端粒鋅指相關蛋白在乳腺癌中的表達及其臨床病理意義

傅椰，何瀟

（1.南華大學附屬第一醫院 普通外科，湖南 衡陽 421001；2.湖南省腫瘤醫院 乳腺外科，湖南 長沙 410006）

端粒鋅指相關蛋白在乳腺癌中的表達及其臨床病理意義

傅椰1，何瀟2

（1.南華大學附屬第一醫院 普通外科，湖南 衡陽 421001；2.湖南省腫瘤醫院 乳腺外科，湖南 長沙 410006）

目的端粒鋅指相關蛋白（ZBTB48）在乳腺癌中的表達及其臨床病理意義。方法選取2014年1月-2015年12月90例在湖南省腫瘤醫院接受手術切除的乳腺癌標本及配對正常組織，實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測ZBTB48的信使核糖核酸（mRNA）表達水平，免疫組織化學檢測ZBTB48、Ki-67的蛋白表達水平，分析ZBTB48的表達水平與臨床病理因素的相關性；利用網絡公共數據庫，分析ZBTB48的表達水平與患者預后的關系。結果ZBTB48 mRNA的表達水平在癌組織中比正常組織中低，差異有統計學意義（P=0.029）；ZBTB48蛋白的表達水平在癌組織中比正常組織低，差異有統計學意義（P=0.000）；ZBTB48蛋白的表達水平與Ki-67蛋白的表達水平呈負相關（P=0.0005）；ZBTB48的mRNA表達水平與年齡、腫瘤大小、分化程度及TNM分期相關；ZBTB48的表達水平低則乳腺癌患者的預后差。結論ZBTB48低表達與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、分化程度及TNM分期有關，是乳腺癌患者預后差的危險因素。

端粒鋅指相關蛋白；端粒；乳腺癌；臨床病理；預后

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1]，故研究調節乳腺癌發生發展相關的基因可為疾病的精準治療尋找新靶點。端粒是真核生物染色體末端的特殊結構，其長度受多種分子的調節，當端粒長度保持相對穩定時，細胞則獲得永生化，進一步可發生癌變[2]。端粒鋅指相關蛋白（zinc finger and BTB domain 48，ZBTB48）作為新近發現的端粒修剪分子，其在乳腺癌中表達水平及病理意義尚不清楚。本研究擬通過檢測乳腺癌標本中ZBTB48的表達水平，并利用疾病大數據庫挖掘ZBTB48表達水平與乳腺癌預后的相關性，以明確ZBTB48在乳腺癌發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 資料與試劑

1.1.1 病例資料選取2014年1月-2015年12月湖南省腫瘤醫院經手術切除后病理診斷明確的的乳腺癌病例90例，按照美國癌癥聯合會（第7版）TNM分期進行分期，所有病理切片均由≥2位副主任病理醫師根據世界衛生組織乳腺腫瘤病理學和遺傳學分類標準復閱。所有收集并用于檢測的人體組織標本，均經過醫院倫理委員會同意和批準。

1.1.2 試劑實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）引物，ZBTB48正向引物：5'-GGCCTGGTGTTTAAGGCACA-3'，反向引 物 ：5'-CTGAGCCATCCCCGTAGAG-3'；β-actin正向引物：5'-GCACCACACCTTCTACAATGAGC-3'，反向引物：5'-GGATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3'。real-timePCR主要試劑（購自日本TaKaRa公司），小鼠多克隆抗體ZBTB48（購自美國Abcam公司），工作濃度為1∶200；兔多克隆抗體Ki-67（購自美國Abcam公司），工作濃度為1∶300。SP通用型試劑盒（購自福建省福州邁新生物技術開發有限公司）。

1.2 儀器與設備

7500-PCR儀器（購自美國ABI公司），石蠟切片機（購自德Leica公司），全自動免疫組織化學機（購自瑞士Roche公司），電子天平（購自北京愛尚陽光科技有限公司），光學顯微鏡及切片機（購自德國Leica公司），低溫高速臺式離心機及微量移液槍（購自德國Eppendorf公司），微波爐（購自廣東省佛山Galanz集團有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 real-time PCR所有器皿去酶處理，采用染料法（SYBR Green I）試劑盒說明書，依次進行RNA抽提、RNA電泳檢測、逆轉錄及定量PCR實驗。PCR體系為：DNA 2 μl，qPCR mix 10 μl，正向引物0.6 μl，反向引物 0.6 μl，內參（Reference Dye,ROX）0.3 μl，焦碳酸二乙酯水6.5 μl。PCR反應條件為：95℃變性 30 s，95℃退火 5 s，60℃延伸 35 min，共 30個循環。PCR結果分析：每個樣本平行3次重復實驗次，分別計算出目的基因和內參基因β-actin的平均Ct值。負ΔΔCt為對照組樣本ΔCt的平均值與各樣ΔCt值之間的差，相對表達量則由公式2-ΔΔCt計算出來的數值來表示。

