IGF-1R和VEGFR2蛋白在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義Δ

張靖宇，朱明珍，孫志超，吳艷，徐海燕（.連云港市第二人民醫院腫瘤化療科，江蘇連云港03；.連云港市第二人民醫院病理科，江蘇連云港 03）

IGF-1R和VEGFR2蛋白在結直腸癌組織中的表達及其臨床意義Δ

張靖宇1＊，朱明珍1，孫志超2，吳艷1，徐海燕1（1.連云港市第二人民醫院腫瘤化療科，江蘇連云港222023；2.連云港市第二人民醫院病理科，江蘇連云港 222023）

目的：觀察胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）和血管內皮細胞生長因子受體2（VEGFR2）蛋白在結直腸癌組織中的表達，并探討其臨床意義。方法：選擇2011年1月－2012年12月在我院行手術治療的結直腸癌患者98例，收集其腫瘤組織和癌旁組織，采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法檢測其IGF-1R和VEGFR2蛋白的表達水平，采用逆轉錄聚合酶鏈反應法檢測兩者mRNA的表達水平；考察IGF-1R和VEGFR2蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性，以及其對術后輔助化療患者4年無疾病生存率的影響。結果：結直腸癌患者腫瘤組織中IGF-1R和VEGFR2蛋白的陽性表達率分別為66.3%和60.2%，而癌旁組織中均未見其表達，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。腫瘤組織中IGF-1R mRNA和VEGFR2 mRNA的相對表達量均顯著高于癌旁組織，組間比較差異均有統計學意義（P＜0.05），且兩者mRNA在腫瘤組織中的表達水平呈正相關（r＝0.729，P＜0.05）。IGR-1R蛋白的表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、有無脈管癌栓形成無關（P＞0.05），而與腫瘤組織學分級、浸潤深度和有無淋巴結轉移有關（P＜0.05）；VEGFR2蛋白的表達與患者的性別、年齡無關（P＞0.05），而與腫瘤部位、組織學分級、浸潤深度、有無淋巴結轉移和脈管癌栓形成有關（P＜0.05）。98例結直腸癌患者中，14例患者術后未行化療；其余84例患者4年無疾病生存率為76.2%（64/84），其中IGF-1R蛋白陰性表達、VEGFR2蛋白陰性表達患者的4年無疾病生存率（82.8%、78.8%）均顯著高于其陽性表達者（72.7%、74.5%），差異均有統計學意義（P＜0.05）。采用多因素Logistic回歸分析對性別、年齡、組織學分級、腫瘤部位、浸潤深度、有無淋巴結轉移和脈管癌栓形成等因素進行校正后，IGF-1R和VEGFR2蛋白的表達仍與患者4年無疾病生存率相關[校正比值比（OR）分別為2.31、2.15，95%置信區間分別為（0.57，4.15）、（0.45，4.03），P＜0.05]。結論：結直腸癌患者腫瘤組織中IGF-1R和VEGFR2蛋白及mRNA的表達明顯增強，且蛋白的表達與腫瘤組織學分級、浸潤深度、有無淋巴結轉移等因素以及術后輔助化療患者的預后有關。兩者的聯合檢測可為結直腸癌患者的靶向治療提供參考。

結直腸癌；胰島素樣生長因子1受體；血管內皮細胞生長因子受體2；蛋白；mRNA；表達水平

我國結直腸癌的發病率位列所有癌癥的第4位，且隨著居民飲食習慣的改變，結直腸癌的發病人數逐年增多[1]。胰島素樣生長因子1受體（Insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）是一種位于細胞膜上的酪氨酸激酶受體，由其配體[包括胰島素樣生長因子（Insulin-like growth factor，IGF）1和2]激活，然后通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B（Phosphatidylinositol-3-kinase/Protein kinase B，PI3K/PKB）途徑和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路調控細胞的分化、增殖和凋亡[2]。近期研究顯示，IGF相關信號通路異常與結直腸癌、胃癌和胰腺癌的發生關系密切[3]。血管內皮生長因子受體2（Vascular endothelial growth factor 2，VEGFR2）是VEGF通路的主要靶點，主要表達于血管內皮細胞和腫瘤細胞表面，在腫瘤的增殖和轉移中發揮著重要的作用，且在結直腸癌細胞中呈高表達，與患者腫瘤轉移和復發相關[4]。兩個靶點的下游信號通路（PI3K/PKB通路和MAPK通路）相似，具有發揮潛在聯合抗腫瘤作用的可能[5]。本研究收集了2011年1月－2012年12月我院98例結直腸癌患者的組織標本，通過檢測其IGF-1R和VEGFR2的表達水平，分析蛋白表達與患者臨床病理特征及其預后的相關性，以期為靶向治療尋找合適人群提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2011年1月－2012年12月在我院行手術治療的結直腸癌患者98例。納入標準：（1）經病理證實為結直腸腺癌；（2）手術前未行放化療；（3）經輔助檢查證實無遠處轉移。排除標準：（1）手術前合并有糖尿病、腸梗阻、貧血等疾病者；（2）合并神經系統疾病者；（3）合并血液系統疾病者；（4）肝腎功能嚴重損傷者；（5）合并心血管疾病者；（6）卡氏功能狀態評分＜70分者。98例患者中，男性57例，女性41例；年齡46～72歲，中位年齡57歲；右半結腸癌24例，左半結腸癌38例，直腸癌36例。腫瘤分期參照美國癌癥聯合委員會/國際抗癌聯盟（American Joint Committee on Cancer/Union for International Cancer Control，AJCC/UICC）分期系統第7版標準[6]。本研究方案經醫院醫學倫理委員會審核通過，所有患者均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 材料

