸飛

(河海大學機電工程學院，江蘇常州 213022)

面向組織工程的多細胞結構三維自組裝成形方法的研究進展

朱曉璐,楊逸飛

(河海大學機電工程學院，江蘇常州 213022)

多細胞結構是由細胞群體構成的有機體，其體外構建對于組織工程和再生醫學的發展具有重要的基礎意義。利用細胞自身的自組織特性構建三維(3D)多細胞結構正成為生物制造和組織再生的一種重要途徑，并受到越來越多的關注。對三維多細胞結構的自組裝式構建與調控的相關基礎研究及關鍵技術進行了綜述及分析，主要涉及凝膠內3D細胞培養、多細胞結構可控形成，及其與圖靈反應-擴散機制的聯系等方面的研究工作。為進一步研究多細胞3D自組裝機理，使得該自組裝過程可控，且滿足同時調控外部施加和細胞自身分泌的作用因子的濃度梯度分布的需求，提出對內部結構特征梯度化的3D凝膠體內細胞3D自組裝模型進行研究，以推進三維多細胞結構及組織前體形成的理性調控技術。

仿生學；生物制造;三維細胞培養; 結構梯度化凝膠; 三維細胞自組裝

近年來，人體受損組織或器官的再生技術受到越來越多的關注[1-6]。為實現活體組織與器官的結構再造和功能再生(生物制造)，研究人員設計并制造各種機械結構支架(Scaffolds)并將其廣泛應用于生物組織工程，且支架的制造逐漸向著更為復雜和精細的方向發展[7-12]，比如通過基于準分子激光的立體光刻制造生物光聚合物支架[11](圖1 a))，通過激光輔助的機械穿孔法制造多孔金屬支架[13](圖1 b))，以及采用固態自由成型制造多孔金屬支架[13](圖1 c))等。在重建生物組織在微環境中的結構特征方面，各種各樣的支架結構通過各自獨特的結構特點和表面涂層及處理，使得相應類型的細胞能夠黏附其上并促使細胞按照特定的幾何特征排列生長，還可根據設計需求實現相應的降解過程，這為組織工程學的發展作出了一定的貢獻。然而，雖然支架的制造更加精細，但支架仍然很有可能由于其自身的降解，誘發的免疫原性反應，以及其他不可預料的并發癥而帶來應用中的問題[14]，而且細胞在生長過程中會發生位置移動，其最終生成的多細胞體系結構有時會偏離最初設計的幾何特征。

另外，基于細胞的3D打印技術也是生物制造領域中一項重要的技術手段[15-17]，其主要通過將包裹細胞的微單元體(也有文獻稱之為bio-ink[14])按照逐層堆積打印的方式形成最終的多細胞結構體或器官結構,其能夠高效地制造具備特定幾何結構的三維多細胞結構體以及組織/器官結構雛形。其主體思想是借助外力(3D打印機)實現三維幾何結構的再造，然而組織/器官甚至多細胞體系都非常復雜，主要依靠幾何約束(3D逐層堆積)，并不一定保證其化學生物方面功能的全面實現[18]。如果能夠充分地依靠生物細胞自身所具備的先天性再生能力，使其完全自發的自組裝成為組織或器官結構(盡可能模擬自然界中的作用機制)，而非主要利用外力將其塑造成一定幾何結構，將會為促進生物制造領域的發展進一步拓寬研究思路[18-19]。所以，近年國際上越來越多的相關研究工作正逐漸開始重視細胞和組織的先天固有的自我組織(self-organizing)特性，通常也可以稱為細胞自組裝。而且，很多種基于細胞的治療方法被提出并應用于重組或恢復組織功能[6,20-22], 例如，圖1 d)所示的皮膚全厚度(含表皮層、真皮層和皮下組織)創傷的修復；圖1 e)所示的用于軟骨修復的基質與細胞混合植入物，該植入物穩固地附著于軟骨下骨及附近軟骨，并具有合適的Ⅱ型膠原蛋白密度及定向，以承受關節處的剪切力。這些方法主要依賴于細胞自身的生長和3D自組裝過程。因此，研究細胞在三維基質(3D)中的自組裝對于組織工程、再生醫學和生物制造的發展有著重要意義。

