TLR4/NLRP3炎癥復合體介導對比劑誘導的腎小管上皮細胞炎癥和損傷

林 燕， 林佳瓊， 謝楚莉， 管小鳳， 譚學賢， 黃澤娜

(廣州醫科大學附屬第三醫院 1腎內科， 2病理科， 廣東 廣州 510150； 3南方醫科大學基礎醫學院醫學遺傳學教研室， 廣東 廣州 510515； 4中山大學中山醫學院生理學教研室， 廣東 廣州 510080； 5中山大學孫逸仙紀念醫院超聲科， 廣東 廣州 510120； 6廣東省人民醫院急危重癥醫學部， 廣東省醫學科學院， 廣東 廣州 510080)

TLR4/NLRP3炎癥復合體介導對比劑誘導的腎小管上皮細胞炎癥和損傷

林 燕1， 林佳瓊3， 謝楚莉4， 管小鳳5， 譚學賢2， 黃澤娜6△

(廣州醫科大學附屬第三醫院1腎內科，2病理科， 廣東 廣州 510150；3南方醫科大學基礎醫學院醫學遺傳學教研室， 廣東 廣州 510515；4中山大學中山醫學院生理學教研室， 廣東 廣州 510080；5中山大學孫逸仙紀念醫院超聲科， 廣東 廣州 510120；6廣東省人民醫院急危重癥醫學部， 廣東省醫學科學院， 廣東 廣州 510080)

目的探討Toll樣受體4(TLR4)/Nod樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥復合體是否介導了對比劑(CM)引起的腎小管上皮細胞炎癥和損傷。方法本研究運用碘普羅胺作用于大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E建立損傷模型。應用CCK-8法測定細胞存活率；Western blot測定TLR4、NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)、caspase-1和cleaved caspase-3的蛋白水平；ELISA法檢測炎癥因子白細胞介素1β(IL-1β)和IL-18的水平；Hoechst 33258核染色法檢測凋亡率；JC-1染色法測定線粒體膜電位。用小干擾RNA沉默NLRP3表達。結果CM可降低NRK-52E細胞的存活率并上調cleaved caspase-3的蛋白水平(P<0.05)；此外，CM可上調細胞TLR4/NLRP3炎癥復合體的表達并促進炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌(P<0.05)。沉默NLRP3可以對抗CM誘導的炎癥因子分泌；TLR4抑制劑TAK-242及沉默NLRP3能減輕CM引起的細胞凋亡和線粒體功能損傷。結論TLR4/NLRP3炎癥復合體參與了CM致急性腎損傷的發病機制，并介導了CM誘導的腎小管上皮細胞損傷和炎癥。

對比劑； 腎損傷； 炎癥； Toll樣受體4； Nod樣受體蛋白3炎癥復合體

隨著介入、多層螺旋CT和三維重建技術的發展，對比劑(contrast media，CM)在診斷治療中得到廣泛應用，而對比劑致急性腎損傷(contrast-induced acute kidney injury，CIAKI)也日漸突出。CIAKI是引起院內腎功能衰竭的第三大原因，僅次于腎臟灌注不足和腎毒性藥物，占全部醫院獲得性腎功能衰竭的11%[1-2]。CIAKI的發生是多因素共同參與的結果。現有的研究表明，CIAKI的發病主要與CM導致腎臟微血管血流動力學改變、CM對腎小管細胞的直接毒性、氧化應激和炎癥損傷及腎小管梗阻等有關[3]。其中，炎癥損傷可能是CIAKI發生發展的一個重要因素。

Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為模式識別受體中的信號轉導受體，可介導天然免疫和獲得性免疫。TLR4是TLRs家族中極為重要的成員，在非感染性炎癥反應中發揮重要的作用[4]。TLR4識別配體后，可以激活下游一系列的信號轉導通路，其中包括NF-κB通路[5]，激活炎癥反應。Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥復合體(inflammasome)由調節亞單位NLRP3、接頭蛋白凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speckle-like protein，ASC)及效應器caspase-1組成。NLRP3炎癥復合體目前被視為一種重要的炎癥調節因子，NLRP3一旦激活，可使白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)和IL-18等炎癥因子的前體轉化為成熟的IL-1β和IL-18，并釋放到胞外，從而引起炎癥反應[6]。而在CIAKI中，TLR4/NLRP3炎癥復合體是否參與了炎癥的激活并進一步導致了細胞的凋亡，目前仍無相關研究。