CX31P-OC-1型中性樹膠封片固定光鏡（日本奧林巴斯公司）；7900型實時熒光定量聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction，PCR）檢測儀（美國ABI公司）；兔抗人IGF-1R多克隆抗體一抗（批號：BA0352）、兔抗人VEGFR2單克隆抗體一抗（批號：A00809）、生物素標記二抗（批號：BS0213）均購自武漢博士德生物有限公司；磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS，pH＝7.4，批號：c0221A）、0.1%焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonare，DEPC）水（批號：R0021）、3，3′-二氨基聯苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）辣根過氧化物酶顯色試劑盒（批號：P0202）、檸檬酸鹽抗原修復液（批號：P0081）和蘇木素染色液（批號：C0107）均購自江蘇海門碧云天生物技術公司；Trizol試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：15596-026）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（美國Abnova公司，批號：H00002597-M01A）；TakaRa RNA PCR Kit Ver.3.0試劑盒（大連寶生物有限公司，批號：RR019A）；SuperReal Probe（美國Kalang公司，批號：KL087）；ROX熒光染料（美國Gene Tex公司，批號：GTX88327-PEP）；其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 IGF-1R和VEGFR2蛋白表達水平的檢測 收集98例患者的腫瘤組織，按照隨機數字表法選取40例患者的癌旁組織（距離腫瘤組織至少5 cm，經鏡檢病理證實為未被腫瘤細胞侵襲的正常結直腸黏膜組織），以PBS代替一抗作為陰性對照，采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（Streptavidin-perosidase，SP）連接法測定兩種組織中IGR-1R和VEGFR2蛋白的表達水平。具體操作過程如下：用10%中性福爾馬林固定組織標本，以石蠟常規包埋并切片，用二甲苯及乙醇梯度脫水，檸檬酸鹽抗原修復液修復抗原；滴加一抗，于4℃下孵育過夜，標本取出后于37℃烤箱中孵育1 h，用PBS沖洗3次；滴加生物素標記二抗，于37℃下孵育30 min，以DAB顯色，蘇木素復染。經乙醇梯度脫水后，于中性樹膠封片固定光鏡下觀察染色結果。同時，采用ImagePro Plus 6.0病理圖像分析軟件（美國Media Cybernetics公司）分析并計算每張切片及每個視野的光密度值。以腫瘤細胞呈黃色或棕黃色為IGF-1R陽性表達，以腫瘤細胞中出現淺黃至棕黃色顆粒為VEGFR2陽性表達，每張切片按照隨機數字法選取5個視野，每個視野計數200個細胞，采用半定量-積分法計算陽性表達率，具體評分標準參考文獻[7]，即以陽性細胞染色深度為判定標準——0分：未見染色，1分：輕度染色，2分：中度染色，3分：深度染色；以陽性細胞數比例為判定標準——0分：0～5%，1分：6%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：＞75%。將上述2項結果相乘，其中得分0～4為陰性表達，5～12為陽性表達。陽性表達率＝陽性細胞數/（陽性細胞數+未染色細胞數）×100%。

