辛二酰苯胺異羥肟酸通過內質網應激凋亡通路誘導HepG2細胞凋亡*

余 蕾， 韓 冰， 田 甜， 鄭 璐， 楊 婷， 劉 幸， 湯 雷， 羅 軒， 楊 勤， 謝汝佳

(貴州醫科大學病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550000)

辛二酰苯胺異羥肟酸通過內質網應激凋亡通路誘導HepG2細胞凋亡*

余 蕾， 韓 冰， 田 甜， 鄭 璐， 楊 婷， 劉 幸， 湯 雷， 羅 軒， 楊 勤△， 謝汝佳△

(貴州醫科大學病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550000)

目的探討辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)對人肝癌細胞株HepG2增殖與凋亡的影響及其可能的機制。方法分別給予不同濃度的SAHA處理HepG2細胞48 h，采用實時無標記細胞分析法檢測細胞增殖情況；Western blot法檢測組蛋白H3K9和H3K27的乙酰化水平，以及葡萄糖調節蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R樣內質網激酶(PERK)和p-PERK蛋白水平的變化；流式細胞術檢測細胞凋亡。結果與對照組相比，0.1和1 μmol/L SAHA處理48 h對HepG2細胞增殖無明顯抑制作用，6和12 μmol/L SAHA組HepG2細胞增殖率明顯下降(P<0.05)；Western blot檢測發現，與對照組比較，不同濃度的SAHA處理細胞48 h后，acH3K9和acH3K27表達水平明顯升高，GRP78蛋白表達顯著上調，PERK蛋白表達顯著下調，而p-PERK的蛋白水平顯著增加(P<0.05)；流式細胞術檢測發現，隨著SAHA濃度的增高，HepG2細胞的凋亡逐漸增加。結論SAHA可上調HepG2細胞中組蛋白H3K9和H3K27的乙酰化修飾水平，并通過激活內質網應激相關凋亡通路來誘導HepG2細胞發生凋亡。

肝細胞癌； 細胞凋亡； 內質網應激； 辛二酰苯胺異羥肟酸

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最高發的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發病率第5位，死亡率第3位[1]，而我國的肝癌發病人數占全球的51%。HCC是一種易侵襲、易轉移的惡性腫瘤，目前以手術治療為主，輔以化療，早期發現預后較好，5年生存率高于70%；由于肝癌發生較為隱匿，大多數患者就診時已屬晚期，手術切除率低，預后較差，致使5年生存率低于16%[2]。目前有研究證實肝癌細胞中組蛋白乙酰化水平下調可能與肝細胞癌的發生發展密切相關[3]，因此，使用組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase，HDAC)抑制劑治療肝細胞癌成為一種潛在的治療途徑。

辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)作為首個被美國FDA批準臨床使用的HDAC抑制劑[4]，其抗腫瘤的作用已受到廣泛關注，但其抗腫瘤的機制尚未被完全闡明。有研究發現，SAHA可通過上調細胞周期相關蛋白p53和p21等進而抑制腫瘤細胞增殖。由于腫瘤的發生除了與細胞增殖過度有關，也與細胞凋亡減少密切相關，因此本實驗用不同濃度的SAHA作用于人肝癌細胞HepG2，觀察其對組蛋白H3K9和H3K27乙酰化修飾水平、內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡通路中相關蛋白表達及細胞凋亡的影響，為進一步闡明SAHA抗腫瘤的機制提供理論依據。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

人肝癌細胞株HepG2(中國科學院典型培養物保藏中心上海細胞庫，編號KCB 200507YJ)；DMEM培養基和胎牛血清(Gibco)；胰酶和彩虹Marker(北京索萊寶科技有限公司)；DMSO(Sigma)；細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒和Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術有限公司)；抗β-actin抗體、山羊抗兔IgG+H、兔抗乙酰化H3K9(acetylated H3K9，acH3K9)抗體、兔抗乙酰化H3K27(acetylated H3K27，acH3K27)抗體和SAHA(Abcam)。

2 主要方法

2.1實時無標記細胞分析法(real-time cellular ana-lysis，RTCA)檢測不同濃度SAHA對HepG2細胞增殖的影響 RTCA DP細胞功能分析系統通過 E-Plate底部的電極檢測貼壁細胞的電阻抗，可反映細胞的數量、活力、 形態以及貼壁情況，以細胞指數(cell index，CI)作為檢測指標。取對數生長期的HepG2 細胞制成細胞懸液并進行細胞計數，以每孔1×104細胞的密度接種于E-Plate，10 h后分別加入終濃度為0.1、1、6、12、25、50和100 μmol/L的SAHA處理細胞，對照組不予SAHA處理，每個濃度設置3個復孔。連續動態監測72 h，觀察不同濃度SAHA對HepG2細胞增殖的影響，每15 min記錄1次。RTCA軟件分析處理CI值。根據RTCA實驗結果確定后續實驗中SAHA的給藥濃度。