因此，本研究應用臨床上運用最為廣泛的含碘對比劑碘普羅胺(iopromide)損傷大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E，建立CIAKI模型，并探討TLR4/NLRP3炎癥復合體在CM誘導的腎小管上皮細胞損傷和炎癥中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料

碘普羅胺注射液370(碘濃度為370 g/L，表示為370 g I/L)由Bayer提供；抗TLR4、NLRP3和ASC 抗體購自Abcam；抗caspase-1及cleaved caspase-3 抗體購自CST；抗GAPDH抗體、多克隆羊抗兔 II抗、多克隆羊抗小鼠 II 抗及多克隆驢抗羊 II 抗購自Proteintech；TLR4抑制劑TAK-242及脂質體轉染試劑(Lipofectamine transfection reagent)購自Life Technologies；NLRP3-小干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)由廣州銳博公司供應；特級胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)及RPMI-1640培養基購自Gibco；JC-1染液和Hoechst 33258染液由Sigma-Aldrin供應；細胞計數試劑盒8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自日本同仁公司；檢測IL-1β 和IL-18的酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供。腎小管上皮細胞NRK-52E購自廣州吉尼歐公司。

2 方法

2.1細胞培養 將NRK-52E細胞置于含10% FBS的RPMI-1640培養基中，于5% CO2、37 ℃的條件下傳代培養，待細胞生長至約80%的融合狀態時可用于實驗。

2.2損傷模型的建立及實驗分組 應用不同濃度(50、100、150和200 g I/L)碘普羅胺以及不同處理時間(1、2和3 h)作用于NRK-52E細胞建立損傷模型。選取最佳損傷濃度及最佳損傷時間后將實驗分為6組：(1)正常對照(control)組：單純采用RPMI-1640培養基作用于NRK-52E細胞；(2)CM損傷(CM)組：用不同濃度CM處理NRK-52E細胞；(3)CM+TAK-242組：在CM處理前，予以5 μmol/L TAK-242預處理細胞1 h；(4)CM+NLRP3-siRNA組：在CM處理前，予以NLRP3-siRNA轉染NRK-52E細胞24 h；(5)TAK-242組：5 μmol/L TAK-242預處理細胞1 h后，繼續予以RPMI-1640培養基培養；(6)NLRP3-siRNA組：NLRP3-siRNA轉染NRK-52E細胞24 h后，繼續予以RPMI-1640培養基培養。

2.3CCK-8法測定細胞存活率 常規消化對數生長期的NRK-52E細胞，配成1×108/L的細胞懸液，96孔板內每孔加入細胞懸液100 μL，待細胞密度增長至80%時，按照實驗分組予以細胞不同處理后，采用CCK-8試劑盒檢測細胞的存活率，酶聯免疫檢測儀于450 nm波長測定各孔吸光度(A)值，計算每組5個復孔A值的均數。按照以下公式計算：細胞存活率(%)=處理組A值/對照組A值×100%。實驗重復3次。

2.4Western blot檢測TLR4、NLRP3、ASC、caspase-1和cleaved caspase-3的蛋白水平 細胞根據分組給予相應處理后，提取蛋白，BCA法測定蛋白含量。等量的蛋白經10% SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入 I 抗(濃度均為1∶1 000)，4 ℃過夜后，加入濃度為1∶5 000的 II 抗稀釋液，室溫下孵育1 h。使用超敏 ECL顯色液，雙色紅外熒光成像系統曝光。ImageJ 1.41軟件分析灰度值。實驗重復3次。

