Erk1/2失活對FGF21調節糖脂代謝調控的影響*

吳朝明， 鄭巨佳， 潘瑩瑩， 葉艷娜， 潘薛波， 林灼鋒, 3△

(溫州醫科大學 1附屬第二醫院， 2藥學院， 浙江 溫州 325035； 3暨南大學附屬第一醫院， 廣東 廣州 510630)

Erk1/2失活對FGF21調節糖脂代謝調控的影響*

吳朝明1， 鄭巨佳2， 潘瑩瑩2， 葉艷娜2， 潘薛波2， 林灼鋒2, 3△

(溫州醫科大學1附屬第二醫院，2藥學院， 浙江 溫州 325035；3暨南大學附屬第一醫院， 廣東 廣州 510630)

目的探索細胞外信號調節激酶1/2(Erk1/2)失活對成纖維細胞生長因子21(FGF21)調節機體血糖平穩及改善異常血脂的影響。方法選取8～10周齡雄性db/db小鼠，給予Erk1/2激酶抑制劑U0126(抑制Erk1/2磷酸化，使之失活)處理1周后，再分別給予重組人FGF21蛋白和腺病毒攜帶的FGF21(Ad-FGF21)處理，觀察120 min內及4周后小鼠血糖、血脂及其相關調控基因的變化；同時，從體外細胞培養方面探索其分子機制。結果給予db/db小鼠重組人FGF21蛋白處理120 min能顯著下調血糖和甘油三酯水平，但這與U0126處理與否無關。給予Ad-FGF21處理4周能顯著改善db/db小鼠異常血糖水平及葡萄糖和胰島素耐受能力，降低機體脂肪含量，并改善異常血清甘油三酯水平，然而，這些變化仍與U0126處理與否無關。此外，在細胞信號轉導的分子機制方面，Ad-FGF21處理能顯著上調皮下脂肪組織Erk1/2磷酸化活性及過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的表達水平，同時上調機體脂聯素(adiponectin)mRNA及蛋白的表達水平(P<0.05)，但與U0126處理與否無關。在體外實驗方面，FGF21處理能顯著激活Erk1/2磷酸化，并上調PPARγ和adiponectin的表達水平；然而，給予U0126處理并不能抑制PPARγ和adiponectin的表達。結論FGF21具有調節機體血糖平穩及改善異常血脂的生物學功能，但Erk1/2失活可能不影響FGF21調節血糖血脂的功能。

成纖維細胞生長因子21； 細胞外信號調節激酶1/2； 胰島素增敏效應； 糖脂代謝紊亂

糖尿病是常見的代謝性疾病，其發病機制與機體糖脂代謝紊亂和對胰島素的敏感性下降有關。成纖維細胞生長因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)是一種新型的糖脂代謝調控內分泌因子。我們前期的研究發現，FGF21能夠由脂聯素(adiponectin)介導對胰島素起到增敏的作用，從而調節小鼠血糖水平[1]。然而，FGF21通過何種信號途徑發揮其降糖降脂作用仍不清楚。細胞外信號調節激酶 1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，Erk1/2)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路參與廣泛的生理過程。相關研究證明，FGF21能夠通過增加Erk1/2磷酸化，降低肝臟HepG2細胞載脂蛋白的表達[2]，增加巨噬細胞源性泡沫細胞THP-1膽固醇外流[3]，刺激下丘腦神經元表達促腎上腺皮質激素釋放素，從而維持血糖穩態[4]，預防由高血脂或糖尿病引起的心肌細胞凋亡[5]。由此可知，Erk1/2 MAPK信號通路對FGF21生理作用的發揮起著重要的作用。我們的前期研究表明，FGF21通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)信號通路，上調脂聯素的表達和分泌。然而在這條通路里面，FGF21通過何種途徑刺激PPARγ并進一步傳遞信號的過程仍不清楚。本研究通過急性實驗和慢性實驗驗證，在血脂代謝紊亂的db/db肥胖小鼠中，FGF21的降糖和降脂作用是否與Erk1/2 MAPK信號通路有關。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

