JAK2-STAT3信號通路在樹鼩腦缺血后適應中的作用機制*

李 霞， 李樹清

(昆明醫(yī)科大學病理生理學教研室， 云南 昆明 650500)

JAK2-STAT3信號通路在樹鼩腦缺血后適應中的作用機制*

李 霞， 李樹清△

(昆明醫(yī)科大學病理生理學教研室， 云南 昆明 650500)

目的觀察JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導通路在樹鼩缺血后適應(ischemic postconditioning，IPoC)神經(jīng)保護中的調(diào)控作用，探討阻斷JAK2-STAT3通路后腦損傷加重的機制。方法通過光化學反應建立樹鼩血栓性腦缺血模型；于缺血后4 h夾閉患側(cè)頸總動脈3次(每次5 min)實施IPoC。于IPoC前10 min側(cè)腦室注射AG490(JAK2抑制劑)后，采用TTC染色觀察樹鼩腦梗死面積的變化，通過HE染色和電鏡觀察腦皮層神經(jīng)元形態(tài)改變及超微結(jié)構(gòu)變化，應用Western blot檢測IPoC及AG490處理后皮層t-STAT3和p-STAT3蛋白水平的變化。結(jié)果缺血24 h，皮層神經(jīng)元固縮，線粒體腫脹，嵴溶解；腦梗死面積占半腦面積的(24.78±3.30)%；此時皮層神經(jīng)元STAT3磷酸化水平明顯增高(P<0.01)。IPoC后皮層神經(jīng)元損傷減輕，線粒體腫脹改善，腦梗死面積占半腦面積的百分比減小為(17.67±1.83)%(P<0.01)，STAT3磷酸化水平進一步增高(P<0.01)。然而，給予AG490處理后，皮層神經(jīng)元損傷加重，腦梗死面積再次增大為(23.85±2.77)%(P<0.05)，STAT3磷酸化水平則明顯降低(P<0.05)。結(jié)論IPoC可能通過調(diào)控STAT3的磷酸化而減輕樹鼩缺血性腦損傷，抑制JAK2-STAT3信號通路可抵消IPoC的保護效應而加重腦損傷。

光化學反應； 缺血后適應； JAK2-STAT3信號通路； 神經(jīng)保護； 樹鼩

缺血性腦卒中是人類致殘、致死的常見多發(fā)病，有關(guān)腦缺血治療的研究多集中在神經(jīng)保護藥物的評估與開發(fā)上，盡管這些研究對當前和將來均具有重要意義[1]，但腦缺血的死亡率一直居高不下，腦保護研究依然是國內(nèi)外缺血性腦血管病治療的重要領(lǐng)域。業(yè)已證明，通過反復3次夾閉頸總動脈實施非藥物干預，即缺血后適應(ischemic postconditioning，IPoC)，可使局部腦血流(regional cerebral blood flow，rCBF)在不輸液或用藥的前提下逐步回升至正常rCBF的56%以上[2]。IPoC可以激活機體內(nèi)源性保護機制，減輕腦缺血再灌注損傷[2]，與缺血預適應(ischemic preconditioning，IPC)相比，IPoC具有明顯的可預見性，且易于操作，因而更具臨床應用價值，是近年腦保護策略由神經(jīng)保護向細胞保護轉(zhuǎn)變的重要轉(zhuǎn)折。IPoC的神經(jīng)保護機制較為復雜，涉及多條細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的活化，目前國內(nèi)外對IPoC腦保護機制的研究主要涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)[3]、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/Akt[4]以及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)通路[5]等，對其它信號通路的探索正在進行中。研究發(fā)現(xiàn)，Janus激酶2/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)是一條重要的信號通路，參與多種生理和病理過程，包括細胞生長、分化、增殖、凋亡和炎癥等[6-7]。在心肌IPoC的研究中發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3信號通路也參與了保護作用，其作為生存活化因子增強通路(survivor activating factor enhancement，SAFE)的一部分，在IPoC的心肌保護中具有抗凋亡效應[8]。新近研究證實，STAT1活性抑制劑和DNA合成抑制劑在腦缺血的早期階段就表現(xiàn)出了神經(jīng)保護作用，其潛在的機制則與神經(jīng)細胞中STAT3的磷酸化有關(guān)[1]。可見，揭示STAT3相關(guān)通路的激活因子，闡明其神經(jīng)保護作用的分子機制具有重要意義。而有關(guān)JAK2/STAT3信號通路是否也參與了樹鼩腦IPoC的神經(jīng)保護作用迄今未見報道，其信號通路在IPoC中的分子機制也尚未闡明。因此，本實驗通過觀察IPoC對JAK2/STAT3信號通路的影響，并應用JAK2特異性抑制劑AG490抑制其信號通路，檢測腦缺血損傷時總STAT3(total STAT3，t-STAT3)與磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3，p-STAT3)蛋白表達的消長變化，探討IPoC調(diào)控JAK2/STAT3信號通路的分子機制，為腦缺血的臨床治療提供新的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1實驗動物與分組 健康成年樹鼩60只，雌雄不限，體重(150±20) g，由中科院昆明動物所實驗中心提供 [動物合格證為SYXK(滇)K2012-0003]，實驗前在清潔、安靜的環(huán)境下飼養(yǎng)。將動物隨機分為5組：假手術(shù)對照(control)組、腦缺血(ischemia)組、IPoC組、溶劑對照(IPoC+DMSO)組和AG490處理(DMSO+AG490+IPoC)組，每組5只。

