p300介導組蛋白乙酰化修飾下調PPAR-γ致妊娠期糖尿病小鼠子代心肌細胞糖脂代謝紊亂

張 薇， 陳 聰

(成都市第一人民醫院兒科， 四川 成都 610016)

p300介導組蛋白乙酰化修飾下調PPAR-γ致妊娠期糖尿病小鼠子代心肌細胞糖脂代謝紊亂

張 薇△， 陳 聰

(成都市第一人民醫院兒科， 四川 成都 610016)

目的闡明妊娠期糖尿病(GDM)對子代心肌細胞糖脂代謝的影響，并探討其可能的調控機制。方法雌性昆明小鼠于妊娠中期給予腹腔注射鏈脲佐菌素(30 mg/kg)建立GDM模型，另設對照(control)組。分娩后F1代飼養至8周，測定隨機血糖和空腹血脂等相關指標。利用CO2窒息處死F1代實驗小鼠，剖開胸腔后分離心臟組織，用于后續實驗。qPCR檢測p300及p300/CBP相關因子(PCAF)的mRNA表達水平，qPCR及Western blot檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)、葡萄糖轉運蛋白4(GLUT-4)及中鏈酰基輔酶A脫氧酶(MCAD)的mRNA和蛋白表達水平，染色質免疫共沉淀(ChIP)結合qPCR檢測p300與PPAR-γ啟動子結合水平及PPAR-γ啟動子區域組蛋白H3的乙酰化水平。結果F1代小鼠血糖和總膽固醇輕度升高(P<0.05)，甘油三酯、高密度及低密度脂蛋白無明顯改變；心肌組織中p300、PPAR-γ、GLUT-4及MCAD表達明顯降低(P<0.05)，PCAF的表達兩組間差異無統計學顯著性；p300與PPAR-γ啟動子結合水平和PPAR-γ啟動子區域組蛋白H3的乙酰化水平均明顯下降(P<0.05)。結論GDM子代小鼠中p300通過介導組蛋白乙酰化修飾而下調PPAR-γ表達，可能引起心肌細胞糖脂代謝紊亂。

妊娠期糖尿病； p300； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ； 心肌細胞； 糖脂代謝紊亂

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)系指妊娠期首次發生或診斷的任何水平的糖耐量異常，母體內的高血糖通過胎盤進入胎兒體內，造成胎兒糖代謝紊亂，導致宮內窘迫、胎死宮內、羊水過多、早產和難產等不良妊娠結局。流行病學研究顯示GDM子代在兒童期、成年期及老年期患肥胖、糖尿病和心血管疾病等代謝性疾病風險顯著升高[1]，對GDM子代心臟的影響也多為結構、形態及舒縮功能的研究，然而GDM子代心肌細胞本身糖脂代謝的研究較少，同時也缺乏對該方面機制的認識。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)與糖脂代謝和心血管疾病關系密切[2]，可通過對下游基因——葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter type 4，GLUT-4)和中鏈酰基輔酶A脫氫酶(medium-chain acyl-CoA dehydrogenase，MCAD)調控直接影響心肌細胞能量代謝[3-4]。然而目前對PPAR-γ在GDM子代糖脂代謝中的作用無明確報道。本研究通過構建GDM動物模型，檢測模型小鼠子代糖脂代謝水平及PPAR-γ、GLUT-4及MCAD的表達水平。組蛋白乙酰化是一個高度動態且可逆的過程，對基因轉錄發揮重要調控作用[5]，本研究通過觀察組蛋白乙酰化修飾酶p300和p300/CBP相關因子(p300/CBP-associated factor， PCAF)表達水平及p300對PPAR-γ啟動子區域組蛋白乙酰化水平的影響，分析組蛋白乙酰化修飾在GDM模型小鼠子代糖脂代謝紊亂中的可能機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、造模和分組

選擇清潔級健康成年昆明小鼠60只(購于四川大學華西基礎醫學院動物中心)，按雄雌比1∶2合籠，次日觀察陰栓，觀察到陰栓最早之日計為孕期0.5 d(E0.5)。對孕鼠分籠飼養。妊娠至8.5 d時將孕鼠隨機分為GDM組及對照(control)組：GDM組給予鏈脲佐菌素(30 mg/kg)腹腔注射；對照組給予枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射。隨后每72 h采尾靜脈血測血糖值，3次血糖高于11.1 mmol/L者即為造模成功。本實驗中GDM造模成功率為35%(14/40)。