8～10周齡SPF 級db/db小鼠購自南方模式動物中心，體重(30.0±2.3) g，許可證號： SCXK(滬)2012-0002。飼養環境為室溫20～24 ℃, 相對濕度40%～60%，基礎飼料由溫州醫科大學實驗動物中心提供，自由攝食飲水，12 h/12 h交替照明。

2 主要試劑

人重組FGF21蛋白、U0126(Erk1/2激酶抑制劑，抑制Erk1/2磷酸化，使之失活)和HE染色相關試劑購自Sigma-Aldrich；限制性內切酶XbaI和BglII及T4 DNA連接酶購自NEB；pAd-Track-CMV-GFP、Lipofectamine 2000、Trizol、逆轉錄試劑盒和OneStep RT-PCR試劑盒購自Thermo Fisher Scienti-fic；DMEM液體培養基和胎牛血清購自Gibco；抗鼠Erk1/2、p-Erk1/2、PPARγ、脂聯素和F4/80多克隆抗體購自Cell Signaling Technology；FGF21、脂聯素和胰島素試劑盒購自AIS；甘油三酯(triglyceride，TG)檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；血糖儀及血樣試紙采用羅氏公司產品；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純。所用引物由Thermo Fisher Scientific根據設計合成，見表1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

3 主要方法

3.1小鼠分組及處理 急性實驗：取12只10周齡的雄性db/db小鼠，隨機分成實驗組(FGF2組)和對照組(control組)，每組6只，分別經尾靜脈注射0.5 mg/kg的FGF21和等量的PBS，檢測0、60和120 min時小鼠血糖、TG和胰島素水平。另取12只10周齡雄性db/db小鼠，以10 mg·kg-1·d-1劑量的 U0126處理1周以后，分為U0126+FGF21和U0126兩組，每組6只，經尾靜脈注射FGF21(0.5 mg/kg)和等量的PBS，檢測0、60和120 min時小鼠血糖、TG和胰島素水平。

慢性實驗：取8周齡的db/db雄性小鼠24只，隨機分成control組、Ad-FGF21組、U0126組和U0126+Ad-FGF21組4組， 給予正常飲食喂養。其中U0126和U0126+Ad-FGF21組給予腹腔注射U0126(10 mg·kg-1·d-1)；與此同時，U0126+Ad-FGF21組小鼠通過皮下腹腔注射FGF21重組表達腺病毒(1×108pfu/kg)處理，每2周1次；U0126組注射同等劑量的對照病毒并給予DMSO；Ad-FGF21組小鼠通過皮下腹腔注射FGF21重組表達腺病毒(1×108pfu/kg，每2周1次)并給予DMSO；control組注射同等劑量的對照病毒并給予DMSO(正常對照組)。處理4周以后，處死小鼠，收集器官組織，稱重，一部分固定于OCT組織包埋液中，制作冰凍切片，一部分置于-80 ℃冰箱中保存。

3.2葡萄糖耐受試驗 實驗前一晚用滅菌PBS配制250 g/L的葡萄糖溶液，各組小鼠禁食過夜16 h，第2天稱量小鼠體重，用尾部取血的方法測空腹血糖值；按2 g/kg 的劑量腹腔注射葡萄糖，分別檢測 0、15、30、60和90 min時的血糖值。

3.3胰島素耐受試驗 實驗前稱量小鼠體重并置于新籠，新鮮配制胰島素溶液，按1 mU/kg的劑量腹腔注射胰島素，測定0、20、40、60和80 min的血糖值。

3.4FGF21重組表達腺病毒的構建包裝 由于重組人FGF21蛋白在體外的半衰期非常短，因此，我們采用體外重組腺病毒表達的模式，進行動物實驗研究。即克隆人源的FGF21基因至質粒pUC-19上，將經雙酶切(XbaI和BglII)的FGF21基因序列插入到穿梭質粒pAd-Track-CMV-GFP中，構建成pAd-Track-FGF21質粒，并送公司測序鑒定有無基因突變。經過測序檢測無突變的pAd-Track-FGF21質粒線性化后，轉入含腺病毒骨架質粒pAdEasy-1的感受態大腸桿菌BJ5183中，構建腺病毒重組質粒pAdEasy-1-CMV-GFP-FGF21，將該質粒線性化以后轉染HEK-293A細胞，獲得FGF21重組表達腺病毒，再經過擴增培養后進行純化，獲得高純度的FGF21重組表達腺病毒。