1.2主要儀器和試劑 本室研制的SQ-Ⅲ型腦血栓形成裝置(專利號：ZL201420068737.2) ，光源中心波長(λ) 560 nm，帶寬 (Δλ) 60 nm，光強度1.0 W/cm2，用時間繼電器控制照射時間；DSC-T30 數(shù)碼相機(SONY)； JEM-100CX 型電子顯微鏡(Hitachi)。孟加拉紅(rose bengal)購自Fluka；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)系國藥集團化學試劑有限公司分裝；AG490購自Abcam，用DMSO(<0.01%)溶解后配成1 mmol/L的儲存液，保存于-20 ℃；抗p-STAT3 (Thr705)和t-STAT3抗體購自CST；辣根過氧化物酶標記的 II 抗購自ABMART；抗β-actin抗體購自Abcam。

2 方法

2.1樹鼩局灶性腦缺血及缺血后適應模型的建立 采用本室研制的SQ-Ⅲ型腦血栓形成裝置復制腦缺血模型[2, 4]。以1%硫噴妥鈉溶液5 mL/kg腹腔注射麻醉動物，仰臥位固定，經(jīng)舌下靜脈注射(1.5 g/L)孟加拉玫瑰紅(rose bengal)生理鹽水溶液(1.33 mL/kg)，循環(huán)10 min后，將動物改為俯臥位固定，消毒右側(cè)顳頂部皮膚，在右耳屏與右眼外眥連線中點做一長約1 cm切口，分離部分顳肌，暴露顱骨，此時透過顱骨可見顱內(nèi)血管，于切口處嵌入一外徑為1 cm × 2.5 cm 的消毒鋁片，其中心有一直徑為 0.5 cm 的窗孔，光束可通過該窗孔照射于顱骨表面，鋁片以外的組織用避光紙遮蓋。將動物置于腦血栓形成裝置下，照射血管15 min(時間由繼電器控制)，照射期間維持顱骨表面溫度在(36±1)℃。術(shù)后取出鋁片，消毒并逐層縫合切口，保溫待動物蘇醒后放入飼養(yǎng)籠內(nèi)觀察。假手術(shù)組注射等量孟加拉玫瑰紅但不予以光照。在上述局部性腦缺血模型基礎(chǔ)上建立腦IPoC 模型[2, 4]，于缺血4 h 前40 min 再次麻醉動物，仰臥位固定，消毒皮膚，做頸正中縱行切口，逐層分離皮下組織及頸闊肌，分離缺血側(cè)頸總動脈，注意保護迷走神經(jīng)，以無創(chuàng)動脈夾在甲狀軟骨上緣平面夾閉頸總動脈5 min后，再灌注5 min，重復3個循環(huán)，復制IPoC模型，術(shù)后消毒并逐層縫合切口，保暖回籠，見圖1。

Figure 1. The schematic diagram of the experimental design. FC: first time clipping； SC: second time clipping； TC: third time clipping.