2.2倒置顯微鏡觀察HepG2細胞形態學的變化 取對數生長期的HepG2細胞，細胞融合度達80%左右時，將細胞隨機分為對照組(不予SAHA處理)、1 μmol/L SAHA組、6 μmol/L SAHA組及12 μmol/L SAHA組(SAHA給藥濃度由RTCA實驗結果確定)。觀察不同濃度SAHA處理HepG2細胞48 h后的細胞形態學變化。

2.3流式細胞術檢測細胞凋亡情況 取對數生長期的HepG2細胞，制成細胞懸液并進行細胞計數，在每個無包被的塑料皿(10 cm)中鋪1×106個細胞，置于CO2培養箱中培養24 h后，將細胞隨機分為對照組(不予SAHA處理)、1 μmol/L SAHA組、6 μmol/L SAHA組及12 μmol/L SAHA組，給藥48 h后用不含EDTA的胰酶消化收集細胞，制備密度為1×108/L的細胞懸液，取1 mL離心除去上清液，加入Annexin-V-FITC結合液195 μL重懸，再先后加入Annexin V-FITC 5 μL和碘化丙啶染色液10 μL，在室溫下避光孵育20 min后置于冰浴中，流式細胞儀檢測。

2.4Western blot法檢測組蛋白H3K9和H3K27的乙酰化水平及葡萄糖調節蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)和p-PERK蛋白水平的變化 收集各組細胞，分別加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min，收集細胞懸液，超聲破碎，12 000 r/min、4 ℃離心20 min，棄沉淀，收集上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，取40 μg總蛋白上樣，行SDS-PAGE，電泳結束后轉移蛋白至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉90 min，分別加入1∶1 500稀釋的兔抗GRP78、PERK和p-PERK抗體，1∶5 000稀釋的兔抗acH3K9抗體及1∶1 000稀釋的兔抗 acH3K27抗體，4 ℃搖床孵育過夜。第2天用TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶4 000)，室溫孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發光成像，分別以β-actin和H3為內參照。條帶用Image Lab圖像分析軟件對每個條帶灰度值進行定量分析。

3 統計學處理

用SPSS 20.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 RTCA 動態監測HepG2細胞增殖情況

鋪板約10 h 后進行加藥處理，取此時 CI 值標準化為 1。RTCA動態監測結果顯示，與對照組比較，0.1 μmol/L和1 μmol/L SAHA處理HepG2細胞48 h均對HepG2細胞無明顯的抑制作用，6 μmol/L SAHA組在藥物作用48 h后，可明顯抑制HepG2細胞增殖(P<0.05)，隨著SAHA濃度增加，HepG2細胞增殖進一步受到抑制，且濃度越高對HepG2細胞增殖的抑制作用越明顯，見圖1。

Figure 1. Dynamic monitoring of the normalized cell index and the viability (48 h) of HepG2 cells treated with different concentrations of SAHA detected by RTCA xCELLigence system. Mean±SD.n=8.*P<0.05vscontrol group.

圖1RTCAxCELLigence系統動態監測不同濃度SAHA處理HepG2細胞的標準化細胞指數和處理48h的細胞存活率

2 觀察不同濃度SAHA處理對HepG2 細胞形態學變化的影響

分別采用1 μmol/L、6 μmol/L和12 μmol/L SAHA處理HepG2 細胞48 h后在倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化。結果可見，對照組HepG2 細胞聚團生長，細胞間連接緊密，邊緣光滑，上清液中幾乎沒有漂浮死亡的細胞；1 μmol/L SAHA處理組細胞與對照組細胞相比，形態學變化不明顯，少數細胞體積縮小，上清液中可見少許漂浮的死亡細胞；以6 μmol/L和12 μmol/L SAHA處理細胞后，細胞生長明顯受到抑制，活細胞數目明顯減少，細胞邊緣不光滑，折光率下降，貼壁不良，見圖2。

Figure 2. The effect of SAHA on the morphological changes of HepG2 cells observed under inverted microscope (×100).