將包裝好的重組腺病毒pAdEasy-1-FGF21和空載重組腺病毒pAdEasy-1(陰性對照)感染HEK-293A細胞，48 h后收集細胞，提取總蛋白，經SDS-PAGE后，轉膜，封閉。Western blot結果顯示，空載重組腺病毒pAdEasy-1沒有條帶，而重組腺病毒pAdEasy-1-FGF21可見到與FGF21蛋白標準品一致的位置有條帶，說明表達的蛋白正確。

3.5油紅O染色 切片干燥后入50%乙醇稍洗，用油紅O乙醇染液作用8 min，再用50%乙醇分化，自來水終止分化后蘇木素復染核，自來水返藍，甘油明膠封片。

3.6ELISA檢測 按照廠家提供的說明書操作。

3.7Real-time PCR 采用Trizol試劑提取組織總RNA，NanoDrop超微量分光光度計測定總RNA含量。取1.0 μg RNA進行一步法行逆轉錄，總反應體積20.0 μL。逆轉錄完成后取1 μL cDNA進行real-time PCR。擴增條件為： 95 ℃初始化15 min； 94 ℃變性1 min， 55 ℃ 1 min， 72 ℃ 1 min， 40個循環； 72 ℃ 10 min。

3.8Western blot 提取小鼠皮下脂肪組織和附睪脂肪組織總蛋白，BCA 法測定總蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離，PVDF 膜印跡，10%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，分別加入抗GAPDH(1∶1 000)、Erk1/2(1∶1 000)、p-Erk1/2(1∶1 000)和抗PPARγ(1∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜。用封閉液稀釋相應的經辣根過氧化物酶標記的II 抗(1∶5 000)，37 ℃搖床孵育1 h。洗去多余 II 抗，經ECL 發光液發光、X 光膠片壓片后顯影、定影。分析膠片灰度值，確定樣品中目的蛋白相對含量。

3.9小鼠皮下脂肪細胞原代培養 小心剝離小鼠皮下脂肪組織，用滅菌的手術剪剪碎，將組織塊放入瓶內，然后加入 1 mL膠原蛋白酶液。37 ℃水浴振蕩器孵育約 1 h，直至細胞混合物形成乳脂樣濃稠液體；加入 4 mL KRBH 緩沖液(37 ℃)，250 μm孔徑的濾網過濾， KRBH 緩沖液(37 ℃)洗細胞3次。用DMEM-A 培養液[DMEM，pH 7.4，添加 25 mmol/L 葡萄糖、2 mmol/L 谷氨酰胺、200 nmol/L (R)-N6-(1-甲基-2-苯乙基)腺苷、100 mg/L 慶大霉素和 25 mmol/L HEPES]于37 ℃、5 % CO2條件下培養。

4 統計學處理

用SPSS 16.0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間數據比較采用Bonferroni校正t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 尾靜脈注射FGF21的急性實驗及抑制Erk1/2信號通路的影響

與對照組小鼠相比，db/db小鼠給予尾靜脈注射FGF21 (0.5 mg/kg)后，在60 min內具有降低小鼠的血糖、TG和胰島素含量的趨勢，在120 min時，db/db小鼠的血糖、TG和胰島素下調水平進一步增加(P<0.05)，見圖1。

為了探索Erk1/2信號通路對FGF21調節血糖、TG和胰島素水平的影響，db/db小鼠給予U0126(10 mg·kg-1·d-1)處理1周以后，尾靜脈注射FGF21(0.5 mg/kg)。與正常對照組相比較，單純U0126處理并不影響db/db小鼠的血糖、血脂和胰島素水平；與單純FGF21處理組結果相似，U0126預處理1周，并不影響FGF21下調db/db小鼠的血糖、血脂和胰島素水平，兩者之間的差異無統計學顯著性，見圖1。

上述結果表明，在尾靜脈注射FGF21的急性實驗中， 采用U0126抑制Erk1/2信號通路不影響FGF21下調db/db小鼠血糖、甘油三酯和胰島素的生物學功能。

Figure 1. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway (A) did not affect the acute effect of FGF21 on blood glucose (B), triglyceride (TG； C) and insulin (D) indb/dbmice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsFGF21 group;△P<0.05vsU0216 group.