圖1實驗設(shè)計示意圖

2.2JAK2抑制劑AG490側(cè)腦室給藥 將AG490用50%的DMSO溶解后，配成1 mmol/L的儲存液，保存于-20 ℃。使用時用含50% DMSO的PBS緩沖液稀釋成50 nmol/L工作液，于缺血后適應前10 min進行側(cè)腦室注射。將動物俯臥位固定于腦立體定位儀上，備皮，消毒頂部皮膚，沿頂部正中線切開皮膚，暴露顱骨，在患側(cè)側(cè)腦室給予50 nmol/L的AG490溶液5 μL，注射完畢后消毒并縫合切口，保暖回籠。溶劑對照組給予等量的含50% DMSO的PBS溶液作為對照。

2.3TTC染色及腦梗死面積測定 各組動物于腦缺血24 h后麻醉，迅速斷頭取腦，放入2% TTC 溶液中，37 ℃溫育30 min。正常腦組織經(jīng)TTC 染色呈現(xiàn)均勻紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色，界限清楚。采用CAD 2007制圖軟件測定梗死面積占半腦面積的百分比。

2.4HE染色及光鏡觀察腦皮層組織結(jié)構(gòu)變化 各組動物于既定時點再次麻醉，快速開胸并剪開心包，自心尖部插入一根聚乙烯管，使其進入升主動脈，扎閉主動脈根部以防回流，剪開右心耳，用4℃預冷的生理鹽水(100 mL)進行灌注，待肝臟變白后，在120 mmHg壓力下緩慢滴注4%甲醛(200 mL)內(nèi)固定2 h。固定完畢后開顱取腦，浸泡于新配制的4%甲醛中后固定24 h。常規(guī)脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋制作蠟塊標本，進行HE染色，在光鏡下觀察腦皮層組織結(jié)構(gòu)及神經(jīng)元的變化。

2.5透射電鏡觀察腦皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化 各組動物于既定時點進行深度麻醉后，迅速斷頭，打開顱骨，暴露缺血側(cè)皮層，在冰盤上快速切取梗死灶周圍皮層組織塊，置于3.5%戊二醛4℃預固定保存，用PBS緩沖液沖洗后，置于1%四氧鋨酸中固定24 h，再用乙醇-丙酮酸逐級脫水，Epon-618環(huán)氧丙烷滲透、包埋，經(jīng) LKBS 型超薄切片機半薄切片定位后，再進行檸檬酸鉛-醋酸鈾雙染色，在JEM-1011 型透射電子顯微鏡下觀察皮層超微結(jié)構(gòu)。

2.6Western blot檢測皮層t-STAT3和p-STAT3的蛋白水平 于既定時點麻醉動物，迅速斷頭，將大腦置于冰盤上，參照本室取材方法[17]快速切取相應皮層組織，按每100 mg組織重量加入1 mL裂解液提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后進行SDS-PAGE， 100 V、80 min分離蛋白質(zhì)，并以100 mA、55 min半干轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。用5% 脫脂牛奶室溫振搖封閉1 h，將抗鼠t-STAT3單克隆抗體(1∶1 000)、抗鼠p-STAT3單克隆抗體(1∶2 000)和抗鼠β-actin多克隆抗體(1∶5 000)室溫振搖2 h 后，4 ℃冰箱中孵育過夜，將辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫振搖，孵育2 h。ECL化學發(fā)光試劑盒進行反應，Bio-Rad化學發(fā)光凝膠成像儀進行顯色、成像，ImageJ 圖像分析軟件分析處理，計算目標條帶的吸光度(A)。

3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計軟件行方差齊性檢驗和單因素方差分析(one-way ANOVA)，樣本均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 IPoC及AG490 對樹鼩腦梗死面積的影響

TTC染色后，樹鼩腦皮層光照區(qū)梗死灶明顯，呈蒼白色，邊界清楚。Ischemia組腦缺血24 h可見明顯的梗死灶，梗死面積占半腦面積的(24.78±3.3)%；實施IPoC處理后，皮層梗死面積明顯減小為(17.67±1.83)%(P<0.01)，與DMSO組無明顯差異；而AG490處理后，梗死面積再次增大(23.85±2.77)%(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The effects of IPoC and AG490 on the infarct size 24 h after cerebral ischemia in tree shrews. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsischemia group;△P<0.05vsIPoC group.

