石斛合劑對老年糖尿病大鼠神經系統的保護作用

許 茜 叢一博 蔡 晶 林心君 崔 乙 劉 赟 施 紅

(福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122)

石斛合劑對老年糖尿病大鼠神經系統的保護作用

許 茜 叢一博 蔡 晶 林心君 崔 乙1劉 赟 施 紅

(福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122)

目的探討石斛合劑對老年糖尿病大鼠神經系統的保護作用。方法對Wistar大鼠進行高糖高脂喂養16個月，建立老年糖尿病模型，進行石斛合劑序貫方臨床等效藥量灌胃治療。取大鼠肝臟組織進行全基因組表達譜芯片及探索者蛋白芯片測試并進行數據分析。結果模型組大鼠與正常組存在差異的神經系統相關功能基因63個，分布于14個通路，其中經藥物治療“糾偏”基因49個。13種蛋白表達在治療后有所改善，分別屬于細胞因子、神經疾病特異基因、細胞骨架蛋白、鐵轉運相關蛋白等。結論石斛合劑序貫治療后的糖尿病大鼠與正常大鼠在轉錄、蛋白組學的層面上更加接近，對神經系統直接相關的多條通路具有保護作用。

石斛合劑；糖尿病；表達譜芯片；探索者蛋白芯片；神經系統

高糖代謝會給機體各系統帶來諸多損傷，如超氧化物和糖基化終末產物等代謝毒性物質的積聚、缺血缺氧、氧化應激、炎癥等均可最終導致神經組織凋亡、膠質增生等病理改變，甚至引起中樞神經系統疾病與認知障礙，如阿爾茨海默病(AD)等〔1～3〕。研究證明多個基因或蛋白分子在糖尿病神經系統病變中發揮關鍵作用，但從模型動物到藥物治療、并從全基因、蛋白組宏觀調控，綜合觀察多位點、多通路及其對神經系統交互作用的實驗研究還罕見報道。石斛合劑序貫療法可以使2型糖尿病(T2DM)患者燥熱煩渴、腰酸耳鳴、虛熱盜汗等臨床癥狀、體征明顯改善甚至完全消失，精神狀態普遍好轉。因此我們推測該療法對高糖高脂引發的神經系統損傷有一定的調控和修復作用。本實驗觀察石斛合劑序貫療法對老年糖尿病大鼠神經系統的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗材料 石斛合劑1、2號方基本組成：石斛、黃芪、五味子、丹參、葛根、生地黃等。石斛合劑3號方：茵陳、大黃、梔子、柴胡等。中藥生藥含量為：2.0 g/ml，滅菌后每瓶100 ml，分裝保存備用。將各組分按照比例進行混合后，加入500 ml水，浸泡1 h后，加熱煮沸熬制1 h。滅菌后每瓶100 ml，分裝保存。

1.2大鼠糖尿病模型的建立及給藥 購入SPF級健康雌性Wistar大鼠70只(8月齡，上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供)。動物實驗均經過倫理委員會批準和監督，并按照國際準則處理實驗動物〔4〕。適應性喂養7 d后，按體重隨機分為兩組：正常組15只、模型組55只。正常組給予基礎飼料(面粉19%，玉米粉23%，高粱粉6%，麩皮10%，脫脂奶粉20%，魚粉10%，淀粉7%，甘氨酸3%，啤酒酵母2%)，模型組給予高脂高糖飼料(糖15%，豬油10%，膽固醇4%，膽鹽0.3%，蛋黃粉10%，基礎飼料60.7%)。持續喂養16個月，并監測血糖。若未成模(隨機血糖≥16.7 mmol/L為成模)予以腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素(STZ，20 mg/kg)。3 d后用微量血糖儀篩選出成模大鼠，其余不成模大鼠再注射STZ，3 d后篩選，將2次成模大鼠隨機分入模型組、用藥組。根據前期工作研究，實驗動物用藥組的生藥量按12 g·kg-1·d-1灌胃(臨床等效藥量)：石斛合劑1、2號方分別灌胃6、12 d，再以石斛合劑3號方灌胃3 d，此為1個療程，每次換方停灌1 d，治療2個療程；共48 d。正常組和模型組按大鼠體重2 ml·200 g-1·d-1灌予生理鹽水。以上均于上午9～10點執行，每日1次。48 d后禁食，不禁水，稱量大鼠體重后以1%烏拉坦麻醉，迅速開腹，腹主動脈取血，4℃ 2 500 r/min離心10 min，分離血清，測空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、胰高血糖素(GLU)、糖化血清蛋白(GSP)。

1.3標本的制備及總RNA提取 在2個療程末，禁食隔夜，稱量體重后以1%烏拉坦麻醉，迅速開腹，取出肝臟組織置于液氮中儲存。取正常組、模型組、用藥組大鼠肝組織各1 g，采用Trizol試劑進行總RNA抽提。RNA質控結果2100 RIN≥7.0并且28S/18S≥0.7，樣品合格，進行下一步實驗。

