高血壓前期血漿代謝組學特征分析

（南昌大學第二附屬醫院 心血管內科，江西 南昌 331728）

高血壓前期血漿代謝組學特征分析

游志剛，黃琳，姜醒華

（南昌大學第二附屬醫院 心血管內科，江西 南昌 331728）

目的探討高血壓前期相關的血漿代謝變化。方法選取53例高血壓前期受試者，所有受試者血壓3年內反復測量均在高血壓前期范圍。將該組受試者與年齡和性別匹配的53例血壓正常受試者的血漿代謝譜進行比較。通過超高效液相色譜線性離子阱/靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-LTQ-Orbitrap MS）分析法對代謝譜進行分析。結果調整體重指數（BMI）、腰臀比（WHR）、吸煙、酗酒、血脂譜、葡萄糖和胰島素后，高血壓前期組受試者表現出更高水平的溶血卵磷脂（lysoPC），其中包含 C14∶0、C16∶1、C16∶0、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶5、C20∶4、C20∶3 及 C22∶6，更高的脂蛋白相關磷脂酶 A2（Lp-PLA2）活性、氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）、白介素6（IL-6）、尿8-異前列腺素F2α，以及更高臂踝脈搏波傳導速度（baPWV）。LysoPC（16∶0）是對照組和高血壓前期組的血漿代謝物比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；LysoPC與收縮壓（SBP）和舒張壓（DBP）均呈正相關。調整混雜變量后，高血壓前期組受試者LysoPC（16∶0）水平與ox-LDL、Lp-PLA2活性、8-異前列腺素F2α、ba-PWV和IL-6呈正相關。結論與高血壓前期相關的LysoPCs、Lp-PLA2活性、ox-LDL、尿8-異前列腺素F2α、IL-6和ba-PWV升高，表明LDL氧化升高過程中，Lp-PLA2催化PC水解，并導致氧化應激升高，從而促進炎癥發展和增強動脈僵硬度。

高血壓前期；代謝組學；溶原性卵磷脂

高血壓是動脈粥樣硬化和心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的風險因素，但是高血壓與動脈粥樣硬化的相關性機制仍不清楚[1-3]。美國預防、檢測、評估與治療高血壓全國聯合委員會第7次報告（the seventh joint national committee on prevention，detection，evaluation and treatment of high blood pressure，JNC 7）將血壓值處于 120～139mmHg（收縮壓）或者80～89 mmHg（舒張壓）的人群列為高血壓前期范疇[4]。JNC 7指出高血壓前期人群應改變生活方式和行為習慣。高血壓前期能夠進展為高血壓和動脈粥樣硬化，被認為是早期CVD。因此，分析和探討高血壓前期相關的血液循環代謝譜變化情況具有重要的臨床意義。本研究以53例高血壓前期受試者為研究對象，檢測其代謝譜特征，并將其與53例年齡、性別匹配的血壓正常對照組代謝譜進行比較。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2008年1月-2011年12月在本院進行常規體檢的600例志愿者進行前瞻性隊列研究，中位年齡（42.6±11.3）歲。高血壓前期是指血壓處于120～139 mmHg收縮壓和80～89mmHg舒張壓范圍。從600例志愿者中篩選出53例。其中，男性29例，女性24例；非肥胖、空腹血糖正常，3年內所有常規體檢顯示血壓均處于高血壓前期范圍。同時在600例志愿者中篩選出53例年齡和性別相匹配的血壓正常受試者作為對照，3年內所有常規體檢顯示血壓均處于正常范圍（收縮壓＜120 mmHg，舒張壓＜80 mmHg）。所有受試者對本研究均知情同意。

1.2 人體測量指標、血壓、血液采集和飲食攝入評估

受試者測量身高和體重，計算體重指數（body mass index，BMI），同時測量腰圍,采集靜脈血，離心收集血漿或血清，置入-80℃冰箱冷凍保存備用。采用TM-2654自動血壓計（日本愛安德公司）測量左臂血壓。采用半定量食物頻率問卷以及24 h回憶法評估受試者一般飲食攝入量，并通過計算機輔助營養分析程序（CAN-pro2.0）以最近3 d食物記錄為基礎，計算受試者營養攝入量。

1.3 血脂譜和游離脂肪酸檢測

Hitachi 7150全自動生化分析儀（日本日立株式會社）檢測受試者空腹總膽固醇、游離脂肪酸和三酰甘油（triacylglycerol，TG）水平。硫酸葡聚糖-鎂沉淀法沉淀對含載脂蛋白B的脂蛋白，酶法檢測上清液中高密度膽固醇含量。血清TG水平＜400 mg/dl的受試者，通過Friedwald公式間接估計低密度膽固醇濃度：低密度膽固醇=總膽固醇-[高密度膽固醇（high density lipoprotein，HDL）+（TG/5）]。血清 TG 水平≥400 mg/dl受試者低密度膽固醇濃度通過間接方法測定。