圖1抑制Erk1/2信號通路對注射FGF21急性實驗后小鼠血糖、甘油三酯和胰島素的影響

2 腺病毒介導轉染FGF21的慢性實驗

2.1腺病毒介導轉染FGF21改善db/db小鼠異常的血糖水平，改善葡萄糖和胰島素耐受能力 ELISA檢測結果顯示，分別與control和U0126組相比，Ad-FGF21和U0126+Ad-FGF21組小鼠的FGF21血清循環水平在注射FGF21重組表達腺病毒第3天后就顯著上升，1周后上調約2.5倍，見圖2A。此外，FGF21重組表達腺病毒處理后第4周的糖耐受和胰島素耐受能力得到明顯改善，但與U0126處理與否差異無統計學顯著性，見圖2B、C。與control和U0126組小鼠相比，Ad-FGF21和U0126+Ad-FGF21組注射Ad-FGF21 4周后，小鼠血糖水平隨著體內的FGF21和胰島素循環水平上調而顯著下調，但這2組之間血糖和胰島素下調幅度的差異無統計學顯著性，見圖3A～C。上述結果說明，轉染重組腺病毒表達FGF21能下調db/db小鼠血糖水平，改善db/db小鼠的糖耐受及胰島素耐受能力，但這些功能與Erk1/2信號通路失活并無關系。

Figure 2. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect the effect of FGF21 on the glucose tolerance and insulin resistance in mice. A: circulating FGF21 levels during 4 weeks of Ad-FGF21 administration; B and C: glucose tolerance and insulin tolerance tests at the 4th week of Ad-FGF21 treatment. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsU0216 group.

圖2Ad-FGF21處理4周血清FGF21循環水平的變化及第4周葡萄糖耐受和胰島素耐受狀況

2.2腺病毒介導轉染FGF21降低db/db小鼠的異常甘油三酯水平 分別與control和U0126組小鼠相比，Ad-FGF21和U0126+Ad-FGF21組注射Ad-FGF21 4周后，小鼠的甘油三酯水平隨著體內的FGF21循環水平上調而顯著下調(P<0.05)，但這2組間甘油三酯水平下調幅度的差異無統計學顯著性，見圖3D。上述結果表明，腺病毒介導表達的FGF21具有降低甘油三酯的功能，但與Erk1/2失活無關。

Figure 3. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect the effect of FGF21 on glucose, insulin and triglyceride (TG) indb/dbmice. A: cirulating level of FGF21 at the 4th week； B: blood glucose level； C: serum insulin level； D: serum TG level. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group;△P<0.05vsU0126 group.

圖3Ad-FGF21處理4周后小鼠血清FGF21、葡萄糖、胰島素及甘油三酯的變化

2.3腺病毒介導轉染FGF21對db/db小鼠各主要器官重量和組織形態學的影響 與正常對照組相比較，db/db小鼠單獨注射U0126后，小鼠各主要臟器占體重的比值沒有顯著變化；而單獨注射FGF21則顯著下調褐色及白色脂肪組織與小鼠體重的比值(P<0.05)，但U0126處理對FGF21降低脂肪/體重的比值并無顯著的影響，見圖4。此外，組織形態學分析結果也表明，FGF21處理后，脂肪細胞的面積顯著增加，巨噬細胞浸潤明顯減少，脂聯素表達明顯增加(P<0.05)，而U0126處理對FGF21引發的這些生物學效應并無明顯的影響，見圖5。上述結果表明，FGF21具有降低機體脂肪含量的生物學功能，但該效應與Erk1/2信號通路失活無關。