圖2倒置顯微鏡下觀察不同濃度SAHA處理HepG2細胞48h對細胞形態學變化的影響

3 流式細胞術檢測不同濃度SAHA對HepG2細胞凋亡的影響

不同濃度SAHA 作用于 HepG2細胞48 h 后通過流式細胞術檢測發現，對照組細胞凋亡率為(10.10±1.73)%，1 μmol/L SAHA 組細胞凋亡率為(14.63±0.86)%，較對照組顯著增加(P<0.05)；隨著SAHA濃度的增高，6 μmol/L及12 μmol/L SAHA組細胞凋亡率進一步增高，分別為(19.77±2.06)%及(36.60±1.64)%，與對照組及1 μmol/L SAHA 組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖3。這說明SAHA作用于HepG2細胞48 h能明顯促進HepG2細胞凋亡。

Figure 3. The effect of SAHA at different concentrations for 48 h on the apoptotic rate of HepG2 cells. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vs1 μmol/L SAHA group.

圖3不同濃度SAHA處理HepG2細胞48h對HepG2細胞凋亡的影響

4 不同濃度 SAHA處理HepG2 細胞48 h 后組蛋白H3K9和H3K27乙酰化水平及GRP78、PERK和p-PERK蛋白水平的變化

Western blot法檢測結果顯示，與對照組比較，1 μmol/L SAHA 處理HepG2細胞48 h后，組蛋白H3K9和H3K27 乙酰化修飾水平增加不明顯；6 μmol/L SAHA 組和12 μmol/L SAHA組細胞組蛋白H3K9和H3K27乙酰化修飾水平明顯增加(P<0.05)。與對照組比較，1 μmol/L、6 μmol/L和12 μmol/L SAHA組細胞中GRP78和p-PERK蛋白表達水平均明顯增加(P<0.05)，而PERK蛋白表達明顯減少(P<0.05)，見圖4。

討 論

組蛋白乙酰化/去乙酰化被認為是調控真核細胞基因轉錄的一種關鍵機制。組蛋白乙酰化水平取決于組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetyltransferases，HATs)和HDACs兩個酶家族之間的動態平衡。體內HATs和HDACs的動態平衡一旦被打破，就會導致基因轉錄的失調，引起原癌基因的激活和抑癌基因的失活，進而導致細胞增殖失常而引發腫瘤的發生[5]。目前研究證實，在腫瘤細胞中組蛋白大多呈低乙酰化狀態，而其中由HDACs異常導致的組蛋白乙酰化狀態失衡與腫瘤的發生和發展有密切關系[6-7]。大量的實驗研究表明，肝癌的發生發展過程中存在著HDACs高表達及組蛋白乙酰化水平下調[8]，因此，采用去乙酰化酶抑制劑抑制HDACs的活性成為抗腫瘤的方法之一。SAHA作為一種已經應用于臨床試驗的組蛋白去乙酰化酶抑制劑，它以微摩爾濃度即可提高組蛋白乙酰化水平，從而誘導腫瘤細胞生長停滯、分化或凋亡。

本實驗采用不同濃度的SAHA作用于HepG2細胞，通過RTCA法動態監測其對HepG2細胞增殖的抑制作用。結果發現，隨著SAHA濃度的增加，它對HepG2細胞增殖的抑制作用也隨之增加，這與Kim等[9]的研究結果是一致的。目前認為SAHA抑制腫瘤細胞增殖的可能機制是提高組蛋白乙酰化水平，有利于染色質的重塑，從而誘導腫瘤細胞生長停滯、分化和凋亡。通過Western blot檢測發現，6 μmol/L和12 μmol/L SAHA處理HepG2細胞后，細胞中H3K9和H3K27乙酰化修飾水平明顯增加。提示SAHA對肝癌細胞的抑制作用可能與H3K9和H3K27的乙酰化修飾水平上調有關，但其具體的機制還不十分清楚。

內質網是真核細胞重要的細胞器之一，是蛋白質合成、折疊和轉運的場所。但是一些病理因素，如內質網鈣代謝紊亂、缺血再灌注損傷和氧化應激等可導致ERS的發生[9]。ERS 可使細胞產生未折疊蛋白反應(unfolded protein reaction，UPR)來緩解ERS，從而使內質網的功能恢復穩定[10]。目前認為ERS主要涉及的內質網跨膜效應蛋白有需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1)、PERK和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)[11]。 正常情況下，這3種蛋白在內質網腔內都與GRP78結合而處于無活性狀態，當發生ERS時，內質網中有大量未折疊蛋白聚集，由于GRP78與未折疊蛋白具有更高的親和力，導致GRP78與 PERK、ATF6和IRE1解離。解離后的GRP78可與內質網腔中的未折疊蛋白結合，由此促進蛋白質的正確折疊，對細胞發揮保護作用。 然而，當ERS嚴重或持續得不到緩解，則通過內質網應激誘導的凋亡通路而觸發細胞死亡[12]。本實驗通過Western blot檢測各組HepG2 細胞中GRP78蛋白水平的變化，結果發現不同濃度SAHA處理細胞后，GRP78蛋白表達水平較對照組顯著增高。由于GRP78是ERS的標志蛋白，提示SAHA可以誘導HepG2細胞發生ERS。關于SAHA誘導GRP78表達增高的機制可能與SAHA上調組蛋白H3K9和H3K27的乙酰化水平有關。因為組蛋白乙酰化水平上調后可使染色質的基本結構單位——核小體的結構變得松弛，從而促進轉錄因子和協同轉錄因子與DNA分子的接觸，進而上調GRP78的表達。有研究人員發現組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA可通過抑制HDAC1增加GRP78的表達[13]；還有研究發現組蛋白H3總的乙酰化水平上調可以促進GRP78的表達[14]，這與我們的研究結果是一致的。