1.4 空腹血糖、胰島素、改良穩態模型評估法計算胰島素抵抗指數

Beckman葡萄糖分析儀（美國Beckman公司）通過葡萄糖氧化酶法檢測受試者空腹血糖水平。采用放射免疫測定法測定受試者胰島素水平。采用下列方程計算胰島素抵抗指數（homeostasis model of assessment for insulin resistence index，HOMA-IR）：HOMA-IR=[空腹胰島素 （μIU/ml） 空腹血糖（mmol/L）]/22.5。

1.5 血清高靈敏度C-反應蛋白、脂蛋白磷脂酶A2活性、血漿丙二醇及低密度脂蛋白粒徑檢測

放免法檢測血清高靈敏度C-反應蛋白（high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）含量（美國Zepto-Metrix公司）、脂蛋白磷脂酶A2活性（lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2）、血漿丙二醛（malondialdehyde，MDA）（日本精機株式會社），序列超速離心分離低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）。

1.6 血漿氧化型低密度脂蛋白、8-異前列腺素F2α、血清白介素6、白介素1β、腫瘤壞死因子α及肱踝脈搏波傳導速度檢測

氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）、8- 異前列腺素 F2α、血清白介素 6（interleukin-6，IL-6）、白介素 1β（interleukin-1 beta，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）均采用酶聯免疫反應法檢測。肱踝脈搏波傳導速度（brachial-ankle pulse wave velocities，baPWV）檢測采用VP-1000自動波形分析儀（日本歐姆林科林公司）測定。

1.7 受試者非靶向血漿代謝譜分析

1.7.1 樣本制備和分析800 μl 80%乙腈與100 μl血漿渦旋混勻，4℃、1 000 r/min，離心5 min。氮氣干燥上清液，并熔解在10%甲醇中，渦旋混勻，4℃、1 000 r/min，離心5 min。隨后將上清液轉移至玻璃小瓶。

1.7.2 超高效液相色譜法線性離子阱/靜電場軌道阱高分辨質譜（ultra-high pressure liquid chromatography with a linear ion trap-high resolution Orbitrap mass spectrometry system，UHPLC-LTQ-Orbitrap）分析代謝物血清提取樣本（7 μl）注入超高效液相色譜儀色譜柱（2.1 mm×50.0 mm，1.7 mm，美國沃特世公司），色譜柱內耦合嵌入UPLC-LTQOrbitrap XL（美國Thermo Fisher Scientific公司）。0.1%甲酸平衡樣，0.1%甲酸的乙腈以0.35 ml/min的流速，梯度洗脫樣本20 min。UPLC（美國沃特世公司）分離代謝物，并采用LTQ-Orbitrap-XL（美國賽默飛世爾公司）進行分析、分配。ESI陽性模式下進行質譜測量，噴霧電壓為5 kV。毛細血管電壓（V）、管鏡電壓（V）和毛細血管溫度（uC）保持恒定，分別為35 V、80 V和37℃。為進行質量控制，每10個樣本中加入4種標準化合物（對乙酰氨基酚、磺胺地索辛、特非那定和利血平）混合物，采用Xcalibur 2.1和MS Frontier軟件（美國賽默飛世爾公司）通過碰撞能階梯（55-65eV）獲得代謝物質譜MS/MS頻譜。

1.7.3 數據處理和代謝物鑒定所有數據，包括保留時間、m/z以及離子強度，都通過由儀器自帶的SIEVE軟件收集分析。

1.8 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，將偏態資料做對數轉換，相關分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組和高血壓前期組受試者臨床特征、炎癥和氧化應激標志物及營養攝入特征比較

對照組和高血壓前期組受試者平均收縮壓/舒張壓水平分別為107/65和134/84 mmHg（見附表）。高血壓前期受試者BMI、腰臀比（waist-to-hip ratio，WHR）、總膽固醇、LDL-膽固醇及TG高于對照組受試者。調整BMI、WHR、吸煙、酗酒、血脂譜、葡萄糖和胰島素后，高血壓前期組Lp-PLA 2活性、MDA、尿8-異前列腺素F2α、baPWV及血清IL-6水平高于對照組。高血壓前期組和對照組總熱量預計攝入量差異無統計學意義，分別為（2 225±40）和（2 194±33）kcal/d。見附表。

附表 對照組和高血壓前期組受試者臨床特征、炎癥與氧化應激標志物及營養攝入特征比較 （n=53）

2.2 非靶向血漿代謝譜分析結果

用偏最小二乘判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS-DA）得分圖導出對照組和高血壓前期受試者血漿代謝物質譜數據（見附圖）。兩組受試者血漿代謝物PLS-DA得分圖分為2個互不交叉的部分能夠區分。