2.4腺病毒介導轉染FGF21顯著上調皮下脂肪組織Erk1/2的磷酸化及PPARγ的表達水平 與正常對照組相比，給予Ad-FGF21處理4周后，小鼠皮下脂肪中Erk1/2磷酸化活性和PPARγ表達均顯著上調(P<0.05)；然而，U0126處理后，小鼠皮下脂肪中Erk1/2磷酸化活性和PPARγ表達均顯著降低(P<0.05)，同時給予Ad-FGF21處理后，小鼠皮下脂肪中Erk1/2磷酸化活性并沒有增加，但是PPARγ表達水平顯著增加，見圖6。

此外，我們發現，給予Ad-FGF21及U0126處理后，小鼠附睪脂肪中Erk1/2磷酸化活性和PPARγ表達的變化與皮下脂肪組織相似，見圖7。這些結果表明，在db/db小鼠脂肪組織中，FGF21處理引發的PPARγ表達上調可能與Erk1/2信號失活無關。

2.5腺病毒介導轉染FGF21對db/db小鼠adiponectin表達的影響 與正常對照組相比，給予Ad-FGF21處理4周后，db/db小鼠脂肪組織中adiponectin的mRNA和血清循環水平均顯著上調(P<0.05)；而單獨給予U0126處理4周并不影響小鼠皮下脂肪組織中adiponectin的mRNA表達及血清循環水平；然而，同時給予U0126和FGF21重組腺病毒FGF21處理后，小鼠脂肪組織中adiponectin的mRNA表達及血清循環水平均顯著上調，見圖8。這些結果表明FGF21引發的脂聯素表達與不受Erk1/2信號調控。

Figure 4. Inactivation of Erk1/2 did affect the effect of FGF21 on body parameters indb/dbmice. BAT: brown adipose tissue； WAT: white adipose tissue. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group;△P<0.05vsU0126 group.

圖4Ad-FGF21處理后小鼠各主要器官重量的變化狀況

Figure 5. Representative images and quantitative analysis of the morphology of adipose tissues, macrophage accumulation and adiponectin expression indb/dbmice treated with Ad-FGF21, U0126 or Ad-FGF21+U0126. A: HE staining, scale bar=100 μm; B: F4/80 macrophage accumulation, scale bar=50 μm; C: adiponectin expression, scale bar=50 μm.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group;△P<0.05vsU0126 group.

圖5Ad-FGF21及U0126處理后小鼠脂肪組織形態學、巨噬細胞浸潤及脂聯素表達狀況

3 Erk1/2 信號通路失活對 FGF21 抗糖尿病病變的影響

3.1小鼠原代脂肪細胞分離培養及油紅O染色鑒定 結果顯示，原代分離培養的脂肪細胞中有80%～90%左右是脂肪細胞，見圖9。

Figure 6. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect FGF21-induced subcutaneous adipose PPARγ expression indb/dbmice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group；△P<0.05vsU0126 group.

圖6Erk1/2對FGF21調節小鼠皮下脂肪組織PPARγ表達的影響

Figure 7. Inactivation of Erk1/2 did not affect FGF21-induced epididymal adipose PPARγ expression indb/dbmice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group；△P<0.05vsU0126 group.

圖7Erk1/2對FGF21調節小鼠附睪脂肪組織PPARγ表達的影響

3.2抑制Erk1/2信號通路對原代培養小鼠皮下脂肪細胞PPARγ表達的影響 前期研究發現，重組人FGF21蛋白處理后可上調Erk1/2活性和PPARγ的活性。我們的結果顯示，與對照組相比較，給予U0126處理后，Erk1/2磷酸化活性被顯著抑制，而PPARγ的活性保持不變；同時給予U0126和重組人FGF21蛋白處理后，PPARγ的活性則明顯上調，見圖10。與此同時，給予U0126抑制Erk1/2活性時，原代培養小鼠脂肪細胞中脂聯素的表達并沒有顯著的變化，而給予U0126和重組人FGF21蛋白處理后，原代培養的小鼠脂肪細胞中PPARγ及adiponectin的mRNA水平均顯著上調，與此同時，培養基中的adiponectin蛋白水平也顯著上調，見圖11。這些結果提示，脂肪細胞中PPARγ及adiponectin的表達不受Erk1/2信號通路的調控。

Figure 8. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect FGF21-induced adiponection expression indb/dbmice. A: the mRNA expression level of adiponectin in subcutaneous adipose tissue; B: circulating adiponectin level in the mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsAd-FGF21 group;△P<0.05vsU0216 group.