1.4大鼠全基因組表達譜芯片與廣譜蛋白芯片檢測 各組大鼠的組織與RNA樣本送交上海伯豪生物工程有限公司進行Angilent大鼠全基因組表達譜芯片(4×44K)與Fullmoon探索者廣譜蛋白芯片測試。

1.5統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1各組FBG、FINS、GLU、GSP變化 與正常組比較，模型組FBG、GLU、GSP明顯增高(P<0.05)，FINS明顯降低(P<0.05)；與模型組大鼠比較，用藥組各項生化指標均有不同程度改善(P<0.05)。見表1。

表1 各組FBG、FINS、GLU、GSP變化

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05，下表同

2.2差異表達基因譜 用藥后的糖尿病大鼠近千個基因表達量趨于正常組，此為糾偏的基因。表2、表3為用藥組糾偏的神經系統相關基因及所屬通路。糾偏的基因主要屬于細胞骨架蛋白、細胞周期蛋白，嗅覺感受器、神經遞質系統、神經轉錄因子等幾個類別。

表2 糖尿病大鼠上/下調表達及治療后糾偏的神經系統相關基因

FC：模型組/正常組表達量；“-”：該基因屬于多條染色體；1)用藥組vs正常組差異仍然顯著的基因

表3 石斛合劑作用于神經系統的基因通路

2.3差異表達蛋白譜 由探索者廣譜蛋白芯片掃描的矩陣圖見圖1。每個綠色小點代表一個蛋白分子，共檢測656個位點，每板重復兩次。其中12個與神經系統相關蛋白經過治療后有所改善，分別為核轉錄因子(NF)-κB、胰島素樣生長因子(IGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)-1、Tau蛋白、淀粉樣前體蛋白(APP)、DJ-1蛋白、微管蛋白(Tub)、神經絲蛋白(Nf)、Ⅳ型膠原(CⅣ)、突觸素(Syn)、鐵蛋白(Fer)及轉鐵蛋白(Tfr)，但部分與正常組仍有顯著差異，見表4。

圖1 蛋白芯片掃描矩陣圖

表4 石斛合劑糾偏的蛋白表達量

3 討 論

肥胖、高血糖、高脂血癥是老年性神經系統疾病的危險因素，特別是與AD等疾病相關〔5～8〕。我們推測該療法對神經系統也具有一定的保護作用。

胰島素具神經營養功能，能刺激軸突生長，參與外周神經再生而且為交感神經存活所必需。在痛性糖尿病神經病變的病理生理過程中，胰島素效應下降導致的神經營養支持障礙起主要作用〔9〕。在損傷的神經中，雪旺細胞的表型發生了明顯改變，如細胞重新增殖、遷移，此過程受許多細胞因子的影響，從而調控神經的再生〔10〕。高血糖或是糖尿病狀態會造成細胞因子表達異常，如神經內膜細胞的NF-κB與細胞間黏附因子(ICAM)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α在相同部位表達上調等〔11〕。這些表達異常造成細胞氧化損傷與缺血再灌注的炎癥反應增強，從而導致軸突退變或施萬細胞凋亡增多〔12〕。

本研究表明，Insr、Igf2r、Igf1r mRNA、NF-κB蛋白表達量有所升高，IGF-1、FGF-1蛋白表達下調，可能與糖尿病神經病變的發生與發展有一定關系，經過石斛合劑序貫治療有一定改善或達到與正常組相似水平。

正常腦組織中Tau蛋白的細胞功能是與Tub結合促進其聚合形成微管；AD患者腦的Tau蛋白則異常過度磷酸化，并喪失正常生物功能。Hong等〔13〕在體外培養人神經細胞中觀察到，外周胰島素水平下降可以抑制PI-3K的活性，從而導致Tau蛋白在發生磷酸化。在本研究中Tau蛋白表達量有所升高，經治療后基本恢復正常。而且，Tau蛋白數量和結構的改變可影響微管的穩定性和與此蛋白相關的其他過程〔14〕。

APP是AD的致病基因。AD的一個主要病理特征是大腦中沉積的老年斑，其主要成分是APP的剪切產物Aβ。據此，Aβ的堆積被認為是發生AD的主要原因。Wang等〔15〕在果蠅的神經系統和非神經系統中表達人源APP蛋白，證明APP在各種組織細胞中均能誘導細胞死亡，并導致果蠅運動能力的缺陷。帕金森病(PD)相關DJ-1蛋白表達于各種神經疾病的大腦及腦脊液中，高度表達與神經元和神經膠質細胞中，是這些疾病的一個生物學標志〔16，17〕。

本研究表明基因層面表達量的改變較蛋白層面小，高糖高脂喂養對神經系統的影響主要在于轉錄后調控。經治療后幾種蛋白顯著下降，提示此類蛋白主要屬于翻譯水平的調控，石斛合劑治療法可抑制Tau、APP、DJ-1蛋白的超表達造成的神經損傷。