2 主要試劑和儀器

鏈脲佐菌素(上海萌睿生物科技有限公司)；抗PPAR-γ抗體(工作濃度1∶500)、抗GLUT-4抗體(工作濃度1∶2 000)、抗MCAD抗體(工作濃度1∶1 000)、抗β-actin鼠單克隆抗體(工作濃度1∶1 000)、抗p300 ChIP級抗體和ChIP試劑盒(Abcam)；山羊抗兔及山羊抗小鼠帶HRP標記的IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)；BCA蛋白測定試劑盒(Pierce)；總RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa)；實時定量PCR試劑盒(天根生化技術有限公司)；抗乙酰化H3 ChIP級抗體(Merck Millipore)。凝膠圖像分析儀(Gene)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

3 實驗方法

3.1血脂水平檢測 F1代小鼠禁食12 h后采用摘眼球取血法獲得血液組織，離心，分離血清備用。應用日立7170A全自動生化儀，采用總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)及低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)試劑盒進行檢測。

3.2Western blot實驗 F1代小鼠予以CO2窒息法處死，剖開胸腔，分離整個心臟放入PBS中清洗，盡量除去殘留血液，心臟凍存于液氮中備用。收集F1代心臟標本后，24 h內提取全蛋白，BCA蛋白濃度測定后調整上樣量為50 μg, 行12% SDS-PAGE后電轉至0.22 μm的PVDF膜上，用封閉液稀釋 I 抗后4 ℃過夜，洗膜后再孵育 II 抗(1∶2 000稀釋)，室溫下孵育2 h后再洗膜后用化學發光成像，將條帶輸入Quantity One軟件獲得其灰度值，以目的蛋白/β-actin(灰度值)來反映蛋白的相對表達量。

3.3qPCR實驗 收集F1代心臟標本后提取組織RNA，逆轉錄得到cDNA進而以之為模版進行實時定量PCR檢測。p300的上游引物序列為5’-GACGAGCTAATGGATTAGC-3’， 下游引物序列為5’-AGGCAGCTGGGTTACGACT-3’，產物長度為156 bp；PCAF的上游引物序列為5’-CATGGACTTAGGCATTCGC-3’，下游引物序列為5’-TGCCTGCTAGGATACGACG-3’，產物長度為164 bp；PPAR-γ的上游引物序列為5’-ACCTCGTGCACGATACCT-3’，下游引物序列為5’-TGCGGCCCAATTCGCTCAG-3’，產物長度為133 bp；GLUT-4的上游引物序列為5’-GACCTGCTGAACGATAACG-3’, 下游引物序列為5’-ATCCTGCGCATTCCTCTAAT-3’，產物長度154 bp；MCAD的上游引物序列為5’-TACTGCGCAGCTCGATAACG-3’，下游引物序列為5’-ACTGGTGACCGATCCGTTCGA-3’，產物長度178 bp。選取β-actin作為內參照。所得數據用Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 儀自帶基于Pfaffl原理的相對定量數據分析軟件分析。

3.4染色質免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)-qPCR實驗 取F1代小鼠心肌組織50 mg，將其剪碎，預冷PBS 清洗后加入終濃度為1%的甲醛交聯15 min后勻漿。超聲破碎儀將DNA 切割至200～1 000 bp之間。加入ChIP級抗p300及抗乙酰化H3抗體4 ℃搖床過夜沉淀DNA，65 ℃逆轉交聯8～10 h，純化并回收DNA。用核酸蛋白測定儀測定A260/A280比值，以確定ChIP后DNA 的純度和濃度，于-20 ℃保存。

選取PPAR-γ基因外顯子5’端前1 000 bp序列，針對該序列設計特異性引物。引物用Primer Premier 5.0軟件設計，由寶生物公司合成。PPAR-γ的上游引物序列為5’-TCTTCCACTTCCACACGTACCAA-3’，下游引物序列為5’-CAGAGGGAGTTGGGAGACGTAG-3’，產物大小為158 bp。所得數據用Bio-Rad CFX96 熒光定量PCR 儀自帶基于Pfaffl原理的相對定量數據分析軟件分析。

