缺氧與高級別腦膠質瘤化療抵抗和預后的關系及高壓氧艙臨床療效的初步研究*

李春芳，張彩彩

（1.海南省海口市人民醫院 高壓氧科，海南 ?？?570208；2.海南醫學院第二附屬醫院神經外科，海南 海口 570311）

缺氧與高級別腦膠質瘤化療抵抗和預后的關系及高壓氧艙臨床療效的初步研究*

李春芳1，張彩彩2

（1.海南省?？谑腥嗣襻t院 高壓氧科，海南 海口 570208；2.海南醫學院第二附屬醫院神經外科，海南 ?？?570311）

目的探究缺氧與人腦膠質瘤細胞化療抵抗及患者預后的關系及高壓氧艙在高級別腦膠質瘤患者中應用的療效分析。方法體外使用氯化鈷誘導人腦膠質瘤細胞U251缺氧狀態，蛋白印跡法（Western blot）檢測細胞中缺氧標志物缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的變化，噻唑藍（MTT）染色法檢測U251細胞替莫唑胺（TMZ）的半抑制濃度（IC50）的變化。逆轉錄PCR（RT-PCR）檢測患者高級別腦膠質瘤組織中HIF-1α的表達特征，比較與正常腦組織及低級別腦膠質瘤組織表達的差異，臨床上采用Kaplan-Meier生存分析法分析高壓氧艙治療與高級別腦膠質瘤患者預后的相關性，同時分析患者HIF-1α的表達與未行高壓氧艙治療的患者預后的相關性。結果體外成功誘導U251細胞的缺氧狀態，Western blot結果示U251-ol的HIF-1α表達水平高于對照細胞（U251-control），MTT結果顯示，U251-ol細胞TMZ的IC50值高于U251-control（P＜0.05）。RT-PCR結果示高級別腦膠質瘤HIF-1α的表達高于正常腦組織及低級別腦膠質瘤組織（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析結果示行高壓氧艙治療的高級別腦膠質瘤患者2年內預后優于未行高壓氧艙治療的患者（P＜0.05），但長期隨訪差異無統計學意義（P＞0.05）。未行高壓氧艙治療的高級別腦膠質瘤患者中，高表達HIF-1α的患者相比低表達的患者預后不良，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論缺氧可促進腦膠質瘤細胞化療抵抗的形成，且不利于患者預后，高壓氧艙能有效改善腦膠質瘤組織的缺氧狀況，有效提高患者短期預后情況，是值得推廣的輔助治療方式。

缺氧；缺氧誘導因子-1；高級別腦膠質瘤；化療抵抗；預后

人腦膠質瘤是最常見的顱內原發性腫瘤，約占全部中樞神經系統腫瘤的40%[1]，其中，又分化不良的高級別腦膠質瘤占多數，其增殖侵襲能力強，多數患者病情進展迅速，雖然手術聯合放、化療等綜合治療的方式能有效提高患者短期生存率，但由于腦功能結構的特殊性對手術范圍的限制及腫瘤細胞放、化療的局限性，導致其容易復發，患者5年生存率＜5%[2]。近年許多研究指出，缺氧狀態對多種惡性腫瘤的發生、發展起到關鍵作用[3-4]，但缺氧與高級別腦膠質瘤的關系尚不明確，本研究擬通過體外實驗及生存分析等手段，探究缺氧及缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1α）與高級別腦膠質瘤惡性程度、化療抵抗及患者預后的關系，同時分析高壓氧艙對高級別腦膠質瘤療效，為高壓氧艙在惡性膠質瘤中的應用提供研究基礎及依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年3月-2014年9月本院神經外科收治的78例腦膠質瘤患者。其中，男性43例，女性35例；年齡 24～66歲，平均（41.5±12.8）歲；體重43.5～81.0 kg，平均（63.7±13.1）kg；腦膠質瘤分級以世界衛生組織2007年公布的神經系統腫瘤分類標準為依據[5]，本研究中Ⅰ級患者7例，Ⅱ級患者14例，Ⅲ級患者18例，Ⅳ級患者39例，其中，Ⅰ級和Ⅱ級為低級別膠質瘤組，Ⅲ級和Ⅳ級為高級別膠質瘤組。57例高級別腦膠質瘤患者中行高壓氧艙輔助治療的患者24例，作為本研究的觀察組。其中，男性14例，女性10例；年齡27～61歲，平均（41.6±13.5）歲；體重 43.5～76.0 kg，平均（62.9±14.8）kg。未行高壓氧艙輔助治療的患者33例，作為本研究的對照組。其中，男性18例，女性15例；年齡26～66歲，平均（42.9±11.8）歲；體重 46.0～81.0 kg，平均（64.3±13.6）kg。兩組患者性別比例、年齡及體重差異無統計學意義（P＜0.05）。所有患者均為初發初治的原發腦膠質瘤，入院前未經過任何形式的抗腫瘤治療，高級別腦膠質瘤患者顯微手術后行三維適形放療聯合替莫唑胺（temozolomide，TMZ）化療處理，手術切取的78例膠質瘤病理標本及同時期因腦外傷入院的18例患者的正常腦組織作為對照組，取材后置于凍存管中液氮保存。

