Evi1基因對膠質瘤細胞株U87/U251增殖、侵襲的影響

余仁春，胡圓，孫春明，殷洪偉，周幽心

Evi1基因對膠質瘤細胞株U87/U251增殖、侵襲的影響

余仁春，胡圓，孫春明，殷洪偉，周幽心

目的探討Evi1基因在不同級別膠質瘤組織中的表達，以及調控該基因對膠質瘤細胞株U87和U251細胞增殖、細胞周期和侵襲影響，為靶向癌基因治療膠質瘤提供客觀依據。方法首先通過實時定量PCR(qRT-PCR)分別檢測人腦不同級別膠質瘤組織以及U87和U251細胞株中Evil基因的表達水平。用合成的小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾下調U87和U251細胞Evi1基因表達作為干擾組，同時設空白和陰性對照組。qRT-PCR檢測轉染前后Evi1基因在U87和U251細胞中的表達和轉染效率。CCK-8法檢測實驗組細胞的增殖能力，流式細胞儀分析Flow Cytometer(FCM)其細胞周期。Transwell以及劃痕試驗檢測各組U87和U251的侵襲和遷移能力。以及用qRT-PCR分析下調Evi1基因后U87和U251細胞基質金屬蛋白酶2(MMP2)的表達水平。結果Evi1基因在膠質瘤組織中呈現高表達，且隨著膠質瘤級別程度增加其表達水平亦上升，其中Ⅲ和Ⅳ級的膠質瘤組織以及U87、U251細胞Evi1基因表達明顯高于非瘤腦組織(均P<0.05)。通過siRNA下調Evi1基因后，膠質瘤細胞株U87和U251的增殖減緩(均P<0.05)，其侵襲和遷移能力明顯下降(均P<0.01)，并能阻滯其細胞周期G1期(P<0.05)。干擾組U87和U251細胞MMP2表達水平明顯降低(均P<0.01)。結論Evi1基因在膠質瘤中呈高表達，干擾U87和U251細胞Evi1基因可抑制膠質瘤的增殖和侵襲。

Evi1基因；膠質瘤；RNA干擾；增殖；侵襲

在顱腦腫瘤中膠質母細胞瘤具有高發病率、高復發率、高死亡率和低治愈率等特點，越來越引起了高度重視。目前該腫瘤的治療手段包括手術治療、化學藥物治療、放射治療，但中位生存期只有14.6個月左右[1]。隨著人類對腫瘤分子生物學研究的深入,認識到某些基因的突變可能是腫瘤發生發展的關鍵，基因治療日逐漸成為一個新的研究熱點。文獻報道，作為原癌基因的Evi1基因定位于人類染色體3q26,在正常人骨髓和外周血細胞中均不表達,但在肝癌、卵巢癌以及AML/MDS等疾病中呈現高表達；且證實下調其表達后，對那些實體腫瘤細胞的增殖、侵襲以及凋亡均有影響[2-5]。在膠質瘤組織及細胞株中是否也有類似的現象，未見報道。本實驗通過研究Evi1基因在膠質瘤中的表達水平及其對膠質瘤細胞增殖、侵襲的影響，探討神經膠質瘤的潛在分子治療靶點,為臨床治療膠質瘤提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 膠質瘤組織標本 人腦神經膠質瘤標本來自蘇州大學第一附屬醫院從2010年1月至2014年12月神經外科手術切除的膠質瘤組織，共有40例膠質瘤標本和7例非腫瘤腦組織標本。其中,包括15例低級別膠質瘤組織(WHOⅡ級，少突膠質瘤2例，星形細胞瘤13例)和25例高級別膠質瘤組織(WHO Ⅲ級12例，間變型少突膠質瘤1例，星形細胞瘤8例，間變型室管膜瘤3例；WHO Ⅳ級13例，全部為膠質母細胞瘤)。所有組織標本從患者顱內切除后立刻放入液氮中以供實驗使用。

1.2 細胞及試劑 膠質瘤細胞株U87、U251(中國上海生命科學院生物細胞研究所)，在添加10%胎牛血清的DMEM培養液中培養,培養箱設置條件為37℃、5%CO2。取對數生長期的細胞用于實驗。Lipofectamine 2000(invitrogen公司)，DMEM(Corning公司),血清(Gbico公司)，CCK8試劑(碧云天公司)，細胞周期試劑盒(碧云天公司)， transwell小室(Corning公司)。

