口腔黏膜白斑和口腔鱗癌中Bcl-2、CDK2AP1的基因表達和臨床意義

張國富，高建明

（1.湖北三峽職業技術學院附屬醫院 口腔科，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學醫學院生理與病理生理學系，湖北 宜昌 443002）

口腔黏膜白斑和口腔鱗癌中Bcl-2、CDK2AP1的基因表達和臨床意義

張國富1，高建明2

（1.湖北三峽職業技術學院附屬醫院 口腔科，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學醫學院生理與病理生理學系，湖北 宜昌 443002）

目的研究在口腔黏膜白斑和口腔鱗癌組織中Bcl-2和CDK2AP1的表達情況及臨床意義。方法運用免疫組織化學和實時熒光定量PCR技術對組織中Bcl-2、CDK2AP1表達進行檢測。結果在口腔正常黏膜組織、口腔黏膜白斑組織和口腔鱗癌組織中Bcl-2蛋白細胞陽性率依次為（2.72±1.45）%、（19.29±8.18）%和（57.20±19.37）%；CDK2AP1蛋白細胞陽性率依次為（62.68±11.07）%、（25.68±8.17）%和（7.87±2.18）%。Bcl-2和CDK2AP1 mRNA表達水平與蛋白表達水平一致。各組之間差異有統計學意義（P＜0.05）。結論隨著口腔病變惡性程度增高，在口腔正常黏膜、口腔黏膜白斑和口腔鱗癌中Bcl-2表達水平上升，而CDK2AP1表達水平降低，這2個指標可能與口腔腫瘤的發生、發展及預后有關。

Bcl-2；CDK2AP1；口腔黏膜白斑；口腔鱗癌

近年來，隨著生活的環境、習慣及飲食等結構的變化，口腔癌前病變及口腔鱗癌呈現年輕化的趨勢，發病率有明顯的上升?？谇火つぐ装呤亲畛Ｒ姷目谇唤腔惓?，往往伴有上皮異常增生，屬于癌前病變，研究表明，4%～6%[1]的口腔黏膜白斑惡變為口腔鱗狀細胞癌。口腔鱗癌是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的2%～4%，其5年生存率僅30%～40%[2-3]，嚴重威脅人們的生活和健康?？谇活M面部腫瘤病因復雜，涉及多種癌基因和抗癌基因的功能改變和相互作用以及環境和飲食習慣，本研究通過對口腔黏膜白斑惡變為口腔鱗狀細胞癌中B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）和細胞周期蛋白依賴激酶2-相關蛋白1(cyclin-dependent kinase 2 associated protein 1，CDK2AP1）表達的檢測，觀察其在口腔白斑癌變過程中的變化，可為口腔鱗癌的早期診斷、治療以及預后提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料選取2015年3～10月于湖北三峽職業技術學院附屬醫院口腔科收治的患者，口腔正常黏膜組織12例；口腔黏膜白斑11例，口腔鱗癌8例，標本來自宜昌市中心醫院和一醫院口腔科。所有患者均有完整的隨訪資料，術后均由病理科確診。

1.1.2 主要試劑鼠抗人抗體Bcl-2和鼠抗人抗體CDK2AP1（購自上海博英生物有限公司），二步法檢測試劑盒、即用型SABC試劑盒和酶底物DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術有限公司提供），Oligod T（購自上海生工生物有限公司），逆轉錄酶Revert AidTMM-MuLV（購自美國Fermentas公司），SYBR Premix Ex TaqTM（購自TaKaRa公司），Bcl-2、CDK2AP1和β-actin基因的引物（由上海鉑尚生物合成）。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學（免疫組化）結果分析Bcl-2蛋白主要表達在細胞漿內，棕黃色顆粒；CDK2AP1蛋白主要表達在細胞漿內，呈棕黃色顆粒。在高倍鏡下進行結果評估方法參照CAMPO等[4]標準綜合計分?；静恢珵?分，著色弱為1分，著色中度的為2分，著色強的為3分；陽性細胞數所占比例為4個等級：0～5%為 0分，6%～25%為 1分，25%～50%為2分，50%～為3分。最后以陽性細胞的百分比和染色強度計分之和所得的總分進行結果判定：0分為陰性（-）；1、2分為弱陽性（+）；3、4分為中等陽性（++）；5分或6分以上為強陽性（+++）。

附表 Bcl-2 mRNA、CDK2AP1 mRNA的引物序列

1.2.2 實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA后，用Taq Man U-niversal PCR Master Mix和Taq Man microRNA AssayKit檢測樣本中 Bcl-2 mRNA、CDK2AP1 mRNA含量。采用的特異性引物序列為見附表。

