側蒿揮發油化學成分及抗氧化、抑菌活性研究

張 彬， 鄧櫻花， 蘇明偉， 張洪權

(湖北第二師范學院 化學與生命科學學院 植物抗癌活性物質提純與應用湖北省重點實驗室， 武漢 430205)

側蒿揮發油化學成分及抗氧化、抑菌活性研究

張 彬*， 鄧櫻花， 蘇明偉， 張洪權

(湖北第二師范學院 化學與生命科學學院 植物抗癌活性物質提純與應用湖北省重點實驗室， 武漢 430205)

采用同時蒸餾萃取法(SDE)提取側蒿全草揮發油，通過氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術鑒定其中化學成分，采用峰面積歸一化法確定各組分的相對百分含量，并對揮發油體外抗氧化活性和抑菌活性進行測試.采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法測定側蒿揮發油體外抗氧化活性，以及其對5種供試菌的抑菌活性.結果表明：側蒿揮發油共鑒定出37種化學成分，占總含量的76.93%，其中主要成分為石竹烯及其氧化物、桉樹腦、樟腦、龍腦、萜品烯-4-醇、大根香葉烯D等.側蒿揮發油對DPPH具有一定的清除能力，但清除效果弱于維生素C(Vc)；側蒿揮發油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉有較好的抑菌效果，最小抑菌濃度(MIC)分別為0.25 mg/mL、8.0 mg/mL、2.0 mg/mL.

側蒿； 揮發油； 氣相色譜-質譜； 抗氧化活性； 抑菌活性

蒿屬，菊科一、二年生或多年生草本植物，全球約380種，廣泛分布于北半球的溫帶地區，在我國有180余種[1]，全國均有分布.蒿屬為我國傳統的中藥材，如艾蒿有散寒除濕、溫經止血、安胎的功效，常用于功能性子宮出血、痛經、月經不調、先兆流產、濕疹等癥；黃花蒿有清熱涼血、退虛熱、解暑、截疾的功效，常用于痢疾、傷暑潮熱等癥；茵陳蒿和濱蒿等則具清熱利濕、利膽退黃、降血壓等功效，臨床上常用于黃疸型肝炎、膽囊炎和小便不利等；而牡蒿全草入藥，具清熱涼血解暑等功效，常用于感冒發熱、中暑、肺結核潮熱等[2].蒿屬植物常有濃烈的揮發性香氣，揮發油含量較高，其揮發油多具有抗菌消炎、平喘祛痰、驅寒止痛、通經活絡、清熱解毒等作用[3]，具有一定的臨床藥用價值，并在食品、香料及化妝品等領域也有廣泛的應用價值.

側蒿(ArtemisiadeversaDiels)，蒿屬白苞蒿組，多年生草本植物，產于陜西南部、甘肅東南部、湖北西部及四川東北部等，生于海拔1 000～2 300 m地區林下、林緣、山谷、坡地及河邊等[4].目前，國內外均未見側蒿的相關研究報道，本文實驗所用側蒿采自湖北大別山主峰，首次對側蒿揮發油進行化學成分鑒定及相對含量分析，并研究其抗氧化能力和抑菌能力，本研究擬為蒿屬植物的深層次開發利用，以及湖北大別山地區植物的深入研究提供一定的實驗依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 側蒿樣品 全株于2016年8月盛花期采于湖北省大別山主峰，海拔1 700 m坡地，由湖北第二師范學院化學與生命科學學院植物組教授戴月老師鑒定為側蒿(ArtemisiadeversaDiels)新鮮全株.陰干、粉碎后備用.

1.1.2 實驗試劑 正構烷烴C7～C30標準品，美國Sigma公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，上海阿拉丁試劑公司；其他所用試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；水為超純水.