1.3.2 IGF-1R和VEGFR2 mRNA表達水平的檢測 使用實時熒光定量PCR檢測儀、采用逆轉錄聚合酶鏈反應（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）法定量檢測腫瘤組織和癌旁組織中IGF-1R和VEGFR2 mRNA的表達水平。根據Genbank數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中的基因表達序列，采用Primer Premier 5.0引物設計軟件（美國PremierBiosoft公司）設計引物。IGF-1R上游引物：5′-ACAGAGATGAGGACAACGCC-3′，下游引物：5′-TGTCTCTACTCCTGTTGCGG-3′；VEGFR2上游引物：5′-GGTACTGGTGGAGTATGATAG-3′，下游引物：5′-CCATGACCACCTCATACTACT-3′；GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′；下游引物：5′-GGGTGGAATCATATTGGAAC-3′。根據Trizol試劑盒說明書提取組織中的總RNA，并逆轉錄為cDNA。IGF-1R和VEGFR2 mRNA的PCR反應體系（20 μL）均含2×SuperReal Probe 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，反轉錄產物4 μL，50×ROX熒光染料2 μL，DEPC水2.8 μL。PCR反應條件：94℃預變性15 min；95℃變性10 s，50℃退火30 s，72 ℃延伸30s，共45個循環。采用熔解曲線評估PCR結果（熔解曲線峰形單一則表明特異性良好）。以GAPDH為內參，以正常結腸組織作為對照樣本，按2－ΔΔCt法計算目標mRNA的相對表達量，ΔΔCt＝ΔCt待測樣本－ΔCt對照樣本（其中，ΔCt＝Ct目標基因－Ct內參基因；Ct值表示每個反應管內熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環數）[8]。

1.3.3 隨訪 所有患者每3個月定期復查1次，2年后每半年復查1次，復查內容包括體格、腫瘤標志物和腸鏡檢查等，必要時行CT檢查。末次隨訪時間為2016年12月。通過我院病案書寫系統檢索患者的復發時間（若無法通過系統檢索，則電話聯系患者或其家屬），計算術后行輔助化療者的4年無疾病生存率（無疾病生存率＝未復發人數/術后行輔助化療者的總數×100%）。

1.3.4 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，兩兩比較采用SNK法。采用Spearman等級相關分析進行相關性檢驗；采用多因素Logistic回歸分析控制IGF-1R、VEGFR2蛋白表達與患者4年無疾病生存率相關性的混雜因素（性別、年齡等）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤組織與癌旁組織中IGF-1R和VEGFR2蛋白表達水平比較

腫瘤組織中IGF-1R蛋白的陽性表達率為66.3%，主要定位于腫瘤細胞細胞膜和細胞質中（見圖1A）；而癌旁組織中未見IGF-1R蛋白的表達；兩者IGF-1R陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。腫瘤組織中VEGFR2蛋白的陽性表達率為60.2%，主要定位于腫瘤細胞細胞膜和細胞質中，少數可見于基質血管內皮（見圖1B）；而癌旁組織中未見VEGFR2蛋白的表達；兩者VEFGR2陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 腫瘤組織和癌旁組織中IGF-1R和VEGFR2 mRNA表達水平比較

腫瘤組織和癌旁組織中IGF-1R mRNA的相對表達量分別為0.93±0.04和0.14±0.03，組間比較差異有統計學意義（t＝1.902，P＜0.05）；VEGFR2 mRNA的相對表達量分別為1.02±0.02和0.78±0.08，組間比較差異有統計學意義（t＝2.001，P＜0.05）。Spearman等級相關分析結果顯示，腫瘤組織中IGF-1R mRNA與VEGFR2 mRNA的表達水平呈正相關（r＝0.729，P＝0.009）。

圖1 結直腸癌組織中IGF-1R和VEGFR2蛋白的表達（×200）Fig 1 Expression of IGF-1R and VEGFR2 protein in colorectal cancer tissue（×200）

2.3 IGF-1R和VEGFR2蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性

IGF-1R蛋白的表達與患者的性別、年齡、腫瘤部位、有無脈管癌栓形成無關（P＞0.05），而與其腫瘤組織學分級、浸潤深度和有無淋巴結轉移有關（P＜0.05）。VEGFR2蛋白的表達與患者的性別、年齡無關（P＞0.05），而與其腫瘤部位、組織學分級、浸潤深度、有無淋巴結轉移和脈管癌栓形成有關（P＜0.05），詳見表1。

表1 IGF-1R和VEGFR2蛋白表達與結直腸癌患者臨床病理特征的相關性[例（%%）]Tab 1 Relationship of protein expression of IGF-1R and VEGFR2 with clinical pathological features of colorectal cancer patients[case（%%）]