反應條件為95℃ 5 min變性；95℃ 30 s，60℃40 s，40個循環，反應結束后得到各個標本和內參β-actin的基本循環數（Ct值）。根據公式計算目的基因相對含量：2-△△Ct，即 Bcl-2 mRNA、CDK2AP1 mRNA的相對含量，實驗重復3次。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 18.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較做秩和檢驗（H檢驗），P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Bcl-2蛋白表達情況

Bcl-2蛋白在人正?？谇火つそM織中陽性細胞分散在上皮基底層；在口腔黏膜白斑組織中隨著上皮異常增生程度的增加，其陽性細胞也呈進一步的增加，分布范圍從上皮基底層向表層擴散，甚至可達上皮全層；在口腔鱗癌組織中，Bcl-2蛋白分布于浸潤性鱗癌的癌性團塊、條索和浸潤癌細胞之中。見圖1。

在人正?？谇火つど掀ぜ毎蠦cl-2蛋白微量或少部分陽性表達，其平均陽性率為（2.72±1.45）%，在口腔白斑上皮細胞平均陽性率為（19.29±8.18）%。而在口腔鱗癌細胞組織中Bcl-2蛋白大部分組織呈陽性表達，細胞平均陽性率為（57.20±19.37）%。3組Bcl-2蛋白表達差異有統計學意義（H=23.504，P=0.000），且經兩兩比較，任意兩組間Bc1-2蛋白細胞陽性率差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 Bcl-2蛋白在不同組織中的表達

2.2 CDK2AP1蛋白表達情況

CDK2AP1蛋白在人正常口腔黏膜組織中陽性細胞分散在上皮基底層，在口腔黏膜白斑組織中隨著上皮異常增生程度的增加而減少，在口腔鱗癌組織中，CDK2AP1蛋白分布于浸潤性鱗癌的癌性團塊、條索和浸潤癌細胞之中，癌組織中癌巢周圍的陽性表達強于癌巢中央，陽性細胞數進一步減少。見圖2。

圖2 CDK2AP1蛋白在不同組織中的表達

在人正?？谇火つど掀ぶ蠧DK2AP1蛋白大部分組織呈陽性表達，其細胞平均陽性率為（62.68±11.07）%，在口腔白斑上皮細胞平均陽性率為（25.68±8.17）%。而在口腔鱗癌細胞組織中CDK2AP1蛋白微量或少部分陽性表達，細胞平均陽性率為（7.87±2.18）%。經統計學分析，在口腔正常黏膜、口腔黏膜白斑、口腔鱗狀細胞癌中CDK2AP1蛋白表達差異有統計學意義（H=25.172，P=0.000），且經兩兩比較，任意兩組間CDK2AP1蛋白表達差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 Bcl-2 mRNA表達情況

正?？谇火つ?、口腔黏膜白斑和口腔鱗狀細胞癌組織中Bcl-2 mRNA表達水平組間比較，差異有統計學意義（H=36.840，P=0.000），兩兩比較結果顯示，口腔白斑組織中Bcl-2 mRNA表達水平與正?？谇火つそM織中Bcl-2的mRNA表達水平相比前者升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而口腔鱗癌組織中Bcl-2的mRNA表達水平最高（P＜0.05），與口腔黏膜白斑組織和正?？谇火つそM織比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 CDK2AP1 mRNA表達情況

圖3 Bcl-2 mRNA、CDK2AP1 mRNA在正?？谇火つそM織、口腔黏膜白斑組織、口腔鱗癌組織中的相對表達情況

正?？谇火つ?、口腔黏膜白斑和口腔鱗狀細胞癌組織中CDK2AP1 mRNA表達水平組間比較，差異有統計學意義（H=19.271，P=0.000），兩兩比較結果顯示，口腔黏膜白斑組織中CDK2AP1 mRNA表達水平比口腔鱗癌組織中CDK2AP1的mRNA表達水平提高，差異有統計學意義（P＜0.05），而口腔正常黏膜中CDK2AP1的mRNA表達水平在3者之中最高，與口腔黏膜白斑組織和口腔鱗癌組織比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