1.1.3 實驗儀器 Agilent7890A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司)；Agilent7890A氣相色譜儀(美國Agilent公司)；酶標儀(美國Molecular Devices公司)；旋轉蒸發儀(瑞士BUCHI公司)；同時蒸餾萃取儀(上海玻璃儀器廠)；電子天平(德國塞多利斯科學儀器)；高速多功能粉碎機(南京東邁科技有限公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 側蒿揮發油的提取 電子天平稱取200 g側蒿粉末，置于5 L圓底燒瓶中，加入2.5 L超純水，浸泡8 h.量取150 mL二氯甲烷，加入500 mL圓底燒瓶中，用蒸餾萃取儀萃取8 h.分出二氯甲烷層，加入無水硫酸鈉，放置冰箱-20℃干燥過夜.過濾，旋轉蒸發儀減壓濃縮除去二氯甲烷，得側蒿揮發油，密封，冰箱-20℃冷藏保存.

1.2.2 側蒿揮發油的GC-MS分析 色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5MS石英毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，初始溫度60℃，保持3 min，以4℃/min升溫至230℃并保持3 min.分流比30∶1，進樣量1 μL.

質譜條件：離子源為FID；離子源溫度：30℃；接口溫度：150℃；電子能量：69.922 eV；電子倍增電壓：2 164.7 V；溶劑延遲：3 min；掃描范圍：30～500 amu；載氣：He；定性分析：NIST11.L譜庫檢索；相對含量確定：峰面積歸一化法.通過NIST質譜譜庫數據及各組分保留指數與文獻值對比，確定成分.

保留指數(rentention index，RI)的測定[5]：C7～C30正構烷烴標準品，在上述相同條件下進行GC-MS分析，測定其保留時間，根據線性公式計算出揮發油各組分的保留指數RI：RI=100n+100[tR(x)-tR(n)]/[tR(n+1)-tR(n)]，tR(x)為被分析的組分的保留時間，tR(n)和tR(n+1)分別為有n個和n+1個碳原子的正構烷烴的保留時間，且tR(n)

1.2.3 側蒿揮發油1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)抗氧化活性測定 DPPH抗氧化活性測試根據Wang等[6]的方法，稍作調整.分別配制0.1 mM DPPH的甲醇溶液、10 mg/mL的VC和10 mg/mL揮發油的甲醇溶液，96孔板中加樣，甲醇做空白對照，37℃避光孵化半個小時后，用酶標儀在517 nm波長測定其吸光度，運用如下公式計算樣品對DPPH自由基的清除能力：

清除率I%=[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%，

Asample為不同濃度的揮發油加DPPH后的吸光度，Ablank為不同濃度的揮發油不加DPPH的吸光度，Acontrol為不加揮發油的DPPH溶液的吸光度.

1.2.4 側蒿揮發油的抑菌活性測定 菌懸液的配制[7]：供試菌用LB平板放置于37 ℃的培養箱中活化培養24 h后，挑取單菌落，于37 ℃在LB液體培養基中搖培24 h，將菌液濃度稀釋到108cfu/mL備用.

側蒿揮發油溶液的配制：以DMSO為溶劑，稀釋法配制8個質量濃度梯度的側蒿揮發油溶液，分別為32.0 mg/mL、16.0 mg/mL、8.0 mg/mL、4.0 mg/mL、2.0 mg/mL、1.0 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL.

最低抑菌濃度(MIC)的測定：在超凈工作臺上，將滅菌的LB培養基倒入9 cm平板中，待培養基凝固后，加入50 μL 懸菌液，均勻涂布.待LB培養基凝固后打孔(孔徑8 mm)，LB培養基封底，孔中加入50 μL揮發油溶液，移入培養箱，37℃下黑暗中培養24 h，觀察供試菌生長情況，以無菌落生長的最低濃度為最低抑菌濃度MIC.以DMSO為空白對照、氨芐青霉素(AMP，最高濃度0.32 mg/mL)作陽性對照，每個菌種平行測定三次，最低抑菌濃度取平均值.