1.3 引物 Evi1基因引物和基質金屬蛋白酶2(MMP2)引物，以及GADPH內參引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Evi1擴增引物sence:5′-TTTCCAGGTCACTGCCACTT-3′,antisence:5′-ACACCCATGTGTAGGGGACA-3′。MMP2擴增引物sence:5′-AGGATGGCAAGTACGGCTTC-3′,antise-nce:5′-CTTCTTGTCGCGGTCGTAGT-3′。GAPDH 引物sence:5′- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,antise-nce 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。3條體外人工合成siRNAolgio的序列如下，siRNA-1sence:5′-GCUGAUUGCAGAACCCAAA-3′,antisence:5′-UUU-GGGUUCUGCAAUCAGC-3′;siRNA-2sence:5′-GCA-CUACGUCUUCCUUAAA-3′,antisence:5′-UUUAAG-GAAGACGUAGUGC-3′;siRNA-3sence:5′-GGAAG-CAACGUCGAAUCAA-3′,antisence:5′-UUGAUUC-GACGUUGCUUCC-3′;以及1條陰性對照(siRNA-Negative Control)sence:5′-UUCUCCGAACGUGUCA-CGU-3′,antisence:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成。

1.4 細胞轉染 調整細胞密度為15～20×104/ml,鋪6孔板，轉染時要求細胞匯合率80%～90%。首先以lipofectamine 2000為轉染試劑，將20 μmol/L的siRNAolgio 5 μl與250 μl DMEM稀釋，室溫下溫育5 min。同時，將5 μl的lipofectamine 2000與DMEM培養液250 μl混勻,形成混懸液，最后將兩者混勻，在室溫下孵育20 min,形成siRNA與lipofectamine2000稀釋液的轉染復合物。并將其加入U87以及U251細胞,然后置細胞培養箱。3條siRNA干擾鏈和siRNA Negative Control鏈最終濃度為 100 μmol/L。

分別予以3條干擾鏈以及陰性對照鏈處理U87以及U251細胞，包括未予以任何處理的空白組，24 h 后提取RNA，以陰性對照作為參考，同樣將RNA逆轉錄成cDNA。分別用Evi1基因和GAPDH內參基因引物于熒光定量PCR儀進行實時定量PCR(qRT-PCR)擴增，最后以陰性對照作參照，用2-△△CT方法計算3條干擾鏈對Evi1基因下調水平，選擇干擾效果最好的1條鏈用作后續試驗。

1.5 組織及細胞株的RNA提取 用Trizol法分別提取膠質瘤組織標本,非瘤腦組織和轉染前后的膠質瘤細胞株的總RNA，逆轉錄成cDNA。分別用Evi1基因和GAPDH引物于熒光定量PCR儀進行qRT-PCR擴增，以GAPDH作參照。按照試劑盒說明書，擴增體系為20 μl，2×All-in-One qPCMix 10 μl，miRNAqPCR Primer 2 μl，Universal Adaptor PCR Primer 2 μl，cDNA 2 μl，50×ROX Referenc Dye 0.4 μl，ddH2O 3.6 μl。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，63℃退火20 s，72℃延伸20 s，反應40個循環，溶解曲線溫度范圍：65～95℃。qRT-PCR結果判定：△Ct=CT目的基因-CT內參(GAPDH)，△△CT=△CT治療組-△CT對照組，RQ(relative quantification)治療組=2-△△CT，RQ對照組=1[6]。