1.2 實驗儀器及材料

1.2.1 實驗儀器ECO1.5超凈工作臺（美國Thermo Scientific公司），生化培養箱（美國Thermo Scientific公司），DM500光學顯微鏡（德國Leica公司），高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），Nanodrop 2000c超微量分光光度計（美國Thermo Scientific公司），多孔酶標儀（美國Molecular Devices公司），電泳儀、轉膜儀及GelDoc XR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司），7500 Real-time PCR儀（美國 Applied Biosystems公司），移液器（德國Eppendorf公司）等。

1.2.2 實驗材料6孔板、6 cm及10 cm培養皿（美國Corning公司），移液槍頭（美國Invitrogen公司），1.5 ml離心管（德國 Sigma公司），15 ml離心管（江蘇省無錫耐思生物科技有限公司），聚偏氟乙烯膜（PVDF膜，德國Millipore公司）等。氯化鈷CoCl2（德國Sigma公司），DMEM培養基及胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶（美國 Thermo Scientific Hyclone公司），30%聚丙烯酰胺（美國Thermo Scientific公司），MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、四甲基乙二胺、過硫氨酸及蛋白酶抑制劑cocktail（德國Sigma公司），十二烷基硫酸鈉、甲醇、異丙醇及無水乙醇等（北京國藥集團化學試劑有限公司），RNA提取試劑RNAiso Reagent、RNA逆轉錄試劑盒及SYBR Green核酸熒光染料（日本TaKaRa公司），無核酶水（美國Invitrogen公司），細胞裂解液Cell lysis buffer及BCA蛋白濃度測定試劑盒（海門碧云天生物技術研究所），HIF-1α抗體（ab113642，美國Abcam公司），鼠二抗（ab6728，美國Abcam公司）。

1.3 治療方法

對照組患者術后行放、化療綜合治療方案：①化療方案：術后第3周開始第1周期化療，口服TMZ 150 mg/m2體表面積，1次/d，連用5 d；第2至 5周期口服TMZ 200 mg/m2體表面積，1次/d，連用5 d；②放療方案：根據工作站對磁共振薄層增強掃描圖像的三維重建，為患者制定放射治療計劃，單次分割劑量根據不同腫瘤大小而異，≤5 cm膠質瘤4～6Gy/次，照射9～15次，＞5cm膠質瘤3～4Gy/次，照射15～18次；③高壓氧治療方案：在口服TMZ前2 h行高壓氧治療，治療穩壓吸氧時長為1 h，壓力為0.2 MPa，高壓氧治療后1 h內口服TMZ。對患者每2月進行1次隨訪。

1.4 細胞培養及缺氧誘導

本研究人腦膠質瘤細胞U251（購自北京北納生物技術研究院），使用含10%FBS的DMEM培養基培養，培養環境：37℃，5%二氧化碳CO2，相對濕度100%。U251缺氧細胞（U251 oxygen lack，U251-ol）及 U251對照細胞（U251-control）的誘導：接種2×105個/孔的U251細胞于10 cm培養皿中，待細胞生長至融合度為50%時，誘導U251-ol細胞的培養基中加入終濃度為50 μmol/L的碳酸氯（COCl2），對照組加入同等體積的磷酸鹽緩沖液，處理24 h后收集細胞于1.5 ml離心管中。