2 結果與分析

2.1 側蒿揮發油化學成分分析

側蒿揮發油總離子流圖見圖1.側蒿揮發油組成成分及相對含量見表1.由表1可知，側蒿揮發油中共鑒定37種成分，占揮發油總量的76.93%，其中主要成分為：石竹烯氧化物(13.72%)，桉樹腦(12.2%)，樟腦(11.17%)，石竹烯(6.55%)，龍腦(3.12%)，萜品烯-4-醇(2.14%)，大根香葉烯D(2.14%)等.

2.2 側蒿揮發油DPPH法抗氧化活性

DPPH法中，隨著側蒿揮發油濃度的增加，對DPPH自由基清除能力逐漸增強，其與Vc的DPPH自由基清除能力見圖2和圖3.由圖可知，側蒿揮發油對DPPH自由基具有一定的清除能力，對DPPH自由基清除率達到50%時，揮發油濃度為1 mg/mL，Vc的半抑制濃度(IC50)為2.5 μg/mL，側蒿揮發油對DPPH自由基的清除能力明顯低于Vc，可見側蒿揮發油對DPPH的抗氧化活性較弱.

2.3 側蒿揮發油的抑菌活性

通過對5種供試菌的抑菌活性測試，表明側蒿揮發油對大腸桿菌、金色葡萄球菌、黑曲霉有一定的抑菌作用，對枯草芽孢桿菌和蠟狀芽孢桿菌沒有明顯的抑制作用.抑菌實驗結果見表2，側蒿揮發油對大腸桿菌的抑菌效果較好，最低抑菌濃度(MIC)為0.25 mg/mL，對黑曲霉、金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用，MIC分別為2.0 mg/mL 和8.0 mg/mL.側蒿揮發油與AMP的最低抑菌濃度相比較，可以更直觀的體現側蒿揮發油的抑菌作用.

圖1 同時蒸餾萃取法提取側蒿揮發油總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of volatile oil from Artemisia deversa Diels by SDE

No．percentagecontent/%CompoundnameFormulaMatchingdegree/%RIRIExpRIRef1034α?蒎烯(α?Pinene)C10H16979349312101莰烯(Camphene)C10H16979469453025β?蒎烯(β?Pinene)C10H169797497441551?辛烯?3?醇(1?Octen?3?ol)C8H16O9098198150562，3?脫氫?1，8?桉樹腦(2，3?Dehydro?1，8?cineole)C10H16O909909906045α?萜品烯(α?Terpinene)C10H1695101610167031甲基異丙基苯(Cymene)C10H1497102510258122桉樹腦(Eucalyptol)C10H18O98103010309043γ?萜品烯(γ?Terpinene)C10H11951058105810056順式?氧化芳樟醇(cis?LinaloolOxide)C10H18O2591087108911072芳樟醇(Linalool)C10H18O9711021102121117樟腦(+)?2?BornanoneC10H16O971144114413312龍腦(endo?Borneol)C10H18O971166116614214萜品烯?4?醇(Terpinen?4?ol)C10H18O9311771177

續表1

注：RIExp為在HP-5MS 色譜柱上測定出來的相對于正構烷烴(C7～C30)的保留指數；RIRef為各化合物保留指數的文獻值.

圖2 側蒿揮發油對 DPPH自由基的清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of volatile oil from Artemisia deversa Diels