4 統計學處理

采用SPSS 23.0進行統計學分析。所有數據用均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較應用獨立樣品t檢驗。以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 子代小鼠隨機血糖及空腹血脂水平

GDM組子代小鼠生后8周隨機血糖及空腹總膽固醇均較對照組有升高(P<0.05)，而甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白在2組間的差異無統計學顯著性，見圖1。

2 心肌組織p300、PCAF、PPAR-γ、GLUT-4及MCAD mRNA表達水平的檢測

Figure 1. Blood glucose (A) and blood lipid (B) levels in GDM group and control group. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖1對照組與GDM組血糖及血脂水平的比較

GDM組F1代小鼠心肌組織中p300、PPAR-γ、GLUT-4及MCAD的mRNA均較正常組降低(P<0.05)，而PCAF的mRNA表達在2組中的差異無統計學顯著性，見圖2。

Figure 2. The mRNA levels of p300 (A)， PCAF (B)， PPAR-γ (C)， GLUT-4 (D) and MCAD (E) in control group and GDM group. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖2GDM組與對照組各基因mRNA相對表達量的比較

3 PPAR-γ、GLUT-4、MCAD及p300蛋白水平的檢測

GDM組子代小鼠心臟中PPAR-γ、GLUT-4、MCAD及p300的蛋白表達水平均較對照組明顯降低(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. The protein expression levels of PPAR-γ， MCAD， p300 and GLUT-4 in control group and GDM group. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖3對照組與GDM組PPAR-γ、GLUT-4、p300和MCAD蛋白相對表達量的比較

4 p300與PPAR-γ啟動子結合水平及PPAR-γ啟動子區域組蛋白H3乙酰化水平的檢測

p300與PPAR-γ啟動子結合水平在GDM組較正常對照組明顯降低(P<0.05)，見圖4A；PPAR-γ啟動子區域組蛋白H3乙酰化水平在GDM組較對照組顯著降低(P<0.05)，見圖4B。

Figure 4. The binding level of p300 with PPAR-γ promoter (A) and the acetylation level of histone H3 in PPAR-γ promoter region (B). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖4p300與PPAR-γ啟動子結合水平及PPAR-γ啟動子區域組蛋白H3乙酰化水平的比較

討 論

流行病學研究顯示GDM子代患糖尿病、肥胖、高血壓等代謝性疾病的風險明顯升高[6]，我們發現GDM子代小鼠成年后其血糖仍高于正常對照組，然而升高幅度并不明顯，更沒達到糖尿病診斷標準。研究發現，GDM子代糖耐量可能出現異常[7]，因此我們推測實驗小鼠血糖輕度升高亦可能與其糖耐量受損相關。關于GDM后代血脂代謝的研究多集中于新生兒時期，而且新生兒期血脂代謝與孕母孕晚期血脂水平密切相關[8]，盡管有研究提示GDM子代新生兒期TC并無明顯改變[9]，但我們研究發現GDM子代小鼠成年期TC水平輕度升高，而其對子代血清甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白無明顯影響，考慮不同年齡階段代謝差異可能，需要更加深入研究以明確。

通過查閱文獻發現，PPAR-γ與糖脂代謝關系密切[2]。PPAR-γ調控糖脂代謝的2個重要靶基因分別是GLUT-4和MCAD[10]。GLUT-4是主要的葡萄糖轉運體之一，在心肌和骨骼肌中表達，其作用是將血清葡萄糖轉運至細胞內以供利用，它的表達程度可以反映葡萄糖的利用水平[3]。MCAD是中鏈脂肪酸β氧化第一步的關鍵酶，其表達水平可以反映脂肪酸的利用水平[4]。PPAR-γ可以調節GLUT-4的表達從而調控糖代謝；調節MCAD的表達從而調控脂代謝。我們發現GDM子代小鼠糖脂代謝紊亂的模型中，PPAR-γ在轉錄及翻譯水平均顯著降低，而其下游2個重要糖脂代謝基因也出現下調，提示GDM子代糖脂代謝紊亂與PPAR-γ關系密切。然而PPAR-γ低表達的機制仍不明確。