2.4 結直腸癌組織IGF-1R和VEGFR2蛋白表達與患者預后的關系

隨訪發現有14例患者未行輔助化療；其余84例患者均于術后行含奧沙利鉑、氟尿嘧啶、亞葉酸鈣的方案化療，其4年無疾病生存率為76.2%（64/84）。84例患者中，IGF-1R蛋白陽性表達55例，陰性表達29例，IGF-1R蛋白陰性表達患者的4年無疾病生存率（82.8%，24/29）顯著高于陽性表達者（72.7%，40/55），差異有統計學意義（χ2＝3.504，P＜0.05）；VEGFR2蛋白陽性表達51例，陰性表達33例，VEGFR2陰性表達患者的4年無疾病生存率（78.8%，26/33）也顯著高于陽性表達者（74.5%，38/51），差異有統計學意義（χ2＝4.982，P＜0.05）。采用多因素Logistic回歸分析對性別、年齡、組織學分級、腫瘤部位、浸潤深度、有無淋巴結轉移和脈管癌栓形成等因素進行校正后，IGF-1R和VEGFR2蛋白的表達仍與患者的4年無疾病生存率相關[IGF-1R：校正比值比（OR）＝2.31，95%置信區間（CI）（0.57，4.15），P＝0.02；VEGFR2：校正OR＝2.15，95%CI（0.45，4.03），P＝0.04]。

3 討論

IGF-1R是一個由2個α亞基和2個β亞基組成的四聚體蛋白，α亞基位于胞外區域，可與IGF特異性結合；而β亞基具有一個穿膜結構，其膜內區存在酪氨酸激酶催化亞單位及磷酸化位點。IGF-1R是促癌信號通路的一個中心激活點，在與IGF1或IGF2配體結合后，IGF-1R可啟動自身磷酸化，進而激活包括MAPK信號通路在內的DNA損傷修復系統，導致腫瘤增殖加快[9]；同時還可與Bcl-2、Bax、Ku70/80等蛋白作用，調節腫瘤細胞的凋亡[10]。最近一項研究表明，IGF-1R還可通過激活信號轉導及轉錄活化因子3（Signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）調節結腸癌腫瘤干細胞的自我更新和上皮間質細胞轉化[11]。IGF-1R蛋白陽性表達與結直腸癌細胞的增殖、調亡及轉移有關。本研究結果提示，IGF-1R蛋白及mRNA在結直腸癌組織中呈高表達，且IFR-1R蛋白的表達水平與腫瘤組織學分級、浸潤深度、有淋巴結轉移以及術后輔助化療患者的預后有關，與大部分報道結果基本一致[12-14]，筆者認為可能與結直腸癌細胞中IGF-1R mRNA表達水平升高，進而提高蛋白表達水平、促進腫瘤轉移有關[15]。而Ding J等[16]的研究并未發現結直腸腺癌中IGF-1R蛋白表達與腫瘤部位及分期的相關性，可能與受試患者的選擇差異有關。

血管生成是一個包括新生血管發芽、分割和現有血管重構的復雜生理過程。VEGF/VEGFR信號通路是最被認可的促血管生成途徑之一。VEGFR2廣泛分布于糖尿病、高血壓及腫瘤等多種疾病組織中，是VEGF的主要功能受體，兩者結合后可形成二聚體，誘導酪氨酸發生自身磷酸化，激活信號級聯反應，通過增加鈣離子流、產生凝血酶等反應調節內皮細胞的功能，促進新生血管形成并保持其完整性；同時，該通路的激活還與腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉移等有關，其機制可能與激活蛋白激酶C，隨后激活Raf-1，進而活化MAPK信號通路有關[4，17-18]。本研究結果提示，VEGFR2蛋白及mRNA在結直腸癌組織中呈高表達，且VEGFR2蛋白的表達水平與腫瘤部位、組織學分級、浸潤深度、有無淋巴結轉移和脈管癌栓形成以及術后輔助化療患者的預后有關，與文獻[4]的結果基本一致。而劉躍暉等[17]報道VEGFR2的高表達與結直腸癌中浸潤深度、有無淋巴結轉移、TNM分期相關，而與腫瘤部位無關，筆者認為結論上的差異可能與本研究腫瘤部位分類更細化有關。

相關研究表明，IGF-1R可調節腫瘤血管及淋巴管的形成，阻斷IGF-1R的表達，可降低VEGF水平，并減少腫瘤細胞內血管的生成，提高抗VEGF治療的效果；此外，在缺氧導致抗VEGF治療失敗的情況下，IGF-1R的表達水平亦有所升高，提示兩者的表達可能相關[19-20]。本研究也證實了IGF-1R mRNA和VEGFR2 mRNA在結直腸癌組織中的表達呈正相關，兩者的聯合檢測可為結直腸癌患者的靶向治療提供參考。如Zhang W等[21]的研究指出結直腸癌組織標本中VEGFR2的表達可能與貝伐珠單抗的臨床獲益有關；Sclafani F等[22]報道IGF-1R mRNA可能作為IGF-1R單克隆抗體療效的預測因子；Sanderson MP等[23]的研究證明IGF-1R抑制劑（BI885578）除可選擇性抑制IGF2過表達結直腸癌腫瘤的生長外，還可增強抗VEGF治療的抗癌效果。