1.6 CCK8及細胞周期試驗 將轉染24 h的空白對照和陰性對照組，以及干擾組膠質瘤細胞(U251或U87)重新制成單細胞懸液，2×104個細胞/ml，取100 μl接種到96孔板中，每組設3個復孔，置于37℃,5%CO2培養箱中培養6 h、24 h、48 h、72 h后，向每孔中加入10 μl CCK-8溶液，置于培養箱再培養4 h，用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度(OD值)，用Graphpad Prism5.0繪制增殖曲線。將轉染后的膠質瘤細胞用胰酶消化后收集于離心管，PBS清洗后再加入70%乙醇1 ml，4℃過夜。PBS洗滌過夜細胞后加入碘化丙啶染色液與RNase A以及染色緩沖液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，37℃避光溫浴30 min，應用流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.7 細胞侵襲與劃痕試驗 用無血清培養基6∶1稀釋Matrigel膠后勻鋪于Transwell小室，每孔40 μl，37 ℃反應30 min，使Matrigel聚合成膠。將實驗3組轉染后24 h的膠質瘤細胞胰酶消化，并用不含血清的DMEM培養基制成單細胞懸液，密度為5×105/ml,取100 μl并加入200 μl DMEM接種于transwell上層小室，下層小室加入750 ml含血清培養基，在37℃、5%CO2培養箱中37℃連續培養48～72 h。用濕棉簽擦去上層細胞，4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色1 min，高倍鏡下隨機取6個視野計數，取平均數。重復3次。細胞鋪于6孔板，并且予以siRNA-1以及siRNA陰性對照轉染24 h 后，用200 μl黃槍頭的槍尖在細胞培養板各孔中央垂直劃出一條貫穿培養孔的劃痕；吸去細胞培養液，PBS漂洗細胞，去除懸浮細胞和細胞碎片，各孔拍照，作為0 h的細胞遷移圖；重新再各孔添加培養基，繼續培養6 h、12 h、24 h時各孔拍照，觀察細胞遷移情況。

1.8 轉染siRNA-oligo后各組細胞的MMP2表達 分別用干擾鏈以及陰性對照鏈處理U87以及U251細胞(同細胞轉染步驟)，包括未予以任何處理的空白組；24 h后提取RNA，以陰性對照作為參考，同樣采用將RNA逆轉錄成cDNA。分別用MMP2基因和GAPDH內參基因引物于熒光定量PCR儀進行PCR擴增，以陰性對照作參照，用2-△△CT方法計算干擾組對MMP2基因下調的影響。

1.9 統計學方法 應用SPSS 13.0統計軟件分析處理數據。多組均數間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 qRT-PCR結果 通過Trizol法提取的膠質瘤組織以及非瘤腦組織的RNA,用紫外分光光度計檢測RNA組織的純度A260/280均在1.90以上，濃度在450 ng/μl以上，表明提取的RNA質量符合要求。采用2-△△CT計算顯示,正常腦組織與高級別膠質瘤組織(Ⅲ級和Ⅳ級) Evi1基因表達水平比較，差異有統計學意義(均P<0.05),并且膠質瘤級別越高，Evi1基因的表達水平也越高(圖1)。

圖1 正常腦組織與不同級別膠質瘤組織Evi1基因的表達水平(注：與正常腦組織比較*P<0.05)

2.2 膠質瘤細胞株U87和U251細胞的Evi1基因表達水平及轉染效率 見圖2。膠質瘤細胞株U87、U251的Evi1基因表達水平均高于于非瘤腦組織。用帶熒光的小分子合成的siRNA轉染U87、U251細胞，用熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測轉染效率，U87的轉染效率為90.1%，U251的轉染效率為97.9%，均在90%以上。

圖2 A：Evi1基因在U87和U251膠質瘤細胞株與非瘤腦組織之間的表達差異；B：轉染NC-FAM后熒光顯微鏡下，轉染前、后的細胞對比；C：流式細胞儀檢測膠質瘤細胞株U87和U251的轉染效率

2.3 siRNA最佳干擾鏈的選擇 吉瑪公司設計可供選擇的3條siRNA干擾鏈中，siRNA-1和siRNA-3干擾鏈對細胞的干擾效果好,基因表達水平下降明顯(均P<0.01)；siRNA-1干擾效果又好于siRNA-3(P<0.01)；見圖3。故本實驗選用siRNA-1干擾鏈用于后續的試驗。