圖8Ad-FGF21處理后小鼠皮下脂肪組織脂聯素mRNA及循環水平變化狀況

Figure 9. Oil red O staining of primary adipocytes before and after differentiation. Scale bar=100 μm.

圖9原代培養脂肪細胞分化前后油紅O染色結果

Figure 10. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect FGF21-induced PPARγ expression in primary adipocytes of mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsFGF21 group；△P<0.05vsU0216 group.

圖10Erk1/2對原代培養小鼠皮下脂肪細胞PPARγ表達的影響

Figure 11. Inhibition of Erk1/2 signaling pathway did not affect FGF21-induced expression of PPARγ and adiponectin in primary cultured subcutaneous adipocytes of mice. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsFGF21 group;△P<0.05vsU0216 group.

圖11Erk1/2對原代培養小鼠皮下脂肪細胞PPARγ及adiponectin表達的影響

討 論

FGF21是一個約210個氨基酸序列組成的，主要由肝臟細胞表達的分泌蛋白[6-8]。不同于傳統的其它FGF家族成員，FGF21主要以內分泌因子的角色參與機體的物質代謝調控作用[6, 9]。最近大量動物實驗研究表明，FGF21是一個重要的調節糖脂代謝的激素，并在治療肥胖及糖尿病相關疾病中有著廣泛的潛力[9-11]。我們的早期研究發現[1]，FGF21在調控機體血糖代謝平穩、胰島素敏感性和脂質代謝與脂聯素的表達分泌存在密切的關系。在體外培養的脂肪細胞中，FGF21通過PPARγ信號通路，上調脂聯素的表達和分泌；在動物實驗方面，重組FGF21顯著提高小鼠的循環脂聯素水平；而在FGF21基因敲除小鼠中，血清脂聯素水平顯著降低。更重要的是，在脂聯素基因缺失的糖尿病小鼠中，重組FGF21的降血糖和降血脂效應均顯著低于對照組。此外，重組FGF21對脂聯素缺失的糖尿病小鼠的調節能量代謝的效應也顯著降低。這些結果表明，FGF21的抗糖尿病特性可能是通過某些信號分子調控PPARγ的活性，然后進一步刺激脂聯素的表達與分泌，最終達到發揮其降血糖、提高胰島素敏感性的目標。然而，FGF21是如何調控PPARγ，發揮其抗糖尿病的生物功能？這有待于深入探索。

MAPK家族是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括生長因子引發的Erk1/2以及壓力應激引發的p38 MAPK和JNK等家族成員[12-13]。在肥胖引發的相關疾病中，MAPK直接參與了機體內的肝脂代謝調控，并參與機體胰島素抵抗的調控。p38 MAPK 通過磷酸化核受體PPARα而促進脂肪酸的β氧化[14-16]。在肥胖及其引發的糖尿病大鼠模型中，JNK1 MAPK的活性伴隨著胰島素抵抗的增加而顯著上升；相反，抑制JNK1 MAPK的活性能顯著緩解胰島素抵抗、增加胰島素敏感性[17]。此外，JNK1 MAPK與肝臟脂肪代謝密切相關[18]。有意思的是，JNK1 MAPK活性與PPARγ活性及其表達狀況也存在密切的關系, 抑制JNK活性顯著上調PPARγ的表達[19]。在palmitate引發的胰島素抵抗條件下，FGF21能顯著抑制JNK1 MAPK的活性[20]。由此可見，在肥胖及糖尿病發病過程中，FGF21、JNK1、Erk1/2 MAPK與PPARγ均參與了疾病的病變過程，并且在相互之間還存在著相互調控的密切關系。然而，在FGF21調節PPARγ過程中，是否也通過調控或影響JNK1和Erk1/2 MAPK通路，進而激活下游相關靶基因的活性，最終發揮其抗糖尿病效應，這有待于深入探索。