2.3 血漿代謝物鑒定結果

非靶向血漿代謝譜分析顯示對照組和高血壓前期組中有932種代謝物含量有差異，其中52種代謝物差異超過1倍，52種差異代謝物中，20種已經被證實。已經證實的20種差異代謝物中，3種氨基酸（L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸）標準化峰值強度高于對照組，經BMI、WHR、吸煙、酗酒、血脂譜、葡萄糖和胰島素等混雜因素校正后，差異消失。經Lp-PLA2活性和ox-LDL等混雜變量校正后，高血壓前期受試者10種L-溶血卵磷脂（Lysophosphatidylcholines，LysoPCs）（C14 ∶0，C16 ∶1，C16 ∶0，C18∶2，C18∶1，C18∶0，C20∶5，C20∶4，C20∶3，C22∶6）高于對照組受試者。

附圖 兩組受試者血漿代謝物質譜數據PLS-DA得分圖

2.4 血壓與臨床和生化參數以及主要血漿代謝物相關

所有受試者106例，SBP和DBP與BMI、WHR、總和 LDL- 膽固醇、TG、HOMA-IR、Lp-PLA2活性、ox-LDL、MDA、8- 異前列腺素 F2α、ba-PWV、IL-6、LysoPCs（C14∶0、C16∶1、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶5、C20∶4、C20∶3 及 C22∶6）（P＜0.05）及IL-1β（PSBP=0.040，PDBP=0.020）呈正相關；而與 LDL粒徑呈負相關（P＜0.05）。收縮壓也與色氨酸呈正相關（P=0.015）。對年齡、性別、BMI、WHR、總膽固醇、HOMA-IR、Lp-PLA2活性、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和 LysoPCs（C14∶0、C16∶1、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶5、C20∶4、C20∶3 及 C22∶6） 等 SBP和DBP影響因素進行多元回歸分析后發現，LysoPC（C16∶0）（b'=0.399，P=0.046）和BMI（b'=0.453，P=0.025）是SBP的獨立預測因子。

BMI、WHR、吸煙、酗酒和LDL膽固醇等因素校正后，高血壓前期受試者LysoPC（C16∶0）水平與ox-LDL、Lp-PLA2活性、8- 異前列腺素 F2α、IL-6呈正相關，而與對照組無關。高血壓前期組LysoPC（C 16∶0）水平與 LysoPC（C14∶0、C16∶1、C18∶2、C 18∶1、C18∶0、C20∶5、C20∶4、C20∶3、C22∶6）、ba-PWV 呈正相關（P＜0.05）。血清 IL-6、IL-1、TNF與尿8-異前列腺素F2α（r=0.262、0.281及0.373，P=0.007、0.042及 0.006） 和血漿 MDA（r=0.449、0.279 和 0.277，P=0.001、0.043 和 0.044）呈正相關。

3 討論

高血壓前期受試者和血壓正常受試者代謝譜有差異，其中包括 LysoPCs（C14∶0、C16∶1、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶5、C20∶4、C20∶3 及 C22∶6）和氨基酸（L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸）。10種差異LysoPCs中，大部分含有長鏈酰基（即C≥16）。該結果與CHEN等[5]和JIANG等[6]研究結果一致，CHEN 等[5]研究發現，長鏈 LysoPC（C≥16）能夠引起血管舒張功能障礙。JIANG等[6]研究發現，自發性高血壓大鼠血漿中長鏈酰基LysoPCs含量增加。本研究發現，LysoPC（C16∶0）是在高血壓前期和血壓正常受試者中差異最明顯的血漿代謝物，與以往有研究發現LysoPC升高是動脈僵硬的重要誘因相類似。

LysoPC僅占非氧化型LDL總PC含量的1%～5%；然而，LDL氧化過程中，LDL所含PC的40%～50%會轉化為LysoPC[7-10]。本組高血壓前期受試者血漿Lp-PLA2活性、血漿ox-LDL、LysoPCs和尿8-異前列腺素F2α水平高于血壓正常受試者。這些結果與之前研究報道的高ox-LDL受試者Lp-PLA2和8-異前列腺素F2α水平高于低ox-LDL受試者結果一致，代謝綜合征患者血漿ox-LDL和Lp-PLA2活性呈正相關。