2.5ELISA法檢測炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌水平 細胞按照分組給予不同的處理后，收集培養基作待測標本。ELISA操作流程根據試劑盒說明書進行，在終止顯色反應后，使用酶標儀檢測波長450 nm處A值。以標準品的A值作為橫坐標，標準品所對應的濃度值作為縱坐標，用計算機軟件進行回歸擬合生成標準曲線。根據標準曲線換算得到待測樣本的濃度，最后將所得的樣本濃度進行統計分析。

2.6siRNA沉默NLRP3的表達 將NRK-52E細胞種植于6孔板中，待細胞密度達到80%時，按照轉染使用說明書將NLRP3-siRNA(GCUUCAGCCACAUGACUUUTT)和隨機非編碼RNA(random non-coding RNA；作為陰性對照，negative control，NC)轉染到細胞中，37 ℃敷箱培養24 h后提取細胞蛋白，采用Western blot技術檢測沉默效率。

2.7Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相法測定凋亡細胞的數量 細胞按照分組給予相應的處理后，4%多聚甲醛處理10 min，然后加入Hoechst 33258染料緩沖液，細胞培養箱中孵育30 min。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不同的視野進行熒光拍攝，ImageJ 1.41軟件分析各視野平均熒光強度。

2.8JC-1染色熒光顯微鏡照相法檢測線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP) 細胞按照分組給予相應的處理后，加入稀釋的JC-1染液，培養箱中孵育45 min，在熒光顯微鏡下隨機選取5個不同的視野進行熒光拍攝，ImageJ 1.41軟件分析各視野紅色熒光強度及綠色熒光強度，并計算各視野紅/綠熒光強度比值，最后對各個實驗組平均紅/綠熒光強度比值進行統計分析。

3 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。實驗數據以均數±標準誤(mean±SEM)表示，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩組間比較用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CM降低NRK-52E細胞的存活率并上調cleaved caspase-3的蛋白水平

不同濃度的CM處理NRK-52E細胞3 h后降低細胞的存活率，其中，150及200 g I/L的碘普羅胺處理細胞3 h可明顯降低細胞存活率，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖1A；選取150 g I/L(圖1B)及200 g I/L(圖1C)的碘普羅胺分別處理細胞1 h、2 h和3 h，可降低細胞的存活率(P<0.05，P<0.01)；此外，150 g I/L及200 g I/L的碘普羅胺處理細胞3 h還可以上調cleaved caspase-3的表達，見圖1D。

2 CM上調NRK-52E細胞TLR4及NLRP3炎癥復合體的表達

150 g I/L及200 g I/L的碘普羅胺處理細胞3 h可上調TLR4的表達(P<0.05，P<0.01)；NLRP3炎癥復合體由NLRP3、ASC及caspase-1三部分組成， 150及200 g I/L的碘普羅胺處理細胞3 h可上調NLRP3、ASC和caspase-1的表達(P<0.05或P<0.01)，見圖2。

3 CM促進NRK-52E細胞炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌

150及200 g I/L的碘普羅胺處理細胞3 h，可促進NRK-52E細胞炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌(P<0.05或P<0.01)，見圖3。

4 siRNA下調NRK-52E細胞內NLRP3的表達

siRNA作用于NRK-52E細胞24 h可明顯下調NLRP3的表達，較正常對照組及NC組表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；而轉染隨機非編碼RNA對NLRP3表達無影響，見圖4。

5 沉默NLRP3對抗CM誘導的炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌

在200 g I/L碘普羅胺處理NRK-52E細胞前，NLRP3-siRNA轉染細胞24 h能明顯減弱CM誘導的IL-1β和IL-18的分泌，與CM組比較差異有統計學意義(P<0.05)；NLRP3-siRNA預處理對IL-1β和IL-18的基礎分泌無明顯影響，見圖5。

6 TAK-242及沉默NLRP3能減輕CM引起的NRK-52E細胞凋亡

200 g I/L的碘普羅胺處理NRK-52E細胞3 h后，細胞出現了核固縮和熒光增強等凋亡表現，細胞凋亡率增加，與正常對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)；在CM處理NRK-52E細胞之前，予以5 μmol/L TAK-242預處理細胞1 h，能明顯阻斷CM的致細胞凋亡作用，與CM組比較，差異具有統計學意義(P<0.01)；NLRP3-siRNA預處理細胞24 h亦可明顯阻斷CM的致細胞凋亡作用(P<0.01)；而TAK-242及NLRP3-siRNA預處理本身不引起細胞凋亡，見圖6。