1 面向組織工程的細胞自組裝研究進展

研究細胞固有的自組裝過程以及調控方法，通常需要構建適合的細胞外基質以達到模擬人體內自然生理環境的目的。目前在國內外相關研究工作中，在凝膠系統中的三維空間(3D)細胞培養[22-24]是一項能夠實現上述目標的很有前景的技術，因為3D細胞培養技術相對于傳統的2D培養技術提供了更為接近自然生理環境并且充分利用細胞及細胞群體的內在固有屬性。

1.1 細胞自組裝試驗與技術的研究現狀及分析

對于細胞的3D自組裝研究在試驗和技術方法方面，現有的國內外研究工作取得了一些進步和有意義的成果。目前，利用或者結合細胞的自組裝特性構建三維的生物組織特征結構的途徑主要有：構建并組裝含細胞的片層[25-26]；直接使細胞沉積或移動到指定位置進而設定細胞的排列特征[16,27-29]；以及構建包含細胞的凝膠纖維進而對其組裝[30]等。在這些方法中，都避免使用了各類結構支架，而是通過設定初始幾何限制或初始細胞分布，然后利用細胞自組裝特性以期實現特定多細胞結構或是組織單元結構的構建。此外，還有一部分研究工作通過外部微結構或者外部施加的作用因子梯度[31]以及培養的化學生物條件對細胞生長和自組裝的影響，比如凝膠微結構成型 (如圖2 a)所示)[32],外基質內的趨化因子濃度梯度的建立(如圖2 b)所示)[33]，營養物質與氧氣濃度梯度的建立(如圖2 c)所示)[34]以及在三維凝膠對胚胎干細胞團塊的培養(如圖2 d)所示)[35-36]等方法被提出并應用于研究細胞對周圍微環境的響應乃至器官雛形的形成。上述成果中，實現凝膠微結構的制作，主要是用于研究不同細胞之間的相互作用；外基質內的建立一些作用因子(某種蛋白質)梯度(見圖2 b))[33,37]或者氧氣及營養物質的濃度梯度(見圖2 c))[34]，是因為實際生物組織在自然演變過程中所處的微環境內通常大量存在物質濃度的梯度分布，因而需要構建特定的濃度梯度以便更好地模擬自然界中多細胞體系所處的微環境；通過對胚胎干細胞團塊在三維(3D)凝膠中的自組裝過程能夠實現自組裝的視網膜原基[35]形態發生，開辟了利用多功能干細胞治療某些內分泌疾病研究的新途徑；此外，通過對胚胎干細胞團塊的培養以及細胞群體自組裝過程，可在特定條件下實現腦下垂體前葉雛形[36]形態發生，這對于視網膜退化的治療方法研究極具意義。

1.2 細胞自組裝的反應-擴散理論機制的研究現狀及分析

除了上述在生物細胞自組裝的試驗或支撐技術實現上的研究，為了從理論上研究或從試驗上控制細胞在三維空間(3D)的相互作用[32]或自組裝[38],建立了若干種基于圖靈反應-擴散(reaction-diffusion，RD)機理[39-40]的數學模型[41-44]以探索多細胞結構或組織形成的機理，并預測出可能出現的各種組織結構。這種理論最早由英國科學家圖靈(Alan Turing)于1951年提出[39]，該理論假設生物圖案形成過程中包含2種最基本的作用因子：活化子(activator)和抑制子(inhibitor)。基于簡單的分子擴散-反應機理，來解釋或預測活化子和抑制子最終的濃度分布，進而得出細胞密度在空間的分布(比如活化子濃度較高的區域，細胞密度也高)，這樣就有可能近似模擬出一些生物組織的形態圖案(見圖3)[41]。