1.5 Western blot檢測細胞HIF-1α的蛋白表達

將誘導完成的U251細胞消化離心后去上清液，（500 μl cell lysis buffer+55 μl 10×cocktail）冰上裂解 2 h，15 000 r/min，4℃離心 15min，收集上清液BCA法檢測蛋白濃度，取50 μg蛋白行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，250 mA穩流濕轉PVDF膜2 h，剪取目的條帶10%脫脂奶粉封閉2 h，HIF-1α抗體4℃孵育過夜，孵育濃度為1∶1 000，第2天PBST漂洗膜3次，5 min/次，鼠二抗孵育1 h，孵育濃度為1∶2 000，PBST漂洗膜3次，5 min/次，發光液曝光顯影，Image Lab 4.2檢測印記吸光度，待測蛋白樣品吸光度值與內參基因β-actin吸光度值的比值為樣品相對吸光度。

1.6 MTT檢測細胞TMZ IC50值的變化

誘導方法同前，將U251-ol細胞及U251-control細胞，以2×103個/孔接種至96孔板中，37℃，5%CO2培養12 h后（期間仍持續誘導），棄上清，加入不同終濃度的TMZ與（DMEM＋10%FBS）的混合液，總體積 200μl/孔，TMZ 濃度設置為：0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 及 32.0 μg/ml，在相應濃度下處理24 h，棄去原培養液，將MTT溶液與培養基以1∶9的比例混合后加入孔中，避光孵育1 h，多孔板酶標儀檢測570 nm處吸光度。繪制細胞生存曲線，計算細胞半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.7 逆轉錄PCR檢測患者組織中HIF-1α的mRNA表達

液氮中取出組織并研磨成粉末，取30 mg加入1 ml RNAiso Reagent試劑，冰上裂解5 min，Trizol法抽提總RNA，50 μl無核酶水稀釋RNA沉淀并混勻，37℃促溶，5 min。Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度。取1 μg總RNA行逆轉錄，得到cDNA模板無核酶水稀釋至500 μl。逆轉錄PCR（reverse trans cription PCR，RT-qPCR）體系配置10 μl SYBR Green 核酸熒光染料，5 μl（10 ng）模板cDNA及5μl引物加入，置于Applied Biosystems 9700 PCR儀中進行定量分析，PCR反應條件：95℃預變性 30 min，95℃變性 5 min，60℃退火 1 min，95℃延伸1 min，共40個循環。內參基因β-actin引物：正向引物5'-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3'；反向引物5'-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3'。擴增大小186 bp；HIF-1α引物：正向引物5'-CAGAA TGCTCAGAGAAAGCG-3'；反向引物 5'-TGGTCAGC TGTGGTAATCCA-3'。擴增大小 264 bp，HIF-1α 的相對濃度與內參基因的相對濃度比值作為目的基因mRNA的相對表達量。

1.8 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，行t檢驗或方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-Rank（Mantel-Cox）檢驗兩組患者預后，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 U251-ol細胞、U251-control細胞 HIF-1α蛋白表達的比較

Western blot結果顯示，U251-ol細胞 HIF-1α的蛋白表達水平高于對照細胞U251-control，U251-ol細胞HIF-1α的相對吸光度值為（0.562±0.076），U251-control的吸光度值為（0.159±0.022），經t檢驗，差異有統計學意義（t=5.180，P=0.006），U251-ol細胞HIF-1α的吸光度值高于U251-control組。見圖1。

圖1 U251-ol細胞與U251-control細胞HIF-1α蛋白表達的比較

2.2 U251-ol細胞及 U251-control細胞 TMZ IC50值的比較

MTT結果顯示U251-ol細胞TMZ的IC50值為（3.376±0.365）μg/ml，U251-control細 胞 TMZ 的IC50 值（2.468±0.251）μg/ml，經t檢驗，差異有統計學意義（t=9.190，P=0.000），U251-ol細胞 TMZ 的IC50值高于U251-control組。見圖2。

圖2 U251-ol細胞與U251-control細胞TMZ IC50值的比較

2.3 臨床組織樣本HIF-1α表達特征

RT-PCR結果顯示，高級別腦膠質瘤組織中HIF-1α 的 mRNA 表達為（0.164±0.009），低級別腦膠質瘤為（0.102±0.011），正常腦組織為（0.084±0.011），經方差分析，3組HIF-1α的mRNA表達水平（F=9.380，P=0.000），經 SNK-q兩兩比較，高級別腦膠質瘤表達水平高于正常腦組織及低級別腦膠質瘤（P＜0.05），而低級別腦膠質瘤與正常腦組織比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 臨床組織樣本中HIF-1α mRNA表達的比較