1.3.2 免疫組織化學（免疫組化）及結果判定所有組織標本經中性甲醛固定，常規脫水、透明、包埋；石蠟塊切成4 μm白片，展片、貼片及烤片，蘇木精-伊紅染色法常規染色（hematoxylin-eosin staining，HE）。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結（streptavidin-perosidase，SP）二步法，均設陰性對照和陽性對照。雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、ZBTB48及 Ki67陽性均為胞核著色。陽性細胞≤5%定義為陰性（-）；陽性細胞數在6%～25%者定義為弱陽性（+）；26%～50%定義為陽性（++）；＞50%定義為強陽性（+++）。本研究定義陽性強度在（+）以上者為陽性表達。

1.3.3 原癌基因人類表皮生長因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）的原位雜交所有石蠟切片行二甲苯脫蠟，水洗；3%H2O2室溫作用10 min，水洗2次；暴露mRNA核酸片段：3%檸檬酸1 ml+2滴胃蛋白酶濃縮液，混勻，37℃消化10～25 min；洗 3次×5 min，水洗 1次；預雜交：濕盒底部加20%甘油保濕，每個蠟塊20 μl預雜交液,置溫箱38℃ 4 h；雜交：每個蠟塊20 μl雜交液，將原位雜交專用蓋玻片蓋在切片上，置溫箱42℃過夜；滴加封閉液，37℃ 30 min，甩去多余液體，不洗；滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 60 min；滴加生物素化過氧化酶37℃ 20 min；洗5 min×4次；顯色：二氨基聯苯胺顯色試劑盒中1.7 ml水加A、B、C各4滴滴加至切片上，顯色20～30 min；蘇木精淡染，水洗；酒精脫水，二甲苯透明，封片。

1.3.4 分析ZBTB48對乳腺癌預后的影響利用癌癥基因圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）中大數據信息，分析ZBTB48表達水平對乳腺癌患者預后的影響。登錄http：//kmplot.com/analysis/網站，分析ZBTB48 mRNA表達水平對乳腺癌（n=1 402）總生存（overall survival，OS）的影響[3]；分析乳腺癌不同分子分型、ER、PR、HER2表達情況下ZBTB48 mRNA表達水平對乳腺癌預后OS的影響。2013年St.Gallen會議專家共識根據免疫組織化學指標對Luminal B型乳腺癌進行重新定義。HER-2陰性：ER陽性和HER-2陰性，且至少符合以下1項，①Ki-67高表達；②PR陰性或低表達；③多基因表達分析示高復發風險；HER-2陽性：ER陽性，HER-2過表達或擴增，Ki-67和PR任何水平。

1.4 統計學方法

數據分析采用Prism 6統計軟件，ZBTB48 mRNA及蛋白表達量與臨床病例特征之間的關系用Student’s-t檢驗和chisquare檢驗；正常組織與乳腺癌組織mRNA表達差異用paired-t檢驗；多組分析用Student’st檢驗或單因素方差統計分析；用Spearman檢驗分析ZBTB48與Ki-67蛋白間表達水平的相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

患者年齡32～82歲，平均60歲；未絕經49例，已絕經41例；腫瘤直徑0.5～6.5 cm，平均2.4 cm；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期56例，Ⅲ、Ⅳ期34例；高分化52例，中低分化38例；ER陽性率55.0%（44/90），PR 陽性率 56.7%（51/90），HER-2 陽性率 46.3%（37/90）。

2.2 ZBTB48 mRNA表達水平

在癌組織中的表達水平為（2.95±1.08），在正常乳腺組織的表達水平為（3.28±1.04），組間表達水平差異有統計學意義（P=0.0289）；ZBTB48 mRNA在不同年齡、腫瘤大小、分化程度及TNM分期中差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1和圖1。

2.3 ZBTB48及Ki-67蛋白的表達水平

ZBTB48及Ki-67蛋白陽性表達主要位于細胞核內（見圖1），ZBTB48蛋白在癌組織及正常組織表達的陽性率分別為 28.9%（26/90）和 63.3%（57/90）；Ki-67蛋白在癌組織中的陽性為69.8%（62/90）；ZBTB48與Ki-67蛋白在乳腺癌組織中的表達呈負相關。見表2。

表1 ZBTB48 mRNA表達水平與臨床病理特征的關系（n=90）

圖1 ZBTB48及Ki-67蛋白陽性表達 （×400）

表2 ZBTB48與Ki-67蛋白在乳腺癌組織中的表達 例

2.4 ZBTB48 mRNA表達水平與乳腺癌預后關系

利用乳腺癌大數據庫的病例資料，結果顯示，ZBTB48 mRNA表達水平升高可延長乳腺癌的OS；亞組分析顯示ZBTB48 mRNA表達水平對Luminal B型乳腺癌的OS有影響。見表3和圖2、3。