圖2IPoC及AG490對樹鼩腦缺血24h梗死面積的影響

2 IPoC及AG490 對樹鼩腦皮層神經(jīng)元組織病理學改變的影響

光鏡下對照組樹鼩大腦皮層神經(jīng)元形態(tài)正常，見圖3A、B。腦缺血24 h后，皮層缺血中心區(qū)可見液化壞死灶，組織結(jié)構(gòu)疏松、染色變淺，神經(jīng)細胞壞死、脫失，神經(jīng)元數(shù)量減少；壞死灶周圍神經(jīng)元胞體縮小變形，核固縮，胞質(zhì)尼氏小體消失，見圖3C。IPoC處理后，皮層神經(jīng)元損傷減輕，正常神經(jīng)元增多，見圖3D。DMSO溶劑對照組皮層神經(jīng)元變化與缺血后適應組相似，見圖3E。AG490處理組皮層神經(jīng)元損傷又有所加重，神經(jīng)元壞死增多，數(shù)量減少，見圖3F。

Figure 3. The effects of IPoC and AG490 on the cortical neuronal changes 24 h after cerebral ischemia in tree shrews (HE staining， ×200 in A and ×400 in others). A and B: control group; C: ischemia group; D: IPoC group; E: IPoC+DMSO group; F: IPoC+AG490 group.

圖3IPoC及AG490對樹鼩腦缺血24h后皮層神經(jīng)元改變的影響

3 IPoC及AG490對樹鼩皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響

電鏡下觀察顯示，對照組樹鼩腦皮層神經(jīng)元形態(tài)正常，邊界清楚，雙層核膜清晰可見，常染色質(zhì)豐富；線粒體形態(tài)正常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列規(guī)則，高爾基體結(jié)構(gòu)正常，見圖4A、B。腦缺血24 h后，皮層神經(jīng)元壞死，細胞水腫明顯，神經(jīng)細胞核膜邊界不清，核內(nèi)異染色質(zhì)增多；線粒體腫脹，嵴溶解、消失，或形成空泡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、擴張，見圖4C。缺血后適應24 h，神經(jīng)元損傷減輕，細胞水腫及線粒體腫脹減輕，見圖4D。DMSO溶劑對照組皮層神經(jīng)元損傷與后適應組變化基本相似，見圖4E。AG490處理組皮層神經(jīng)元損傷加重，核膜不清，線粒體固縮及空泡增多，見圖4F。

Figure 4. The effects of IPoC and AG490 on the ultrastructure of cortical neurons 24 h after cerebral ischemia in tree shrews (×10 000 in A and ×25 000 in others). A and B: control group; C: ischemia group; D: IPoC group; E: IPoC+DMSO group; F: IPoC+AG490 group.

圖4IPoC及AG490對樹鼩腦缺血24h皮層神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變的影響

4 IPoC及AG490對樹鼩皮層t-STAT3和p-STAT3蛋白表達的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，各組皮層t-STAT3的差異無統(tǒng)計學顯著性。對照組皮層p-STAT3較少(0.04±0.01)，ischemia組STAT3蛋白的磷酸化水平明顯上調(diào)(0.45±0.17,P<0.01)，IPoC組STAT3的磷酸化水平較缺血組升高(0.83±0.15，P<0.01)。DMSO組STAT3的磷酸化水平與后適應24 h組差異無統(tǒng)計學顯著性，而AG490處理24 h后STAT3的磷酸化水平明顯下降(0.36±0.05，P<0.05)，見圖5。