2.4 轉染siRNA-1后對細胞周期和增殖的影響 膠質瘤細胞株U87和U251細胞干擾組與空白組及陰性對照組相比，Evi1基因表達水平下降。CCK8實驗顯示，轉染siRNA可抑制膠質瘤細胞株的生長，細胞生長變慢；實驗組比陰性對照組及空白組的OD值明顯下降(均P<0.05)。細胞周期實驗顯示，細胞更多停留在G1期，延緩進入S期(P<0.05)；細胞增殖受到明顯抑制。見圖4。

2.5 轉染siRNA-1對膠質瘤細胞侵襲能力的影響 見圖5、圖6。U87和U251細胞轉染siRNA-1后，干擾組與空白組和陰性對照組相比，U87和U251細胞的Evi1基因表達水平下降。48 h觀察腫瘤細胞穿過Matrigel膠的數目要明顯少于陰性對照及空白組(均P<0.01)。

圖3 3條siRNA干擾鏈對基因表達水平的影響

圖4 A：干擾組、陰性對照組及空白組的CCK8增殖曲線；B：干擾組、空白組和陰性對照組的細胞周期；C、D：分別為U87和U251 FCM不同時期(G1，S，G2/M)和分布

圖5 A：Transwell實驗顯微鏡下，空白組、陰性對照組、干擾組U87和U251細胞的浸潤狀態；B、C：轉染48 h后，空白組、陰性對照組、干擾組U87和U251細胞穿過Matrigel膠的數目

圖6 轉染siRNA-1后劃痕實驗顯示，U87和U251細胞的遷移能力受到抑制

劃痕實驗結果顯示，24 h后干擾組遷移的膠質瘤細胞明顯少于陰性對照組及空白組。表明下調Evi1基因后，膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力有明顯降低。

2.6 U87、U251細胞轉染siRNA-1后MMP2 mRNA表達水平的改變 見圖7。轉染EVI1基因后，U87、U251細胞MMP2 mRNA表達水平比陰性對照組及空白組明顯減低(均P<0.01)。表明U87、U251細胞的侵襲以及浸潤能力明顯下降。

圖7 U87、U251細胞轉染siRNA-1后MMP2 mRNA表達水平的變化

3 討 論

目前膠質瘤的治療仍以外科手術切除為主。術前影像學檢查，術中多模態神經導航，術中電生理監測、熒光顯影等微創技術的應用，使膠質瘤組織的精準切除率越來越高，神經功能的保護也越來越好。手術后對于膠質母細胞瘤常規使用標準化的替莫唑胺化療，以及更加精確化的適形放療[7]。然而膠質母細胞瘤的療效仍然很不理想。隨著精準醫療的發展，在許多腫瘤治療方面，分子靶向藥物的運用越來越廣泛；越來越多的研究發現此類疾病的根源在于基因的改變，進而造成原癌基因激活成為癌基因，以及抑癌基因的失活，進而造成信號通路的激活，引起級聯反應，造成疾病的加劇和進展。故而人們設想在基因層面治療癌癥，從而希望能從根源上治愈惡性腫瘤，改善患者的預后。在血液系統疾病的研究中，有學者發現Evi1基因的表達差異對骨髓異常增生綜合征/急性髓細胞白血病(MDS/AML)患者的預后造成極其嚴重的影響，其陽性表達的白血病轉歸較陰性表達的白血病轉歸預后更差[8]。在肝癌、前列腺癌、腸癌等實體腫瘤發生進展過程中，無論在體外，或者體內試驗發現，Evi1基因對實體腫瘤細胞的增殖、侵襲有促進作用，同時抑制細胞凋亡，減弱腫瘤細胞對放化療的敏感性。本實驗發現，Evi1基因在膠質瘤組織中呈高表達，尤其是在高級別膠質瘤組織中。應用siRNA下調其表達后，對膠質瘤細胞株U87、U251的增殖、侵襲有抑制作用，把腫瘤細胞周期阻止在G1期。在本實驗中,通過流式細胞儀檢測到轉染Evi1-siRNA后，U87、U251細胞G1期細胞顯著增多,S期細胞明顯減少,幼稚期細胞數明顯增加，細胞增殖受抑制，使細胞阻滯在G1期,抑制細胞的有絲分裂。提示利用siRNA抑制Evi1基因的表達可能是一種治療由Evi1過表達引起的顱腦惡性腫瘤，尤其是膠質瘤的新途徑。因此推斷，由于某些理化因素導致Evi1基因激活成為癌基因，進而導致癌細胞過度增殖。