表3 ZBTB48 mRNA表達水平與乳腺癌預后（OS）的關系

圖2 ZBTB48 mRNA表達水平對乳腺癌患者OS的影響

圖3 ZBTB48 mRNA表達水平對Luminal B乳腺癌患者OS的影響

3 討論

端粒是真核生物染色體末端帽子樣的結構，其主要功能是維持染色體穩定性和完整性。正常情況下，端粒會隨細胞的分裂而逐漸縮短，最終被誘導凋亡；在惡性腫瘤的發生過程中，端粒受調節得以延長，并導致細胞脫離正常復制性衰老及凋亡的程序，最終形成永生化的腫瘤細胞。因此，調節端粒長度的分子在腫瘤的發生、發展起重要作用[4]。研究證明，端粒的長度主要受端粒酶和一種被稱作Shelterin的蛋白復合體調節，尚未發現特異性結合到端粒上的蛋白對端粒的長度進行調節[5]。新近研究發現，ZBTB48，又名TZAP，作為一種端粒結合蛋白，與端粒結合因子TRF1及TRF2競爭結合位點，傾向結合于含低密度Shelterin蛋白復合體的長端粒末端，對端粒長度進行修剪，進而影響細胞的衰老、凋亡及永生化癌變過程[6]。鑒于ZBTB48的特殊功能，有研究證明其作為腫瘤抑制因子參與神經母細胞瘤的發生[7]。

本結果顯示，ZBTB48的表達水平在癌組織中低于正常組織，提示ZBTB48作為抑瘤因子，與乳腺癌關系密切。且ZBTB48在＜65歲、腫瘤直徑大、分化差及TNM分期晚的患者中表達水平低；筆者推斷ZBTB48的高表達水平作為端粒長度的負性調節因子，與患者的年齡密切相關，這也與其他端粒長度的負性調節因子在乳腺癌中的表達趨勢基本一致[8-9]；同時，ZBTB48作為抑瘤因子，與腫瘤大小、分化程度及病理分期相關，筆者認為ZBTB48可通過調節端粒長度而抑制腫瘤分化，促進腫瘤生長及進展。

Ki67是細胞增殖特異相關的核抗原，目前作為一個可靠而全面的反映腫瘤細胞群體增殖活性的指標[10]。研究已經證明，Ki67在乳腺癌中的表達水平高于正常乳腺組織，筆者的結果也與此基本一致[11]。同時，ZBTB48與Ki67的蛋白表達水平在乳腺癌組織中呈負相關，提示ZBTB48的低表達水平協同Ki67促進乳腺癌的發生、發展。最后，本文利用TCGA大數據庫資料[12]，分析ZBTB48 mRNA表達水平對乳腺癌預后的影響，發現ZBTB48 mRNA表達水平越高，患者的OS越長，亞組分析顯示ZBTB48的表達水平對PR陽性及Luminal B型乳腺癌的OS有影響，該結果提示ZBTB48可作為判斷乳腺癌患者預后的分子標志物。

本研究通過分析端粒修剪蛋白ZBTB48在乳腺癌中的表達及其臨床病理意義，發現ZBTB48不僅在癌組織及正常組織的表達水平有差異，而且與乳腺癌患者的臨床病理因素及預后相關。故ZBTB48作為乳腺癌的抑瘤因子，在判斷惡性程度、預測復發轉移及判斷預后中均有重要意義。同時，課題尚需在體內外實驗中進一步證明ZBTB48對乳腺癌發生進展的影響，以最終實現以ZBTB48為靶點的精準治療。

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Expression of telomeric protein ZBTB48 in breast cancer and clinical significance

Ye Fu1,Xiao He2
(1.Department of General Surgery,the First Affiliated Hospital of South China University,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Breast Surgery,Hunan Cancer Hospital,Changsha,Hunan 410006,China)

ObjectiveTo investigate the expression of telomeric zinc finger-associated protein(ZBTB48)in breast cancer and its clinical significance.MethodsA total of 90 cases of patients diagnosed with breast cancer were included in this study.Cancer tissue as well as paracancerous normal tissue was collected for further analysis.RT-PCR and Immunohistochemistry were utilized to measure expression levels of ZBTB48 and Ki-67.Correlation between ZBTB48 expression in cancer tissue and patients'clinical manifestation was analyzed under network public database.ResultsRT-PCR and Immunohistochemistry data suggested that expression levels of ZBTB48 in cancer tissue were significantly decreased compared with normal tissue (P1=0.0289;P2=0.000).The expression level of Ki-67 protein was negatively correlated with ZBTB48 (P=0.0005).Concentration of ZBTB48 was closely correlated with age,size as well as differentiation of tumor and TNM stage.Overall data indicated that patients with low expression of ZBTB48 were more likely to experience pooroutcome.ConclusionsZBTB48 in breastcancertissue isclosely associated with age,size and differentiation of tumor,and TNM stage of breast cancer;low expression of ZBTB48 is a risk factor of breast cancer.

zinc finger and BTB domain 48;telomere;breast cancer;clinicopathological factor;prognosis

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.008

1005-8982（2017）30-0046-05

2017-04-21

何瀟，Tel：18674830210；E-mail：doctorhexiao@163.com

（王榮兵 編輯）