討 論

資料顯示，樹鼩腦部結(jié)構(gòu)發(fā)育和顱腦血管分布與人腦較為接近，其大部分的皮層內(nèi)動脈呈直線分布，并具有密集的毛細血管網(wǎng)，與人類的腦血管分布相似，因此用樹鼩作為人類腦血管疾病實驗模型已備受關(guān)注[9-11]。加之樹鼩的顱骨薄而透明(厚度僅為大鼠的1/3)，透光性好，有利于特殊光束透過顱骨進行光化學反應；后者選擇性損傷血管內(nèi)皮細胞，誘導血小板黏附、集聚而形成血栓；由于該模型不需開顱，無腦脊液外漏，樹鼩感染率低而便于長期觀察，因此與臨床缺血性腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理過程十分吻合。研究證實，JAK2激酶活化后募集胞漿中以單體形式存在的STAT3分子，使與受體結(jié)合的STAT3分子磷酸化后，STAT3形成同源或異源二聚體而從受體上被釋放出來，進入細胞核與特定的靶基因調(diào)控區(qū) DNA 結(jié)合，通過調(diào)節(jié)靶基因的表達而發(fā)揮多種生物學效應。近年研究發(fā)現(xiàn)，STAT3激活后可以減少神經(jīng)細胞凋亡、減輕氧化應激、抑制中樞炎癥反應和促進血管生成[1]。隨著JAK2/STAT3信號通路在缺血性細胞損傷研究的不斷深入[12]，揭示腦缺血時JAK2/STAT3表達的消長變化，尤其是IPoC調(diào)控其信號通路分子機制的探索也廣受重視。

業(yè)已證明，梗死面積測量是反映缺血性損傷程度的重要指標。TTC為一種光敏化合物，其與乳酸脫氫酶反應可使正常腦組織染成紅色，而缺血性腦組織則為白色[13]。本研究的TTC染色結(jié)果顯示，腦缺血24 h后，皮層梗死灶明顯，此時神經(jīng)元的p-STAT3蛋白明顯增高，提示JAK2/STAT3信號通路已被激活，STAT3的磷酸化反應既是缺血缺氧的原因，又是缺血耐受抗損傷的主要結(jié)果；還可能與缺血導致的神經(jīng)元過度興奮以及中樞炎癥反應有關(guān)[14]。已證明，腦缺血可激活星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，并釋放細胞因子、趨化因子和生長因子而導致膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元以及血管內(nèi)皮細胞之間復雜的相互作用[15]，JAK2/STAT3信號通路在缺血性腦損傷中可能與調(diào)控促炎和抗炎因子之間的失衡有關(guān)[16]。研究證實，STAT蛋白主要通過JAK而直接磷酸化，經(jīng)典的JAK2/STAT3途徑如同激素信號一樣參與多種細胞因子的信號途徑[1]。大鼠腦缺血/再灌注研究發(fā)現(xiàn)，JAKs聚合后又可通過自動或轉(zhuǎn)磷酸化反應而自我激活，IPoC可以通過JAK2/STAT3信號通路減少神經(jīng)細胞凋亡，減輕炎癥反應從而發(fā)揮腦保護作用[12]。腦缺血時，細胞ATP生成減少，STAT3的磷酸化反應在一定的程度上可補償細胞能量的不足，而IPoC又可促進JAK2/STAT3活化，使p-STAT3增多，既可緩解神經(jīng)元的能量需求，又能增強細胞的缺血耐受，二者共同作用可能是減輕皮質(zhì)神經(jīng)元損傷，縮小梗死面積的機制所在。此結(jié)果與我們先前關(guān)于IPoC使樹鼩缺血神經(jīng)元Akt Ser473和Thr308位點磷酸化的結(jié)果一致[4]，且與Cheng等[13]報道的IPoC可提高大腦半暗區(qū)的細胞存活能力的結(jié)果相吻合。然而，經(jīng)STAT3抑制劑AG490處理后，神經(jīng)元STAT3磷酸化水平明顯降低，神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)可見核膜不清，線粒體固縮及空泡增多，缺血性損傷又有所加重；由于IPoC的保護作用因抑制劑的應用而明顯削弱，腦梗死面積因此而擴大。以上結(jié)果可概括為兩方面：一是IPoC可以通過激活JAK2/STAT3信號通路，減輕神經(jīng)元損傷而發(fā)揮腦保護作用；二是抑制JAK2/STAT3通路則可干擾STAT3的磷酸化而消除IPoC介導的腦保護效應。IPoC不僅可改善樹鼩缺血區(qū)局部腦血流，促進緊密連接蛋白occludin/ZO-1蛋白表達，進而減輕腦水腫[17]；還可抑制腦組織Toll樣受體4 mRNA及髓過氧化物酶的表達，減輕腦內(nèi)炎癥反應[18]；而肢體缺血后適應也可促進缺血腦區(qū)熱休克蛋白70表達，抑制小鼠的腦缺血再灌注損傷[19]。而某些藥物如七氟醚后處理也可通過JAK2/STAT3信號通路減少線粒體ROS的產(chǎn)生而增加線粒體ATP含量，進而減少細胞凋亡和梗塞面積[20]。事實上，IPoC介導的“機械信號轉(zhuǎn)導”及其對“JAK2/STAT3”等信號通路的調(diào)控可能在增強機體內(nèi)部抗損傷能力，抑制神經(jīng)元繼發(fā)性損傷中起著重要作用[17,21]。盡管JAK2/STAT3信號通路在IPoC的保護中發(fā)揮著重要作用，但目前對STAT3的上游和下游信號轉(zhuǎn)導及其與其它信號通路間的相互關(guān)系仍有待進一步研究。