Figure 1. CM decreased the cell viability and increased the protein level of cleaved caspase-3 in the NRK-52E cells. A: the cells were treated with indicated concentrations of CM for 3 h; B and C: the cells were treated with 150 g I/L or 200 g I/L CM for indicated time; D: the protein level of cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1CM降低NRK-52E細胞存活率并上調cleavedcaspase-3的蛋白水平

Figure 2. CM upregulated the expression of TLR4 and NLRP3 inflammasome in the NRK-52E cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2CM上調NRK-52E細胞TLR4及NLRP3炎癥復合體的表達

Figure 3. CM induced the releases of IL-1β and IL-18 from the NRK-52E cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3CM促進NRK-52E細胞分泌炎癥因子IL-1β和IL-18

Figure 4. siRNA significantly downregulated NLRP3 expression in the NRK-52E cells determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4siRNA下調NRK-52E細胞NLRP3的表達

7 TAK-242及沉默NLRP3能減輕CM誘導的NRK-52E細胞線粒體功能損傷

MMP是檢測線粒體功能損傷的一項指標，MMP降低提示線粒體膜受損。200 g I/L的碘普羅胺處理NRK-52E細胞3 h后，CM組的紅/綠色熒光強度比值與正常對照組相比明顯下降(P<0.01)，提示MMP的丟失；在CM處理NRK-52E細胞之前，予以5 μmol/L TAK-242預處理細胞1 h，可使細胞內MMP丟失減少，與CM組比較差異有統計學意義(P<0.01)；NLRP3-siRNA預處理細胞24 h亦可對抗CM從而穩定細胞內MMP(P<0.01)；而TAK-242和NLRP3-siRNA預處理本身不引起細胞內MMP的變化，見圖7。

討 論

本研究應用CM損傷腎小管上皮細胞NRK-52E建立CIAKI模型，證實了CM對腎小管細胞的損傷作用，表現為細胞存活率降低、凋亡率增加、線粒體功能損傷、凋亡蛋白cleaved caspase-3表達上調及炎癥因子IL-1β和IL-18分泌增多。

在各種急慢性腎臟疾病中，TLR4均起著至關重要的作用。在一項對慢性腎臟病的研究中[7]發現，TLR4表達缺失可使慢性腎臟病大鼠的腎小球硬化、腎間質纖維化及血肌酐水平減輕。在缺血再灌注損傷的AKI模型中[8]，腎小管損傷將導致免疫系統的二次激活，近端及遠端小管以及集合管中TLR4的表達均明顯上調。Nair等[9]應用LPS誘導的急性腎損傷模型亦證實，抑制大鼠TLR4的表達可以明顯減少炎癥因子的表達和氧化應激的產生。與以上研究結果相類似，我們的研究結果也證實了CM可顯著上調腎小管上皮細胞TLR4的表達。此外，我們進一步探討了TLR4與CM所致腎小管上皮細胞損傷的關系。經CM處理的NRK-52E細胞中可見細胞凋亡增加及線粒體膜電位丟失，而運用TAK-242可以大大減少這些損傷，表明TLR4的確參與了CM所致的腎小管損傷。

Figure 5. Silencing ofNLRP3 reduced CM-induced releases of IL-1β and IL-18 measured by ELISA. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsCM group.

圖5沉默NLRP3對抗CM誘導的炎癥因子IL-1β和IL-18分泌

Figure 6. TAK-242 and silencing ofNLRP3 alleviated CM-induced apoptosis of the NRK-52E cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCM group.