Evi1基因所編碼的蛋白位于核內，可通過鋅指蛋白結合DNA序列。其作為轉錄因子，可以通過基因突變、移位、插入等導致基因功能改變，從而導致下游靶向通路某些蛋白發生改變。在許多類型的惡性腫瘤中，PTEN作為Evi1基因的靶向蛋白，基因可調節PTEN的表達，進而激活PI3K/AKT通路，促進腫瘤的生長；這點已經有學者在白血病以及其他惡性實體腫瘤的細胞模型研究中得以證實[9]。但是否在膠質瘤，尤其是在惡性膠質母細胞瘤中，也存在同樣的機制，值得進一步研究和探討；以及進一步研究靶向該基因的藥物，延長膠質瘤患者，尤其是惡性膠質母細胞瘤患者的生存期，且能提高患者的生活質量。

本研究發現，Evi1基因可以激活U87、U251細胞下游的腫瘤侵襲相關基因MMP2。MMP2屬于Ⅳ型膠原酶/明膠酶,可降解基底膜Ⅳ型膠原和變性的間質膠原(明膠)，對腫瘤侵襲、浸潤起著至關重要的作用[10]。基底膜是顱內血-腦屏障，以及神經膠質細胞的作用造成天然的防御作用。但腫瘤細胞分泌的MMP2或激活MMP2通路后，對腫瘤內和周圍組織的基底膜能起到破壞作用，造成腫瘤細胞和血-腦屏障的破壞；導致腫瘤細胞的浸潤加劇，進而腫瘤實體的形成和發展擴散。

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EffectsofEvi1geneonproliferationandinvasionofgliomacelllineU87/U251

YURen-chun，HUYuan,SUNChun-ming,etal.

DepartmentofNeurosurgery,TaizhouSecondPeople’sHospital,TaiZhou225500,China

SUNChun-ming

ObjectiveTo investigate the expression of Evi1 gene in different grades of glioma tissues,and to investigate the effects of Evi1 gene on the proliferation,cell cycle and invasion of glioma cell lines U87 and U251,and to provide objective evidence for targeting oncogene treatment of glioma.MethodsFirst,real-time quantitative PCR (QRT-PCR) was used to detect the expression of Evil gene in glioma tissues and U87 and U251 cell lines.The interference of U87 and U251 cells with small interfering RNA(siRNA )was used as the interference group,and blank control group and negative control group were set up.The expression and transfection efficiencies of Evi1 gene in U87 and U251 cells were detected by QRT-PCR before and after transfection.CCK-8 assay was used to detect the proliferation of the cells in the experimental group，cell cycle analysis was performed by flow cytometry (FCM).Transwell assay and scratch test were used to detect the invasion and migration of U87 and U251 cells.And we can detect the expression of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) in U87 and U251 cells after down-regulation of Evi1 gene by QRT-PCR.ResultsEvi1 gene was highly expressed in glioma tissues,and its expression level also increased with the increase of glioma grade.The expression of Evi1 gene in grade III and IV glioma and U87 and U251 cells was significantly higher than that in non-tumor brain tissue (allP<0.05).After down-regulating the Evi1 gene by siRNA,The proliferation of glioma cell lines U87 and U251 was slowed down (allP<0.05),and the ability of invasion and migration was significantly decreased (allP<0.01),and block the cell cycle G1 phase (P<0.05).The expression of MMMP2 in interference groupU87 and U251 cells was significantly decreased (allP<0.01).ConclusionEvi1 gene was highly expressed in glioma.By interfering with the Evi1 gene,it can inhibit the U87 / U251 glioma cell line proliferation and invasion.

Evi1 gene；glioma；RNA interference；proliferation；invasion

國家自然科學基金(81372689)

225500 泰州市第二人民醫院神經外科(余仁春)；蘇州大學附屬第一醫院神經外科暨腦神經研究室(胡圓，孫春明，殷洪偉，周幽心)

孫春明

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.06.004

R739.41

A

1672-7770(2017)06-0417-06

(收稿2017-03-02 修回2017-04-27)