Figure 5. Representative images and quantitative analysis of Western blot for determining the protein levels of t-STAT3 and p-STAT3 in ischemic cortex in tree shrews 24 h after IPoC and AG490 treatment. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsischemia group;▲P<0.05vsIPoC group.

圖5Westernblot檢測IPoC及AG490處理后皮層t-STAT3和p-STAT3蛋白水平的變化

[1] Liang Z, Wu G, Fan C, et al. The emerging role of signal transducer and activator of transcription 3 in cerebral ischemic and hemorrhagic stroke[J]. Prog Neurobiol, 2016, 137:1-16.

[2] 李樹清， 羅海蕓. 缺血后適應對樹鼩海馬區(qū)腦血流及星形膠質(zhì)細胞活化的影響及可能機制[J]. 中國病理生理雜志, 2008, 24(6):1090-1095.

[3] Gao X, Zhang H, Takahashi T, et al. The Akt signaling pathway contributes to postconditioning’s protection against stroke; the protection is associated with the MAPK and PKC pathway[J]. J Neurochem, 2008, 105(3):943-955.

[4] 湯 諹， 李樹清， 李 凡， 等. 缺血后適應對樹鼩海馬區(qū)神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導調(diào)控機制的研究[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(3):560-565.

[5] Shimohata T, Zhao H, Steinberg GK. PKC may contribute to the protective effect of hypothermia in a rat focal cerebral ischemia model[J]. Stroke, 2007, 38(2):375-380.

[6] Shi X, Franko B, Frantz C, et al. JSI-124 (cucurbitacin I) inhibits Janus kinase-3/signal transducer and activator of transcription-3 signalling,downregulates nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase (ALK),and induces apoptosis in ALK-positive anaplastic large cell lymphoma cells[J]. Br J Haematol, 2006, 135(1):26-32.

[7] 宗林飛， 向曉輝， 夏時海. STAT3信號轉(zhuǎn)導在胰腺炎發(fā)病機制中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(3):558-563.

[8] Tian Y, Zhang W, Xia D, et al. Postconditioning inhibits myocardial apoptosis during prolonged reperfusion via a JAK2-STAT3-Bcl-2 pathway[J]. J Biomed Sci, 2011, 18:53.

[9] Reina-De La Torre F, Rodriguez-Baeza A, Sahuquillo-Barris J. Morphological characteristics and distribution pattern of the arterial vessels in human cerebral cortex: a scanning electron microscope study[J]. Anat Rec, 1998, 251(1):87-96.

[10] Wolfrom-Gabel R, Maillot C. Vascular networks of the nucleus lentiformis[J]. Surg Radial Anat, 1994, 16(4):373-377.

[11] Rieke GK, Bowers DE Jr, Penn P. Vascular supply pattern to rat caudatoputamen and globus pallidus: scanning electronmicroscopic study of vascular endocasts of stroke-prone vessels[J]. Stroke, 1981, 12(6):840-847.

[12] 趙彥瑞， 劉 洋， 王 東， 等. PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路在SO2抗大鼠肢體缺血再灌注至急性肺損傷中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(11): 2076-2082.

[13] Cheng Z, Li L, Mo X, et al. Non-invasive remote limb ischemic postconditioning protects rats against focal cerebral ischemia by upregulating STAT3 and reducing apoptosis[J]. Int J Mol Med, 2014, 34(4):957-966.