圖6TAK-242及沉默NLRP3抑制CM引起的NRK-52E細胞凋亡

研究顯示[10-11]，NLRP3炎癥復合體參與了多種AKI疾病的發生發展。在敗血癥誘導的AKI模型中[10]，NLRP3敲除可逆轉敗血癥導致的低血壓和血清肌酐水平的升高，并減少中性粒細胞浸潤以及炎癥因子的分泌。在橫紋肌溶解的AKI模型中[11]，敲除NLRP3的小鼠炎癥因子表達水平明顯下降。而在白蛋白刺激腎小管細胞模型及不同蛋白尿水平的系膜增生性腎小球腎炎患者中均證實，NLRP3炎癥復合體參與調控了白蛋白引起的腎小管損傷[12]。在本研究中，CM誘導了NRK-52E細胞NLRP3、ASC及效應器caspase-1的表達，并進一步促進炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌。研究顯示[13]，NLRP3蛋白的表達水平是炎癥復合體激活的限速步驟。而在我們的實驗結果中同樣驗證，沉默NLRP3后可以明顯減弱CM誘導的IL-1β和IL-18的分泌。Komada等[11]的研究表明，在橫紋肌溶解致急性腎損傷模型中，敲除NLRP3可使凋亡細胞減少，證實NLRP3炎癥復合體與凋亡相關。與此研究結果相一致，我們的研究結果也顯示沉默NLRP3后，CM誘導的損傷，包括細胞凋亡以及線粒體電位丟失均得到明顯改善。

綜上所述，我們的研究結果證實了TLR4/NLRP3炎癥復合體在CM所致的腎小管上皮細胞損傷及炎癥中發揮了非常重要的作用，提示TLR4/NLRP3炎癥復合體可能成為一個新的治療靶點，為我們將來防治CIAKI提供新的治療思路。

Figure 7. TAK-242 and silencing ofNLRP3 attenuated CM-induced MMP loss in the NRK-52E cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCM group.

圖7TAK-242及沉默NLRP3減輕CM誘導的NRK-52E細胞線粒體膜電位丟失

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Involvement of TLR4/NLRP3 inflammasome in contrast medium-induced inflammation and injury in renal tubular epithelial cells

LIN Yan1, LIN Jia-qiong3, XIE Chu-li4, GUAN Xiao-feng5, TAN Xue-xian2, HUANG Ze-na6

(1DepartmentofNephrology,2DepartmentofPathology，ThirdAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510150,China;3DepartmentofMedicalGenetics,SchoolofBasicMedicalSciences,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China;4DepartmentofPhysiology,ZhongshanSchoolofMedicine,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;5DepartmentofUltrasonography,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;6DivisionofCriticalCareMedicineandEmergency,GuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China.E-mail: 506647168@qq.com)

AIM: To investigate whether Toll-like receptor 4 (TLR4) and Nod-like receptor protein 3 (NLRP3) inflammasome were involved in contrast medium (CM)-induced inflammation and injury in renal tubular epithelial cells.METHODSIopromide was used to injure NRK-52E cells in the study. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The protein levels of TLR4, NLRP3, apoptosis-associated speckle-like protein (ASC), caspase-1 and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. The releases of interleukin (IL)-1β and IL-18 were detected by ELISA. The apoptotic rate was evaluated by Hoechst staining, and mitochondrial membrane potential (MMP) was analyzed by JC-1 staining. siRNA was transfected into the NRK-52E cells to silenceNLRP3 expression.RESULTSCM decreased the viability of NRK-52E cells (P<0.05). CM also elevated the protein levels of cleaved caspase-3, TLR4, NLRP3, IL-1β and IL-18 (P<0.05). SilencingNLRP3 attenuated CM-induced releases of inflammatory cytokines. Moreover, treatment with TLR4 inhibitor TAK-242 or knockdown ofNLRP3 by siRNA transfection both attenuated cell apoptosis and loss of MMP caused by CM.CONCLUSIONTLR4/NLRP3 inflammasome takes part in the pathogenesis of CM-induced acute kidney injury, and mediates CM-induced injury and inflammation in renal tubular epithelial cells.

Contrast media; Kidney injury; Inflammation; Toll-like receptor 4; Nod-like receptor protein 3 inflammasome

1000- 4718(2017)12- 2252- 07

2017- 06- 26

2017- 08- 02

△通訊作者 Tel: 13570466614； E-mail: 506647168@qq.com

R329.21； R692.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.022

(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)