2.4 高壓氧艙輔助治療對高級別腦膠質瘤患者預后的影響

對行高壓氧艙輔助治療的觀察組患者及未行高壓氧艙輔助治療的對照組患者進行隨訪，并繪制Kaplan-Meier生存曲線，結果顯示高壓氧艙輔助治療能夠改善患者兩年內的預后情況[＾HR=0.359（95%CI：0.131，0.983）P=0.022]，但對患者長期療效欠佳[＾HR=0.513（95%CI：0.309，1.268）P=0.217]。見圖 4。

2.5 HIF-1α的表達量與高級別腦膠質瘤患者預后的關系

根據高級別腦膠質瘤患者腫瘤組織中HIF-1α的表達量，將未行高壓氧艙輔助治療的33例高級別腦膠質瘤患者分為高表達HIF-1α組（＞平均相對表達量0.164）和低表達HIF-1α組（≤平均相對表達量0.164），Kaplan-Meier分析結果顯示，高表達HIF-1α的患者預后相比低表達患者預后不良，差異有統計學意義[＾HR=0.369（95%CI：0.137，0.992）P=0.036]。見圖 5。

圖4 高壓氧艙輔助治療與患者預后的關系分析

圖5 HIF-1α表達與患者預后的關系分析

3 討論

能量代謝異常是惡性腫瘤的特征表現之一[6]，絕大多數惡性腫瘤生長迅速，當腫瘤體積＞1 mm時，血管提供的氧及能量將不足以維持腫瘤的需要，此時低氧環境將促進腫瘤細胞發生糖酵解，已有許多研究顯示，糖酵解的發生與多種惡性腫瘤的增殖侵襲及化學耐藥相關[7]。ZHOU等[8]的研究顯示，脂肪酸合酶可通過促進乳腺癌細胞內的糖酵解，使其侵襲能力的增強。MUKHERJEE等[9]發現，胰島素樣生長因子1也可通過促進卵巢癌細胞的糖酵解介導細胞增殖能力增強。ZHANG等[10]在結直腸癌細胞中發現核糖體蛋白S7可通過抑制糖酵解使細胞增殖侵襲能力減弱。WOO等[11]在乳腺癌中證實，糖酵解可參與腫瘤細胞他莫昔芬耐藥，同時提出HIF-1α的過度活化在其中發揮重要作用：HIF-1α的活化可促進糖酵解，使細胞乳酸等酸性代謝產物水平增加，產生的質子可拮抗弱堿性化療藥物的療效。HIF-1α是腫瘤細胞缺氧時產生的一種核轉錄因子，其基因定位于染色體q14.24。近年有研究顯示，其可通過促進腫瘤細胞糖酵解相關酶的表達，增強細胞糖酵解能力，使腫瘤細胞在內環境缺氧狀態下能夠維持生存，并促進腫瘤的惡性行為[12-14]。ZHANG[15]、SCHITO等[16]的研究及結論顯示，HIF-1α可促進乳腺癌細胞的惡性行為，并對腫瘤干細胞的形成具有重要作用。TU等[17]的研究顯示，HIF-1α同樣可促進骨肉瘤細胞的惡性表型，其高表達不利于患者預后。AI[18]的研究發現，在卵巢癌細胞中下調HIF-1α的表達可提高細胞對順鉑的敏感性。上述研究均顯示，缺氧及HIF-1α在惡性腫瘤發生、發展中起著重要作用，但其與人腦膠質瘤關系尚不明確，基于此，筆者對人腦膠質瘤中HIF-1α的表達特征及其與化療抵抗、患者預后的關系進行探究，并在臨床水平分析高壓氧艙對高級別腦膠質瘤的療效。

