SREBP-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

岳朝馳 楊向東

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸科，四川 瀘州 646000)

SREBP-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義

岳朝馳 楊向東1

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肛腸科，四川 瀘州 646000)

目的探討固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)特征及其與患者病情及預(yù)后的相關(guān)性。方法臨床收集56例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織及相應(yīng)的癌旁組織，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)及免疫組化(IHC)技術(shù)檢測(cè)組織中SREBP-1的表達(dá)，分析結(jié)直腸癌組織SREBP-1 mRNA的表達(dá)水平與患者年齡、體重、性別、腫瘤大小、臨床Dukes分期及病理學(xué)分級(jí)的相關(guān)性，比較SREBP-1陽(yáng)性率與患者臨床資料間的關(guān)系，Kaplan-Meier生存分析法分析患者結(jié)直腸癌組織SREBP-1 mRNA的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果RT-PCR結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織SREBP-1 mRNA表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，IHC的結(jié)果示結(jié)直腸癌組織中細(xì)胞SREBP-1陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(P<0.05)。Spearman相關(guān)性分析顯示患者結(jié)直腸癌組織SREBP-1的表達(dá)與患者年齡、性別、體重及腫瘤大小無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，與患者臨床Dukes分期及病理學(xué)分級(jí)呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。kaplan-Meier生存分析示癌組織中高表達(dá)SREBP-1的患者預(yù)后不良。結(jié)論SREBP-1高表達(dá)于結(jié)直腸癌組織，且與腫瘤惡性程度、進(jìn)展及患者不良預(yù)后密切相關(guān)，是潛在的結(jié)直腸癌標(biāo)志物。

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白；結(jié)直腸癌；Dukes分期；病理學(xué)分級(jí)

固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)-1是體內(nèi)膽固醇濃度調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，近年有研究顯示，其參與肝細(xì)胞癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔1，2〕，但在結(jié)直腸癌中的作用尚不明確。本研究擬探究SREBP-1與結(jié)直腸癌患者臨床資料及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2013年2月至2014年9月入院的56例結(jié)直腸癌患者，均行根治性手術(shù)治療，切除的手術(shù)組織標(biāo)本送至病理科進(jìn)行病理診斷及免疫組化，另取部分組織標(biāo)本及癌旁組織(距癌變病灶>5 cm以上)置于液氮中保存，待抽提RNA行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)實(shí)驗(yàn)。其中男32例，女24例；年齡32～73〔平均(57.2±11.4)歲；體重42.0～76.0 kg，平均(62.2±8.9)kg；腫瘤原發(fā)灶最長(zhǎng)徑≥3 cm 25例，<3 cm 31例，平均(2.79±1.68)cm；患者Dukes分期及病理學(xué)分級(jí)均以國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)(ACS)聯(lián)合制定的分期分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)〔2〕，其中Dukes A期12例，B期21例，C期17例，D期6例；根據(jù)腺管的形成比例評(píng)價(jià)患者的病理學(xué)分級(jí)：高分化結(jié)直腸癌(>95%腺管形成)23例，中分化(≥50%并≤95%腺管形成)17例，低分化(<50%腺管形成)16例?；颊呔鶠槌醢l(fā)結(jié)直腸癌病例，未合并其他明顯的器質(zhì)性疾病，且入院前未經(jīng)過(guò)任何形式的相關(guān)治療。治療后的患者進(jìn)行隨訪觀察2年。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器及材料 實(shí)驗(yàn)儀器主要包括：PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems)、超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Nanodrop2000)、9700熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems)、超凈工作臺(tái)(美國(guó)Bio-Rad)、快速冷卻離心機(jī)5810R(德國(guó)Eppendorf)、RM2235切片機(jī)(德國(guó)Leica Biosystems)、DM500光學(xué)顯微鏡(德國(guó)Leica Biosystems)，各規(guī)格吉爾森P型移液器(荷蘭Pipetman)，陶瓷研磨器等。實(shí)驗(yàn)耗材：1.5 ml離心管、凍存管、PCR用8連管及各規(guī)格一次性移液槍槍頭(美國(guó)Axygen Brand Products)，熒光定量96孔板及熒光定量96孔板(美國(guó)Applied Biosystems)等。實(shí)驗(yàn)試劑：RNAiso Plus (日本Takara)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas)，定量PCR核酸熒光染料試劑盒(SYBR Green Supermix，美國(guó)Bio-Rad)，二甲苯、甲醇、無(wú)水乙醇、過(guò)氧化氫、氯仿及異丙醇等有機(jī)溶劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，無(wú)核酸酶水(上海生工生物公司)，GTVisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(上?；蚩萍脊煞萦邢薰?等，實(shí)驗(yàn)抗體為抗SREBP-1抗體(ab28481，美國(guó)abcam)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 手術(shù)取出腫瘤組織及癌旁組織送病檢，各留取20 mg組織-80℃保存，抽提RNA時(shí)在低溫?zé)o核酶的條件下在研磨器中眼科剪盡量剪碎組織并研磨至細(xì)小組織塊，研磨完成后在組織中加入1 ml RNAiso Plus，于冰上裂解5 min，12 000 r/min 4℃離心5 min，收集上清液置準(zhǔn)備好的新離心管中，去除較大組織塊，加入200 μl氯仿，震蕩混勻后靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心15 min，收集上清液置準(zhǔn)備好的新離心管中，加入1 ml異丙醇，室溫靜置10 min，去上清后75%乙醇清洗沉淀，7 500 r/min 4℃離心5 min，盡量吸去上清，室溫下風(fēng)干后30 μl無(wú)核酶水溶解。超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，取1 μg行逆轉(zhuǎn)錄，所有反應(yīng)在冰上進(jìn)行操作，將混合好的反應(yīng)液1以3 μl/孔加入8連管中，加無(wú)核酶水至10 μl；42℃，配置反應(yīng)液2，無(wú)核酶水定容至20 μl；37℃，15 min后85℃ 5 s，得到的cDNA稀釋至500 μl。熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系檢測(cè)基因表達(dá)水平。反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃ 4 min，擴(kuò)增條件 94℃ 30 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。SREBP-1產(chǎn)物大小226 bp：上游引物-GGGGACAAGGAATTCTCGGA，下游引物-TCACCACAGCTGTCAGAGAG，內(nèi)參基因β-actin產(chǎn)物大小186 bp：上游引物-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC，下游引物-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT。