Bc1-2基因是一種抑制凋亡基因，該蛋白位于細胞中的線粒體內膜、核膜及胞漿內質網膜上[5]。Bc1-2可以通過抑制細胞凋亡，破壞細胞的動態平衡，導致癌變[6]。本研究發現，Bc1-2蛋白在正常口腔黏膜可見微量表達，在口腔黏膜白斑中呈部分陽性表達，在口腔鱗狀細胞癌組織中呈強陽性表達，各組間Bc1-2蛋白的表達有差異，可推斷Bc1-2蛋白在口腔黏膜白斑和口腔鱗癌的發病過程中可能是通過抑制細胞凋亡，從而使DNA受損的細胞得以存活、復制，破壞細胞的動態平衡，繼而誘導癌基因的激活和抑癌基因的失活，產生癌變[7-8]。Bc1-2蛋白在鱗癌細胞中的表達較白斑上皮細胞的表達水平增高，可能是在鱗癌組織中有更多的DNA受損細胞得以存活、累積，使得Bcl-2在鱗癌細胞中的表達水平增高，這或許能為口腔鱗癌的治療提供一個新思路。

CDK2AP1是在倉鼠的口腔癌模型研究中最先被TODD等發現[9]，在細胞各周期的調控過程中起到很大作用，可以讓各種信號在細胞內外進行傳遞，通過整合匯集到細胞核，進而調控細胞的增殖[10-11]。在細胞的增殖過程中，依賴性激酶CDK4C能和Gi/S期轉換的調控因子DK2AP1發生特異性結合，進一步讓S期相關基因的轉錄啟動，從而加劇G期的細胞進入S期，最終讓細胞增殖失去控制[12-13]。由此可見口腔黏膜組織的病變發生與細胞周期調控機制紊亂關系密切，細胞周期的調控因子發生異常變化可以導致細胞出現失控性生長，而促進腫瘤細胞的增殖[14]。本實驗結果顯示，在口腔正常黏膜組織、口腔黏膜白斑組織和口腔鱗癌組織中CDK2AP1表達率依次降低。各組間有差異，說明CDK2AP1在口腔黏膜組織惡變的初始階段就已經參與并起到一定的作用，并且在口腔黏膜中的陽性表達率有隨著組織的惡變程度增強而減弱的趨勢，可以初步判斷CDK2AP1蛋白與口腔的惡性病變程度相關。

綜上所述，同時用免疫組化和qRT-PCR兩種方法檢測Bc1-2蛋白和CDK2AP1蛋白在口腔黏膜白斑和口腔鱗癌中的表達情況，不僅可以了解口腔白斑和口腔鱗癌的癌變過程，而且可以為患者早期診斷和干預提供分子生物學支持。

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Expression and clinical value of Bcl-2 and CDK2AP1 in oral leukoplakia and oral squamous carcinoma tissue

Guo-fu Zhang1,Jian-ming Gao2
(1.Department of Stomatology,the Affiliated Hospital of Hubei Three Gorges Professional Technology College,Yichang,Hubei 443002,China;2.Department of Physiology and Pathophysiology,Three Gorges University School of Medicine,Yichang,Hubei 443002,China)

Absract:ObjectiveTo investigate expression levels of Bcl-2 and CDK2AP1 in oral leukoplakia and oral squamous carcinoma tissue and its potential clinical value.MethodsPatient samples of oral leukoplakia,oral squamous carcinoma and normaltissue were collected in this study.Immunohistochemistry and the fluorescence quantitative PCR were utilized to identify expression ofBcl-2 and CDK2AP1.ResultsImmunohistochemistry data suggested that ratio of Bcl-2 positive cells in oral leukoplakia and oral squamous cell carcinoma tissue were increased significantly when compared with normal oral mucosa[(19.29±8.18)%vs(2.72±1.45)% (P＜0.05), (57.20±19.37)%vs (2.72±1.45)% (P＜0.05),respectively].However,ratio of CDK2AP1 positive cellsin oralleukoplakia and oralsquamouscellcarcinoma tissue were decreased dramatically when compared with normal oral mucosa[(25.68±8.17)%vs(62.68±11.07)%(P＜0.05), (7.87±2.18)%vs(62.68±11.07)%(P＜0.05),respectively].Immunohistochemistry data were well echoed by PCR results and statistical significance among each groups were obtained.ConclusionExpression levels of Bcl-2 increase while CDK2AP1 decreases along with the increase of malignancy from normal oral mucosa,oral leukoplakia to oral squamous cell carcinoma tissue,which may indicates that Bcl-2 and CDK2AP1 may be involved in development as well as prognosis of oral tumors.

Bcl-2;CDK2AP1;oral leukoplakia;oral cancer

R739.8

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.010

1005-8982（2017）30-0056-04

2017-04-14

高建明，補充 E-mail：jianminggao@163.com；Tel：0717-6397466

（王榮兵 編輯）