研究結果顯示，體外誘導人腦膠質瘤細胞U251的缺氧狀態后，細胞HIF-1α表達水平上升，同時細胞相對TMZ的IC50值升高，推測U251細胞缺氧發生時也可通過上調HIF-1α導致細胞糖酵解水平上調，產生的酸性代謝產物使細胞對TMZ耐藥性增強，該推測筆者將通過進一步實驗驗證，改善缺氧腫瘤細胞外環境的酸堿平衡，探究其對細胞化療抵抗能力的影響。同時觀察高級別腦膠質瘤HIF-1α的表達高于其在低級別腦膠質瘤及正常腦組織中的表達，提示HIF-1α可能在高級別腦膠質瘤的發生、發展中發揮關鍵作用，筆者將通過進一步的體外實驗，探究HIF-1α的確切生物學效應。進而在臨床水平觀察HIF-1α的高表達不利于高級別腦膠質瘤患者的預后，進一步說明缺氧對于高級別腦膠質瘤的促癌作用。在研究中采用高壓氧艙對高級別腦膠質瘤患者進行輔助治療，同時對患者進行長期隨訪，結果顯示，患者2年內生存率提高，推測原因為：高壓氧艙可在短時間提高血漿中的氧分壓和氧飽和度，抑制腫瘤細胞內的糖酵解，減少細胞內環境中酸性產物的水平，使得腫瘤細胞短時間內對TMZ敏感性增強，此時患者行TMZ化學治療，效果優于未行高壓氧艙治療的患者。但患者經過一段時間的TMZ治療后，腫瘤細胞通過其他多種機制[19]不可避免的對TMZ耐藥，故高壓氧艙對患者長期生存率無提高。

綜上所述，缺氧及HIF-1α與高級別腦膠質瘤的惡性程度、化療抵抗及患者預后均存在密切關系，高壓氧艙治療能顯著對抗缺氧引起的促癌作用，有利于患者短期預后，是值得推廣的輔助治療方式。

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The relationships of hypoxia with resistance to chemotherapy and prognosis of high-grade gliomas and study on clinical effect of hyperbaric oxygen therapy*

Chun-fang Li1,Cai-cai Zhang2
(1.Department of Oxygen,Haikou People's Hospital,Haikou,Hainan 570208,China;2.Department of Neurosurgery,the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou,Hainan 570311,China)

ObjectiveTo explore the relationships of hypoxia with resistance to chemotherapy of human glioma cells and prognosis of high-grade gliomas,and to analyze the curative effect of hyperbaric oxygen therapy in high-grade glioma patients.MethodsIn vitro,cobalt chloride was used to induce hypoxia in human glioma cell line U251,Western blot assay was used to detect the expression of hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α),which is the marker of hypoxia.thiazolyl blue (MTT)assay was used to detect the changes of half inhibitory concentration (IC50)of Temozolomide (TMZ)in the U251 cells.Fluorescence quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR)was used to detect the expression character of HIF-1α in the high-grade glioma tissues,compared with that of normal brain tissue and low-grade glioma tissue.Kaplan-Meier survival analysis was used to analyze the correlation between hyperbaric oxygen therapy and prognosis of patients with high-grade gliomas,and the correlation between the expression of HIF-1α and prognosis of patients without hyperbaric oxygen therapy.ResultsIn vitro,the hypoxia of U251 cells was induced successfully.Western blot assay showed that HIF-1α of the hypoxia of U251 cells (U251-ol)was significantly higher than that of control cells (U251-control).MTT assay showed that IC50 of TMZ in the U251-ol line was significantly higher than that in U251-control (P＜0.05).Results of RT-PCR showed that the expression of HIF-1α in high-grade gliomas was significantly higher than that in normal brain tissue and low-grade gliomas.Kaplan-Meier survival analysis showed that the prognosis of patients with hyperbaric oxygen therapy was better than that of patients without hyperbaric oxygen therapy in the high-grade gliomas patients in two years (P＜0.05),but there was no significantly statistical difference in the long term (P＞0.05).The high-grade gliomas patients with high expression of HIF-1α who did not receive hyperbaric oxygen therapy had a poorer prognosis compared with the low-grade gliomas patients(P＜0.05).ConclusionsHypoxia can promote resistance to chemotherapy of glioma cells,and is not conducive to the prognosis.The hyperbaric oxygen theraphy can effectively reverse hypoxia in glioma tumor tissue,and improve the prognosis of patients.

hypoxia;hypoxia inducible factor-1α;high-grade glioma;chemotherapy resistance;prognosis

R459.6

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.014

1005-8982（2017）30-0077-06

2017-03-23

海南省自然科學基金（No：20158308）

（唐勇 編輯）