這種目前被國內外研究者采納的圖靈反應-擴散模型雖然能夠從數學意義上解釋自然界中動植物的外部或內部各種圖形的形成機理，比如虎、斑馬身上的條紋、魚類身上的圖案，此外該模型還能在一定程度上解釋人體顱蓋骨的形成[45]。其所涉及的基于反應-擴散機理的數學模型包含2個主要參量(作為活化子的蛋白分子BMP2和作為抑制子的蛋白分子Noggin)的擴散反應過程，這2個參量與間充質細胞和成骨細胞之間會發生相互作用，例如促進或抑制細胞生長的作用。從反應-擴散系統的本質機理上講，如果某些干細胞自身能夠分泌出成對的活化子和抑制子,那么便具有了體外自組裝成特定多細胞結構的能力，血管間充質干細胞便滿足這種條件并能夠在二維平面形成特定多細胞結構圖案[40,46](見圖4 a))，這也在一定程度上進一步論證了反應-擴散模型能夠作為預測多細胞結構圖案的體外形成。但是，該基本模型目前還不能直接用于指導利用人工方法進行體外3D細胞自組裝的機理和定量調控研究(如圖4 b)所示的三維乳腺上皮細胞的自組裝結構[47]就難以直接采用上述基本模型來預測)。

根據目前國際上該研究領域的發展動態來看，試驗研究的發展速度大于理論進展的速度。在最近的3D干細胞自組裝成為特定多細胞結構體或器官結構特征的研究中，其試驗結果通常很大程度上是依據大量試驗探索而得出的經驗得到的，在細胞組裝的初始時刻并不能事先預測到最后的結果。 這并非根據預測性理論進行演繹推理進而進行有針對性的設計，也不是根據預先設計的3D多細胞結構/器官結構特征進行相應的制造。總體來說，自底向上的基于細胞自組裝的生物制造技術的發展仍需要更多科學理論的支持和引導，且系統深入的細胞自組裝或細胞團塊的3D自組裝機理仍是將來研究的重點和熱點。

2 細胞自組裝研究現狀與分析

在試驗和相關技術實現方面，雖然通過3D自組裝方法研究多細胞結構體系形成的研究工作取得了一定的成果[22-23,32-37]，但單個細胞或多細胞結構究竟是以何種機理相互作用最終形成整個器官仍然不完全清楚。 因為平衡穩定狀態下的器官形成過程需要多重細胞間相互作用的協調發展，才能實現細胞群體行為的展現并逐漸發展成為器官，而影響細胞活性、增殖與分化的環境因素眾多，具體包括細胞間相互作用、細胞與外基質之間的相互作用、生長因子的濃度分布等[38-50]，故而細胞(含多潛能干細胞)的自組裝過程的機理非常復雜且尚不清晰，包括3D多細胞結構在三維空間形狀發生改變的內在機制以及受到均勻施加的作用因子的作用后3D形狀發生改變的原因等。另外，上述研究在模擬自然界生物體內普遍存在的作用因子濃度梯度的時候，較多采用外部濃度差方法(比如樣品兩側微流道內溶液存在濃度差)，但這樣一般只能調控外部作用因子(比如蛋白分子)的濃度差，而不能直接調控細胞自身分泌的作用因子，這也對細胞3D自組裝機理的研究造成了一定的局限。

在機理和相應的數學模型方面，基于反應-擴散機理的數學模型通常不能直接用于指導這種自底向上的基于細胞3D自組裝的生物制造，因為采用人工方法制造出的多細胞微觀結構中所涉及的各類試驗參數值和材料的參數值還沒有與上述基本模型中的物理量建立直接的對應關系。而建立這種直接的定量(或半定量)關系需要盡可能精確地設計相應的試驗，并通過對比各類不同的可控試驗條件下的3D自組裝形成的結構形態和各類不同參數值設置下模型的模擬結果，進而確定數學模型的關鍵參數值范圍以及描述細胞生物學行為的數學表達項(比如考慮到分子和細胞擴散系數的非均勻空間分布等)。本課題組在采用數學模型引導細胞自組裝體外試驗方面取得了一定的成果[51-53]，并部分地解決了上述問題，包括能夠通過反應-擴散數學模型引導血管間充質干細胞自組裝成為3D管狀和網狀鏤空微結構等。