1.3.2免疫組化(IHC) 將切取的組織用固定液處理24 h，之后水化切片，將石蠟切片浸于二甲苯中10 min，取出切片置于無(wú)水乙醇中5 min，再置于90%、85%、80%、75%及70%梯度酒精中各3 min。0.3%過(guò)氧化氫(H2O2)處理切片10 min，用蒸餾水沖洗3次，切片放入抗原修復(fù)液中，放入高壓鍋中加熱至沸騰，蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)4 min。修復(fù)完成后待切片自然冷卻，蒸餾水沖洗5 min。37℃下干燥后，滴加3% H2O2于組織上，避光孵育15 min。蒸餾水沖洗5 min。滴加100 μl 1∶500 SREBP-1的一抗于組織上。室溫孵育1 h，蒸餾水沖洗5 min，擦干組織周圍的蒸餾水。滴加100 μl IHC試劑盒中的A液于組織上，室溫孵育30 min，蒸餾水沖洗3次，每次5 min，擦干組織周圍的蒸餾水。滴加100 μl顯色劑二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液于組織上，室溫孵育10 min，二級(jí)水沖洗終止顯色。依次置于70%、75%、80%、85%、95%及100%乙醇中脫水，各3 min，脫水后浸于二甲苯中15 min，中性樹封片。IHC染色切片采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，每張切片選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野觀察100個(gè)腫瘤細(xì)胞，計(jì)算平均陽(yáng)性的細(xì)胞比例。以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞或陽(yáng)性細(xì)胞<10%的為陰性(-)，≥10%為陽(yáng)性(+)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗(yàn)、Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)和Kaplan-Meier生存分析法。

2 結(jié) 果

2.1SREBP-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) 結(jié)直腸癌組織中SREBP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量(0.185±0.010)顯著高于癌旁正常組織(0.090±0.007，t=7.57，P<0.01)。結(jié)直腸癌細(xì)胞SREBP-1陽(yáng)性率為51.8%(29/56)，顯著高于癌旁正常組織的16.1%(9/56)(χ2=7.672，P<0.01)。見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌組織與正常組織SREBP-1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率(×200)

2.2結(jié)直腸癌組織SREBP-1表達(dá)與患者一般資料的相關(guān)性 結(jié)直腸癌組織中SREBP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與患者性別、年齡及體重均無(wú)相關(guān)性(rs=0.116、0.265、0.173，均P>0.05)。SREBP-1陽(yáng)性患者與陰性患者性別、年齡及體重差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同結(jié)直腸癌組織SREBP-1蛋白表達(dá)水平患者一般資料比較〔n(%)〕