[14] Jang SS, Choi JH, Im DS, et al. The phosphorylation of STAT6 during ischemic reperfusion in rat cerebral cortex[J]. Neuroreport, 2014, 25(1):18-22.

[15] Chen Z, Trapp BD. Microglia and neuroprotection[J]. J Neurochem, 2016, 136(Suppl 1):10-17.

[16] Shrivastava K, Llovera G, Recasens M, et al. Temporal expression of cytokines and signal transducer and activator of transcription factor 3 activation after neonatal hypoxia/ischemia in mice[J]. Dev Neurosci, 2013, 35(2-3):212-225.

[17] 李樹清， 李 凡， 何 亮， 等. 缺血后適應促進樹鼩血栓性腦缺血時緊密連接occludin /ZO-1蛋白表達及抑制腦水腫的機制[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(3):477-484.

[18] Feng R, Li S, Li F. Toll-like receptor 4 is involved in ischemic tolerance of postconditioning 6 in hippocampus of tree shrews to thrombotic cerebral ischemia[J]. Brain Res, 2011, 1384(15):118-127.

[19] 趙 瑾， 李 楊， 黃 磊， 等. 肢體缺血后適應對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響及機制[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(6):1096-1101.

[20] Wu J, Yu J, Xie P, et al. Sevoflurane postconditioning protects the myocardium against ischemia reperfusion injury via activation of the JAK2-STAT3 pathway[J]. PeerJ, 2017, 5:e3196.

[21] Lin J, Wang T, Li Y, et al. N-acetylcysteine restores sevoflurane postconditioning cardioprotection against myocardial ischemia-reperfusion injury in diabetic rats[J]. J Diabetes Res, 2016, 2016:9213034.

Mechanism of JAK2-STAT3 signaling pathway in ischemic postconditio-ning neuroprotection after cerebral ischemia in tree shrews

LI Xia, LI Shu-qing

(DepartmentofPathophysiology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China.E-mail:shuqing28@hotmail.com)

AIM: To investigate the regulatory effect of JAK2-STAT3 signaling pathway on the neuroprotection of ischemic postconditioning (IPoC) in tree shrews, and to explore the mechanisms of cerebral injury deterioration after inhibiting the JAK2-STAT3 pathway.METHODSThe model of thrombotic cerebral ischemia was induced by photochemical reaction in tree shrews and the IPoC was established at 4 h after ischemia followed by clipping ipsilateral common carotid artery on the ischemia side for 5 min (3 times). After IPoC and intracerebroventricular injection of AG490 (JAK2 inhibitor), the changes of cerebral infarction area were detected by TTC staining, and the histological and ultrastructural changes of cortical neurons were observed under light and electron microscopes, respectively. The protein levels of t-STAT3 and p-STAT3 in the cortical tissue were determined by Western blot.RESULTSThe neuronal pycnosis, mitochondrial swelling and vanish of the mitochondrial cristae were found in cortical cortex, and the infarction area was (24.78±3.30)% at 24 h after cerebral ischemia. Meanwhile, the phosphorylation level of STAT3 protein in the cortical tissue was significantly increased (P<0.01). The cortical neuronal damage and mitochondrial swelling were decreased after IPoC, the area of cerebral infarction was significantly reduced to (17.67±1.83)% (P<0.01), and the phosphorylation level of STAT3 protein was further increased (P<0.01). However, the neuronal damage was aggravated， the infarction area was expanded to (23.85±2.77)%(P<0.05) after treatment with AG490, and the phosphorylation level of STAT3 protein was also significantly reduced (P<0.05).CONCLUSIONIPoC may reduce cerebral injury by regulating the phosphorylation of STAT3 protein, and inhibition of JAK2-STAT3 signaling pathway may counteract the cerebral protective effect of IPoC and aggravate brain injury.

Photochemistry reaction; Ischemic postconditioning; JAK2-STAT3 signaling pathway; Neuroprotection; Tree shrews

1000- 4718(2017)12- 2121- 07

2017- 08- 18

2017- 10- 20

國家科技支撐計劃項目(No.2014BAI01B01)；國家自然科學基金資助項目(No.30971171)；云南省教育廳科研基金資助項目(No.2014C042Y)

△通訊作者Tel: 0871-65922858； E-mail： shuqing28@hotmail.com

R743.3； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.002

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)