3 研究展望

在基于凝膠的3D細胞培養的試驗和應用方面，研究人員有望設計出更加準確、精細的試驗條件，包括凝膠所能提供的基質環境，細胞所受的化學和力學微環境，以及細胞群體的幾何分布及生長控制等。更加精細的試驗結果將會進一步推進細胞-凝膠復合材料向臨床應用的轉化。

在理論和相應的數學模型方面，反應-擴散體系學說為從系統整體角度理解3D多細胞結構形成提供了一個思路，其可以避免對細胞自組裝過程中各類繁雜細節的試驗測量，且相應的部分數學模型可以模擬出與活體組織形態相近的結構形態。這種理論模型的建立和對組織形成過程的仿真預測對于通過3D細胞培養進行組織前體結構的體外支配具有重要的引導作用，因此在該模型的方程解存在的范圍內進行大量的參數值試算是探索新的組織結構類型的一種潛在的有效方法，在未來的研究發展中有望引導研究人員設計相應的試驗條件并為試驗指明方向。

針對前述的國內外研究現狀、存在問題及趨勢的分析，為進一步研究多細胞3D自組裝機理并使自組裝過程可控，滿足同時調控外部施加和細胞自身分泌的作用因子的濃度梯度分布的需求，提出一種對內部結構特征梯度化的3D凝膠塊組合體材料中細胞3D自組裝進行研究的思想，建立相應的體外試驗模型以及能夠描述細胞3D自組裝過程的反應-擴散(RD)基本數學模型，結合RD模型研究細胞在這種內部或內外部作用因子(比如蛋白質分子)的濃度梯度作用下的自組裝行為的變化規律。這種研究思路通過試驗與理論相結合的方式有望論證各種作用因子或者凝膠力學參數值對細胞自組裝過程的調控作用，并據此為面向生物制造的3D多細胞結構的可控化制造提供可靠的理論指導和技術基礎。

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Research progress of the three-dimensional(3D) multicellular structure formation via self-assembly of cells toward tissue engineering

ZHU Xiaolu， YANG Yifei

(College of Mechanical and Electrical Engineering， Hohai University, Changzhou, Jiangsu 213022, China)

Multicellular structures are organisms consisting of cell populations, and constructing multicellular structure is of great importance for the development of tissue engineering and regenerative medicine. The use of self-organization processes in three-dimensional (3D) culture is receiving increased attention for bio-manufacturing and regenerating injured tissue. This review covers the research work on the fundamental and key techniques regarding 3D cellular self-assembly. It includes the 3D culture of cells inside bio- compatible hydrogels, controllable formation of 3D multicellular structure, and the associated Turing reaction-diffusion mechanism. In order to further study the mechanism of 3D self-assembly of cells and find a reliable way to regulate this self-organization in 3D extracellular matrix with spatial gradients of the concentrations of exogenous and cell-secreted factors, this review at last proposes to study the 3D models of cellular self-assembling inside structurally graded hydrogel, so that the development of rational regulation technology for 3D multicellular structure and tissue bud could be facilitated.

bionics; bio-fabrication; 3D cell culture; structurally graded hydrogel; 3D self-assembly of cell

1008-1542(2017)06-0515-07

10.7535/hbkd.2017yx06002

Q81

A

2017-03-07；

2017-06-19；責任編輯：王海云

國家自然科學基金(51505127)；江蘇省自然科學基金 (BK20161197)；常州市科技支撐計劃(社會發展)項目(CE20165029)

朱曉璐(1985—)，男，江蘇徐州人，講師，博士，主要從事微納生物制造及微流體技術方面的研究。

E-mail:zhuxiaolu@hhu.edu.cn

朱曉璐, 楊逸飛.面向組織工程的多細胞結構三維自組裝成形方法的研究進展[J].河北科技大學學報,2017,38(6):515-521.

ZHU Xiaolu，YANG Yifei.Research progress of the three-dimensional(3D) multicellular structure formation via self-assembly of cells toward tissue engineering[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2017,38(6):515-521.