本研究發現，無論是急性實驗還是慢性實驗，FGF21的降糖降脂作用并不隨著Erk1/2 MAPK通路關閉而喪失。葡萄糖耐受試驗和胰島素耐受試驗的結果表明，Erk1/2 MAPK通路的關閉并不會影響FGF21對db/db小鼠葡萄糖和胰島素耐受能力的改善。此外，比較U0126抑制Erk1/2 MAPK通路與否，FGF21對db/db小鼠血糖、胰島素水平和血清TG水平的下調作用，發現二者并沒有顯著的差異。同時，我們觀察了Erk1/2 MAPK通路對FGF21-PPARγ-adiponectin通路的影響。發現無論是血清脂聯素水平還是脂肪組織中的脂聯素水平都不受Erk1/2 MAPK通路的影響。體外實驗和體內實驗的結果表明脂肪細胞/脂肪組織中PPARγ的mRNA表達水平和蛋白水平亦不受Erk1/2 MAPK通路的影響。

綜上所述，我們的研究表明，Erk1/2失活對FGF21降血糖及降甘油三酯的功能與Erk1/2活性并無直接的明顯的作用。這些結果提示，Erk1/2可能不參與FGF21調節脂肪細胞下游信號分子PPARγ/adiponectin，進而發揮其降血糖及調節甘油三酯等脂質代謝的生物功能。

[1] Lin Z, Tian H, Lam KS, et al. Adiponectin mediates the metabolic effects of FGF21 on glucose homeostasis and insulin sensitivity in mice[J]. Cell Metab, 2013, 17(5): 779-789.

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Pharmaceutical inactivation of Erk1/2 does not affect function of FGF21 to regulate glucose and lipid metabolic hemostasis

WU Chao-ming1, ZHENG Ju-jia2, PAN Ying-ying2, YE Yan-na2, PAN Xue-bo2, LIN Zhuo-feng2, 3

(1TheSecondAffiliatedHospital,2SchoolofPharmaceuticalScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China;3TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:zflwf@126.com)

AIM: To investigate whether inactivation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (Erk1/2) will affect the function of fibroblast growth factor 21 (FGF21) to regulate glucose and lipid metabolism.METHODSMaledb/dbmice (8 weeks old) were treated with U0126 (an inhibitor of Erk1/2 kinase) for 1 week, and then treated with recombinant human FGF21 protein and adenovirus-mediated FGF21 (Ad-FGF21). The profile changes of blood glucose and blood lipid were evaluated at 120 min or 4 weeks after FGF21 administration. Meanwhile, the molecular mechanism was explored byinvitrostudy.RESULTSTreatment ofdb/dbmice with recombinant human FGF21 protein significantly reduced blood glucose and triglyceride levels at 120 min after FGF21 administration, but these changes were comparable in U0126-treated mice. Furthermore, abnormal glucose and triglyceride levels, and glucose and insulin tolerance were strongly improved indb/dbmice as accompanied with decreasing body fat content after 4 weeks of ad-FGF21 administration. Interestingly, treatment with or without U0126 did not influence these effects of FGF21. Mechanically, treatment with Ad-FGF21 significantly upregulated the protein levels of p-Erk1/2 and peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) as well as the expression of adiponectin at mRNA and protein levels in adipose tissues. However, treatment with or without U0126 did not change the profiles. On the other hand, invitroexperiments also indicated that treatment of adipocytes with recombinant human FGF21 protein significantly activated Erk1/2 phosphorylation, and upregulated the expression levels of PPARγ and adiponectin (P<0.05). However, pre-administration of U0126 did not affect the profiles.CONCLUSIONPharmaceutical inactivation of Erk1/2 by U0216 does not affect the biological function of FGF21 to regulate blood glucose balance and improve abnormal blood lipidsinvivo.

Fibroblast growth factor 21; Extracellular signal-regulated kinase 1/2; Insulin-sensitizing effect; Glucose and lipid metabolism disorder

1000- 4718(2017)12- 2212- 10

2017- 06- 30

2017- 11- 16

國家自然科學基金資助項目(No. 81471075)；浙江省自然科學基金資助項目(No. LY15H070003)

△通訊作者 Tel: 0577-86699350； E-mail: zflwf@126.com

R329.21； R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.016

(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)