本實驗發現，Tub在糖尿病模型大鼠中表達量減少，和Asanuma等〔18〕在缺血性腦損傷后急性期海馬區Tub表達減少的研究結果類似。Nf在神經變性疾病的相關研究中備受重視，多項研究提示其有可能作為PD與多系統萎縮、進行性核上性麻痹及不同類型癡呆進行鑒別診斷的生物學標記物〔19～21〕。任何一種亞單位的過度表達和缺失都會影響Nf的正常組裝〔22〕。在多種神經退行性疾病中，均可見到Nf蛋白的變化，如肌萎縮側索硬化癥和脊髓性肌萎縮癥〔23〕。對多種自發的和誘發的神經突變的小鼠分析表明，Nf含量的異常可選擇性地引起運動神經細胞退行性變和死亡〔24〕。

CⅣ也是基膜的主要成分之一，能夠促進細胞貼壁、生長和分化〔25，26〕。Lein等〔27〕也觀察到CⅣ的早期作用能加快軸突生長的速度、增加神經纖維的數目和長度，長期作用主要是維持單根軸突的長度。目前認為CⅣ之所以能夠促進軸突的生長是因為神經細胞表面存在著能與它們功能基團相結合的受體〔28〕。本研究表明神經骨架系統發生的改變雖然是動態平衡的，但在受到損傷后卻較難逆轉。

Syn的生理功能尚未徹底闡明，推測主要有以下幾個方面：參與突觸囊泡胞吐及Ca2+依賴的神經遞質的釋放；參與突觸囊泡再循環；參與突觸的發生和形成〔29，30〕。本研究證明石斛合劑序貫治療可改善老年糖尿病大鼠Syn水平的降低，增強突觸可塑性，這種改善可能與神經新突觸形成有關。

Fer水平升高被認為是糖尿病發生、發展過程中的重要的獨立預測因子。Fer是反映機體貯存鐵的一個指標，已有許多研究表明過量Fer與冠心病和胰島素抵抗相關，也有一些流行病學研究提示血清Fer水平升高和糖尿病的增加呈正相關〔31，32〕。因此認為血清Fer水平增高也是糖尿病風險增加的危險因素。在代謝綜合征的諸多因素中只有高血糖與血清Fer水平獨立相關，糖尿病的高血糖是導致高Fer水平的主要因素〔33〕。

腦內的Fer、Tfr表達量的過度上調和下降都會引起鐵代謝紊亂，并導致神經系統退行性疾病的發生。在腦腫瘤中，Tfr誘導的氧化聚集抑制了酪氨酸磷酸酶，激活了細胞分裂素活化蛋白激酶和Akt，并抑制細胞周期調節因子 (p21、cdk等)，促進腫瘤細胞的增殖〔34〕。多動癥可能是由于Tfr1的mRNA的去穩定化，從而造成細胞攝取鐵減少〔35〕。當上調Tfr 1，淀粉樣前體蛋白mRNA在5′非翻譯區與鐵反應元件蛋白的相互作用減弱，淀粉樣前體蛋白表達減少，從而AD得到緩解〔36〕。在許多神經變性性疾病均已發現腦內鐵含量異常增高，并伴有氧化應激存在。本研究證明石斛合劑序貫治療可調整老年糖尿病大鼠鐵相關蛋白水平，與神經系統的保護作用有一定關系。嗅覺受體1583、嗅覺受體1096等十幾種嗅覺受體均有不同程度的mRNA下調表達，用藥后基本恢復與正常組一致。由于嗅覺受體基因在基因組中屬于數量較大的家族，因此發生改變的種類較多。嗅覺影響是神經系統受損的初步表現，提示糖尿病發病與嗅覺受體的表達可能存在一定相關性，其機制尚不明了，有待于更深入的研究。

中藥復方的藥味配伍體現著化學成分的有機組合、復方作用環節(靶點)的協同作用。通過這種作用最終作用到轉錄組、蛋白組整體上，復方的效果表現為不同位點作用的組合，表現為靶點的協同作用和整體性調節，從微觀改變進而達到宏觀表型、證型的變化。本研究發現石斛合劑在調節糖尿病大鼠的血糖血脂的基礎上，對神經系統功能有一定的調節、保護作用，提示可能在未來用于具有神經系統疾病并發癥的糖尿病患者及老年神經性疾病的預防。

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R-332

A

1005-9202(2017)23-5775-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.012

福建省自然科學基金資助項目(No.2015J01686)；2016～2019福建省中醫藥科研項目(No.2017FJZYLC202);福建省衛生廳醫學創新項目(No.2014-CX-29)；福建中醫藥大學2014年重點學科專項校管課題(No.X2014029)

1 福建醫科大學醫學技術與工程學院

施 紅(1964-),女，博士，教授，博士生導師，主要從事中西醫結合糖尿病的基礎和臨床研究。

許 茜(1985-)，女，講師，碩士，主要從事醫學遺傳學研究。

〔2016-06-01修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)