2.3結(jié)直腸癌組織SREBP-1表達(dá)水平與患者結(jié)直腸癌進(jìn)展的相關(guān)性 結(jié)直腸癌組織中SREBP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與患者腫瘤大小無(wú)相關(guān)性(rs=0.279，P>0.05)，但與臨床Dukes分期及病理分級(jí)存在相關(guān)性(rs=0.574，0.522；P<0.01)。SREBP-1陽(yáng)性患者與陰性患者腫瘤大小差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與Dukes分期及病理學(xué)分級(jí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01，P<0.05)。見表2。

表2 不同結(jié)直腸癌組織SREBP-1蛋白表達(dá)水平患者臨床病理資料比較〔n(%)〕

2.4結(jié)直腸癌組織SREBP-1表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 高表達(dá)SREBP-1患者(SREBP-1 mRNA表達(dá)水平高于平均值0.185)預(yù)后水平相比低表達(dá)患者顯著不良(P<0.01)。見圖2。

圖2 結(jié)直腸癌組織SREBP-1 mRNA表達(dá)水平與患者生存時(shí)間的關(guān)系

3 討 論

SREBP-1基因位于17p11.2染色體上，其編碼的轉(zhuǎn)錄因子SREBP-1是體內(nèi)關(guān)鍵的固醇調(diào)控分子，SREBP-1在細(xì)胞質(zhì)中合成后進(jìn)入細(xì)胞核與固醇調(diào)控元件(Sre1)結(jié)合，促進(jìn)低密度脂蛋白膽固醇的形成，是脂代謝的重要組成部分〔3〕。隨著惡性腫瘤與脂代謝的密切關(guān)系〔4〕逐漸引起人們的重視，SREBP-1被發(fā)現(xiàn)參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展：Bao等〔5〕的研究發(fā)現(xiàn)，SREBP-1在乳腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與乳腺癌的惡性程度及病情進(jìn)展均呈顯著正相關(guān)，且體外研究顯示SREBP-1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和MCF7的增殖侵襲能力。Gibot等〔6〕發(fā)現(xiàn)他汀類藥物降血脂的同時(shí)可通過(guò)阻斷SREBP-1的效應(yīng)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞HGT-1的凋亡。劉洋等〔7〕發(fā)現(xiàn)SREBP-1在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)，其表達(dá)與患者年齡、臨床分期及惡性程度呈顯著正相關(guān)，且高表達(dá)SREBP-1的患者預(yù)后不良。Huang等〔8〕發(fā)現(xiàn)SREBP-1可通過(guò)增加活性氧(ROS)和表達(dá)NADPH氧化酶5(NOX5)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生，且SREBP-1表達(dá)與前列腺癌臨床Gleason等級(jí)正相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)顯示SREBP-1參與前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及細(xì)胞耐藥。Li等〔9〕在肝細(xì)胞癌組織中也發(fā)現(xiàn)SREBP-1的高表達(dá)，其與患者腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)及不良預(yù)后均呈顯著正相關(guān)，其體外研究顯示SREBP-1能明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2和MHCC97L的增殖及侵襲能力，并抑制其凋亡。Nie等〔10〕發(fā)現(xiàn)惡性卵巢癌中SREBP-1的陽(yáng)性率顯著高于良性和交界性卵巢腫瘤，體外使用短發(fā)夾RNA(shRNA)抑制卵巢癌細(xì)胞SREBP-1的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖侵襲能力減弱，且凋亡增加；體內(nèi)裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示抑制SREBP-1可減弱卵巢癌細(xì)胞的成瘤能力。Geng等〔11〕發(fā)現(xiàn)固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(SOAT)-1可通過(guò)抑制SREBP-1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，Peng等〔12〕也發(fā)現(xiàn)SREBP-1在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且參與惡性膠質(zhì)瘤的增殖。以上研究均表明SREBP-1在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡存在密切關(guān)系，但其在結(jié)直腸癌中的表達(dá)特性及臨床意義尚不明確。

本研究結(jié)果提示SREBP-1可能與促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性行為的產(chǎn)生有關(guān)，SREBP-1可能通過(guò)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的程度，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，kaplan-Meier生存分析結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了SREBP-1在結(jié)直腸癌中的促癌效應(yīng)，SREBP-1的高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。但本研究并未明確SREBP-1與結(jié)直腸癌腫瘤大小的關(guān)系，未能為SREBP-1與結(jié)直腸癌增殖能力的關(guān)系提供線索，可能因?yàn)闃颖玖枯^少，導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著。

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R73

A

1005-9202(2017)23-5851-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.23.047

1 成都肛腸?？漆t(yī)院肛腸科

楊向東(1961-)，男，主任醫(yī)師，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肛腸疾病的中醫(yī)藥防治研究。

岳朝馳(1983-)，男，博士在讀，主治醫(yī)師，主要從事肛腸疾病的中醫(yī)藥防治研究。

〔2017-05-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)