Figure 4. The protein levels of acH3K9, acH3K27, GRP78, PERK and p-PERK in the HepG2 cells exposed to SAHA at different concentrations for 48 h. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖4不同濃度SAHA處理HepG2細胞48h對組蛋白H3K9和H3K27的乙酰化水平及GRP78、PERK和p-PERK蛋白水平的影響

本次研究還發現不同濃度SAHA處理HepG2細胞后，細胞中PERK蛋白的表達水平較對照組顯著減少，而p-PERK蛋白的水平則較對照組顯著增加。引起這一變化的原因可能是SAHA誘導HepG2細胞發生ERS后，GRP78與PERK解離，解離后的PERK發生自身二聚化和磷酸化而激活，從而使細胞中PERK的表達水平降低，而p-PERK的蛋白水平增高。有研究發現p-PERK能特異性上調細胞中ATF4和CHOP的表達，從而激活ERS誘導的凋亡信號通路，最終導致細胞凋亡的發生[15-16]。本次實驗中采用不同濃度SAHA處理HepG2細胞48 h后，檢測其凋亡發現，隨著藥物濃度的增加，HepG2細胞的凋亡隨之增加，推測可能是由于SAHA誘導HepG2細胞發生ERS后激活了ERS誘導的凋亡信號通路的結果。

綜上所述，HDAC抑制劑SAHA可抑制HepG2細胞增殖并誘導其凋亡。SAHA激活ERS相關的凋亡通路從而誘導HepG2細胞發生凋亡可能是其抗肝癌的機制之一。

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Suberoylanilide hydroxamic acid induces apoptosis of HepG2 cells by endoplasmic reticulum stress apoptotic pathway

YU Lei, HAN Bing, TIAN Tian, ZHENG Lu, YANG Ting, LIU Xing, TANG Lei, LUO Xuan, YANG Qin, XIE Ru-jia

(DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550000,China.E-mail:xierujia790319@163.com；qinyang@gmc.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) on the proliferation and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and to explore its possible mechanism.METHODSHepG2 cells were treated with SAHA at different concentrations for 48 h. The proliferation of HepG2 cells was detected by real-time cellular analysis. The protein levels of acetylated histones H3K9 and H3K27, glucose-regulated protein 78 (GRP78), protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) and p-PERK were determined by Western blot. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry.RESULTSCompared with control group, treatment with SAHA at 0.1 μmol/L and 1 μmol/L for 48 h showed no significant inhibitory effect on the proliferation of HepG2 cells, while SAHA at 6 μmol/L and 12 μmol/L significantly inhibited the proliferation of HepG2 cells (P<0.05). The results of Western blot showed that the protein levels of acH3K9, acH3K27, GRP78 and p-PERK increased significantly after treated with SAHA at diffe-rent concentrations for 48 h, while the protein level of PERK was decreased significantly (P<0.05). The results of flow cytometry analysis showed that the apoptotic rates of the HepG2 cells increased with the increase in SAHA concentration.CONCLUSIONSAHA up-regulates the acetylation of H3K9 and H3K27 in the HepG2 cells and induces apoptosis of HepG2 cells by activating the endoplasmic reticulum stress-related apoptosis pathway.

Hepatocellular carcinoma; Apoptosis; Endoplasmic reticulum stress; Suberoylanilide hydroxamic acid

1000- 4718(2017)12- 2151- 06

2017- 05- 23

2017- 08- 07

國家自然科學基金資助項目(No. 81560105)；貴州省教育廳自然科學研究項目(黔教合KY字 [2014]269)；貴州省科技廳基金資助項目(黔科合LH字[2014]7074)

△通訊作者 謝汝佳 Tel: 13985441220； E-mail: xierujia790319@163.com； 楊 勤 Tel: 13985013402； E-mail: qinyang@gmc.edu.cn

R329.21； R735.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.007

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)