綜上所述，結直腸癌患者腫瘤組織中IGF-1R和VEGFR2的蛋白及mRNA的表達明顯增強，且蛋白的表達與結直腸癌的組織學分級、浸潤深度、有無淋巴結轉移等因素有關，同時還與術后行含奧沙利鉑、氟尿嘧啶、亞葉酸鈣的方案化療患者的預后相關。兩者的聯合檢測可為晚期結直腸癌患者的靶向治療提供參考。但本研究樣本量偏小，且未考察術后未行輔助化療者的預后情況，可能導致研究結果產生一定的偏倚，有待后續研究的進一步驗證。

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Expression and Clinical Significance of IGF-1R and VEGFR2 Protein in Colorectal Cancer Tissue

ZHANG Jingyu1，ZHU Mingzhen1，SUN Zhichao2，WU Yan1，XU Haiyan1（1.Dept.of Tumor Chemotherapy，Lianyungang Second People’s Hospital，Jiangsu Lianyungang 222023，China；2.Dept.of Pathology，Lianyungang Second People’s Hospital，Jiangsu Lianyungang 222023，China）

江蘇大學醫學臨床科技發展基金項目（No.JLY20140133）

＊主治醫師，博士。研究方向：胃腸道腫瘤的個體化治療。電話：0518-85775172。E-mail：zjy201510@163.com

OBJECTIVE：To observe the expression of IGF-1R and VEGFR2 in colorectal cancer tissue，and to explore its clinical significance.METHODS：Totally 98 colorectal cancer patients underwent surgery were selected from our hospital during Jan.2011-Dec.2012.The tumor tissue and paracancerous tissue were collected.The expression of IGF-1R and VEGFR2 protein were detected by immunohistochemical SP method.The mRNA expression of both were detected by RT-PCR.The correlation of the expression of IGF-1R and VEGFR2 protein with clinical pathological characteristics of colorectal cancer patients were investigated，and its effects on 4-year disease-free survival rate of postoperative assisted chemotherapy patients were also investigated.RESULTS：The positive rates of IGF-1R and VEGFR2 protein expression in colorectal cancer tissue were 66.3%and 60.2%respectively，but their expression was not found in paracancerous tissue，with statistical significance（P＜0.05）.Relative expression of IGF-1R mRNA and VEGFR2 mRNA in tumor tissue were significantly higher than paracancerous tissue，with statistical significance（P＜0.05）.There was positive correlation between their mRNA expression in tumor tissue（r＝0.729，P＜0.05）.The expression of IGR-1R protein was independent from patient’s gender and age，tumor location and formation of vascular tumor thrombus（P＞0.05）；but it was associated with the histological grading，depth of invasion and lymph node metastasis（P＜0.05）.The expression of VEGFR2 protein had nothing to do with patient’s gender and age（P＞0.05），but it was associated with tumor location，histological grading，depth of invasion，lymph node metastasis，and formation of vascular tumor thrombus（P＜0.05）.Among 98 colorectal cancer patients，14 patients didn’t underwent chemotherapy after surgery；and 4-year disease-free survival rate of other 84 patients was 76.2%（64/84）.Four-year disease-free survival rates of TGF-1R protein negative expression and VEGFR2 protein negative expression patients（82.8%，78.8%）were significantly higher than those of positive expression patients（72.7%，74.5%），with statistical significance（P＜0.05）.The multiple factor Logistic regression analysis was used to correct gender，age，histological grading，tumor location，depth of invasion，lymph node metastasis，and formation of vascular tumor thrombus；the expression of IGR-1R and VEGFR2 protein were still associated with 4-year disease-free survival rate[adjusted OR were 2.31，2.15；95%CI were（0.57，4.15），（0.45，4.03）；P＜0.05].CONCLUSIONS：The expression of IGF-1R，VEGFR2 protein and mRNAs increase significantly in colorectal cancer tissue；the protein expression is associated with histological grading，depth of invasion，lymph node metastasis and the prognosis of postoperative assisted chemotherapy patients.Their examination can provide reference for target therapy for colorectal cancer patients.

Colorectal cancer；IGF-1R；VEGFR2；Protein；mRNA；Expression

R735.3+5；R735.3+7

A

1001-0408（2017）35-4901-06

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.35.02

2017-01-24

2017-09-05）

（編輯：張元媛）