組蛋白乙酰化是表觀遺傳修飾的重要方式之一，組蛋白乙酰化通過動態調控染色質的結構，影響基因轉錄的活化及沉默[11]。組蛋白乙酰化修飾通過對組蛋白賴氨酸位點進行修飾，使得基因染色質結構發生疏松，有利于轉錄因子與基因啟動子的結合，進而促進基因轉錄[12]。因此我們對PPAR-γ基因啟動子的乙酰化水平進行了檢測，我們發現GDM子代小鼠心肌中PPAR-γ啟動子區域組蛋白H3乙酰化水平明顯低于對照組，提示組蛋白乙酰化在GDM子代小鼠PPAR-γ低表達中可能發揮重要作用。組蛋白乙酰化由組蛋白乙酰化酶及去乙酰化酶共同介導，p300和PCAF均為乙酰化酶的重要亞型，我們發現GDM子代小鼠中p300表達顯著降低，而PCAF表達較對照組則無明顯差異。這提示我們p300可能在模型糖脂代謝紊亂中發揮重要作用。其它研究也發現p300作為重要的乙酰化修飾酶，參與糖脂代謝紊亂中多種基因、蛋白的表達調控[13-14]。然而其對GDM子代糖脂代謝的影響尚無報道。有研究顯示PPAR-γ啟動子區域存在p300結合位點[15]，我們檢測了模型小鼠心肌組織PPAR-γ基因啟動子上p300的結合水平，結果提示p300與PPAR-γ啟動子結合水平在GDM子代小鼠心肌組織中顯著低于對照組。

我們研究發現GDM子代小鼠存在糖脂代謝紊亂，首次證實p300介導的組蛋白乙酰化修飾可能下調PPAR-γ表達，進而影響心肌細胞糖脂代謝相關基因表達，揭示了GDM子代成年發生糖脂代謝紊亂的可能新機制，同時組蛋白乙酰化具有動態可逆性[5, 16]，因此也為疾病干預靶點的研究提供理論支持。然而除了PPAR-γ外其它如MAPK信號通路、AKT信號通路等是否也在其中發揮作用，同時組蛋白去乙酰化酶在其中作用如何？這些問題仍需要更加深入的研究。

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Down-regulation of PPAR-γ expression by p300-mediated histone acetylation induces glucose-lipid metabolism disorder in cardiomyocytes of GDM offspring mice

ZHANG Wei, CHEN Cong

(DepartmentofPediatrics,TheFirstHospitalofChengdu,Chengdu610016,China.E-mail: 1154981745@qq.com)

AIM: To investigate the effect of gestational diabetes mellitus (GDM) on glucose-lipid metabolism in the offspring mice and the underlying mechanisms.METHODSWild-type female mice were intraperitoneally injected with streptozotocin at 30 mg/kg in the second trimester of pregnancy to establish GDM model. Normal saline was used as control. F1 offspring mice were fed for 8 weeks after birth. The blood glucose and lipid levels were detected randomly. The mRNA levels of p300 and p300/CBP-associated factor (PCAF) were detected by qPCR. The expression of peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPAR-γ), glucose transporter typer 4 (GLUT-4) and medium-chain acyl-CoA dehydroge-nase (MCAD) at mRNA and protein levels was determined by qPCR and Western blot. ChIP-qPCR was employed to analyze the binding status of p300 with the promoter ofPPAR-γand the acetylation level of histone H3 in the promoter region ofPPAR-γ.RESULTSBlood glucose and total cholesterol levels were significant increased in the offspring mice (P<0.05). The expression levels of p300, PPAR-γ, GLUT-4 and MCAD were decreased compared with the control group (P<0.05). Binding affinity of p300 with the promoter ofPPAR-γwas reduced (P<0.05). The level of acetylated histone H3 in the promoter region ofPPAR-γwas decreased significantly (P<0.05).CONCLUSIONRegulation of PPAR-γ expression by p300 may induce glucose-lipid metabolism disorder in the cardiomyocytes of GDM offspring mice.

Gestational diabetes mellitus; p300; Peroxisome proliferator-activated receptor-γ; Cardiomyocytes; Glucose-lipid metabolism disorder

1000- 4718(2017)12- 2222- 05

2017- 04- 27

2017- 06- 07

△通訊作者 Tel: 028-85311856； E-mail: 1154981745@qq.com

R363.2； R714.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.017

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)