圖3 Vc對 DPPH自由基的清除能力Fig.3 DPPH radical scavenging activity of Vc

表2 側蒿揮發油對5種供試菌的MIC測定結果

3 討論

通過GC-MS技術對大別山地區所產側蒿的揮發油的化學成分進行鑒定分析，揮發油中絕大多數成分為萜烯類化合物及其含氧衍生物(72.39%)，與其他蒿屬植物如青蒿[8]、艾蒿[9]、白蓮蒿[10]等相比，與青蒿揮發油化學成分差異較大，僅有石竹烯、石竹烯氧化物、依蘭烯、樟腦、桉樹腦等5種化合物相同，且含量相差也較大.與白蓮蒿、艾蒿揮發油化學成分類似，與白蓮蒿化學成分相同的有：桉樹腦、α-蒎烯、β-蒎烯、莰烯、α-松油醇、萜品烯-4-醇、乙酸龍腦酯、樟腦等8種化合物，其中桉樹腦、樟腦含量均較高.與艾蒿化學成分相同的有：α-蒎烯、α-松油醇、石竹烯、石竹烯氧化物、桉樹腦、樟腦、龍腦、大根香葉烯D、芳樟醇、斯巴醇、葉綠醇等11種化合物，其中石竹烯、石竹烯氧化物、桉樹腦、樟腦、龍腦、大根香葉烯D等主要化學成分基本相同，含量接近.另外，側蒿揮發油中其他成分如γ-萜品烯、β-金合歡烯、蛇麻烯、橙花叔醇等，也常出現在其他蒿屬植物揮發油中.

側蒿揮發油主要成分為石竹烯及其氧化物(20.27%)，桉樹腦(12.2%)，樟腦(11.17%)，龍腦(3.12%)，萜品烯-4-醇(2.14%)，大根香葉烯D(2.14%).據文獻報道，石竹烯及其氧化物、樟腦、龍腦、萜品烯-4-醇、均對細菌的細胞膜有破壞作用[11-15]，因此這些成分可能與側蒿揮發油的抑菌活性有關.側蒿揮發油中含有大量的萜烯、萜醇類成分，萜烯、萜醇類成分具有抗氧化功能，可能是其抗氧化活性的內在原因.側蒿揮發油的研究，表明其具有一定的藥學研究價值和作為食品天然抗氧化劑和抗菌劑的潛能，同時也為大別山地區植物生態的研究提供依據.

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Chemicalcompositionandantioxidant，antibacterialactivityof
volatileoilfromArtemisiadeversaDiels

ZHANG Bin， DENG Yinghua， SU Mingwei， ZHANG Hongquan

(College of Chemistry and Life Science， Hubei University of Education， Hubei Key Laboratory of Purification and Application of Plant Anti-Cancer Active Ingredients， Wuhan 430205， China)

The chemical composition， antimicrobial and antioxidant activities of the volatile oil ofArtemisiadeversaDiels were investigated. The composition of the volatile oil extracted by simultaneous distillation extraction (SDE) method， was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)， and a total of 37 components representing 76.93% in this plant were identified. The main constituents were Caryophyllene oxide (13.72%)， Eucalyptol (12.2%)， 2-Bornanone (11.17%)， Caryophyllene (6.55%)， endo-Borneol (3.12%)， Terpinen-4-ol (2.14%) and Germacrene D (2.14%). The antioxidant activity of the oil was evaluated by 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) method. The result showed that the oil revealed a certain scavenging effect on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical， and the inhibition increased with concentration of the oil increase. The antimicrobial activities of the oil were separately evaluated against five micro-organisms，Bacillussubtilis，Escherichiacoli，Staphylococcusaureus，BacilluscereusandAspergillusniger. The oil possessed inhibitory activity againstEscherichiacoli，StaphylococcusaureusandAspergillusnigerwith MIC of 0.25 mg/mL， 8.0 mg/mL and 2.0 mg/mL．

ArtemisiadeversaDiels; volatile oil; gas chromatography-mass spectrometry; antioxidant activity; antimicrobial activity

2017-07-20.

湖北省高等學校優秀中青年科技創新團隊計劃(T201718)；湖北省教育廳科學技術研究項目(B2016219)； 植物抗癌活性物質提純與應用湖北省重點實驗室開放課題( HLPAI2014004).

*通訊聯系人. E-mail: jaina96@163.com.

10.19603/j.cnki.1000-1190.2017.06.009

1000-1190(2017)06-0777-05

R284.2

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