高血壓前期受試者LysoPC（C16∶0）與ox-LDL、Lp-PLA2活性和8-異前列腺素F2α（氧化應激敏感標志物）相關，提示LDL氧化升高過程中，Lp-PLA2催化PC水解，提高氧化應激水平。本研究結果與以往關于Lp-PLA2活性升高與高膽固醇血癥豬模型中LysoPC、ox-LDL、細胞因子水平升高相關的研究結果一致。中年非肥胖男性血液循環中LysoPC（C16∶0）水平與尿8-異前列腺素F2α密切相關[11-12]。LysoPC能夠促進外周血單核細胞IL-6釋放、調節微血管內皮細胞表達和分泌的正常T細胞激活、增強人單核細胞TNF和IL-1的釋放能力。此外，流行病學研究證實炎癥標志物IL-6、IL-1、TNF血漿濃度升高與SBP和DBP升高或高血壓狀態相關[13]。與該研究結果一致，本研究顯示，高血壓前期組受試者baPWV、血清IL-6水平、脂質過氧化物（包括8-異前列腺素F2α和MDA）水平升高，且LysoPC（C16∶0）、IL-6、8-異前列腺素F2α和MDA呈正相關。

LysoPC占總血漿磷脂的5%～20%，是由血漿中卵磷脂-膽固醇酰基轉移酶作用而形成[14]。本研究觀察到 LysoPC（C16∶0）水平和其他 LysoPCs（C14∶0、C16∶1、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶5、C20∶4、C20∶3及C22∶6）水平之間呈正相關。與體重較輕的對照受試者相比，超重/肥胖、胰島素耐受性受試者 LysoPCs（C14∶0、C16∶0、C18∶0 及 C18∶1）和支鏈或芳香族氨基酸水平升高。本組受試者調整BMI、WHR、吸煙、酗酒、血脂譜、葡萄糖和胰島素后，對照和高血壓前期受試者間亮氨酸，苯丙氨酸和色氨酸水平差異消失。然而，兩組間LysoPCs水平有差異，提示LysoPCs在高血壓前期中具有重要作用。

總的來說，本研通過對血壓正常和高血壓前期受試者血漿代謝組學進行分析后發現，LysoPC（C14∶0、C16∶1、C18∶2、C18∶1、C18∶0、C20∶5、C20∶4、C20∶3及 C22∶6）等 10種 LysoPC 在兩組受試者中有差異，該結果為早期對高血壓前期受試者進行干預提供新的靶點和思路。

[1]王忠祥,王發祥.心血管疾病非傳統危險因素的研究進展[J].臨床急診雜志,2015,12(1):82-84.

[2]ZHENG Y,YU B,ALEXANDER D,et al.Metabolomics and incident hypertension among blacks:the atherosclerosis risk in communities study[J].Hypertension,2013,62(2):398-403.

[3]王敏臣,楊曉清.180例老年人高血壓臨床特征分析[J].中國臨床新醫學,2014,3(9):846-849.

[4]JONES D W,HALL J E.Seventh report of the ioint national committee on prevention,detection,evaluation,and treatment of high blood pressure and evidence from new hypertension trials[J].Hypertension,2004,43(1):1-3.

[5]CHEN L,LIANG B,FROESE D E,et al.Oxidative modification of low density lipoprotein in normal and hyperlipidemic patients:effect of lysophosphatidylcholine composition on vascular relaxation[J].Journal of Lipid Research,1997,38(3):546-553.

[6]JIANG H,NIE L,LI Y,et al.Application of ultra-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry to metabonomic study on spontaneously hypertensive rats and intervention effects of Ping Gan prescription[J].Journal of Separation Science,2012,35(4):483-489.

[7]SCHAEFFER D F,RIAZY M,PARHAR K S,et al.LOX-1 augments oxLDL uptake by lyso PC-stimulated murine macrophages but is not required for oxLDL clearance from plasma[J].Journal of Lipid Research,2009,50(8):1676-1684.

[8]覃小麗,楊博,王永華.人初乳脂肪酸組成及sn-2位脂肪酸分布的研究[J].食品工業科技,2010,22(5):81-84.

[9]STAFFORINI D M,SHELLER JRBLACKWELL T S,SAPIRSTEIN A,et al.Release of free F2-isoprostanes from esterified phospholipids is catalyzed by intracellular and plasma platelet-activating factor acetylhydrolases[J].Journal of Biological Chemistry,2006,281(8):4616-4623.

[10]KONO N,INOUE T,YOSHIDA Y,et al.Protection against oxidative stress-induced hepatic injury by intracellular type II platelet-activating factor acetylhydrolase by metabolism of oxidized phospholipids in vivo[J].Journal of Biological Chemistry,2008,283(3):1628-1636.

[11]高良,周慧,朱敏,等.肥胖對中老年男性糖耐量、胰島素、血脂及纖維蛋白原水平的影響[J].中國現代醫藥雜志,2006,8(8):16-18.

[12]MALHOTRA S,SHARMA R,KLINER D E,et al.Relationship between silent myocardial ischemia and coronary artery disease risk factors[J].Journal of Nuclear Cardiology Official Publication of the American Society of Nuclear Cardiology,2013,20(5):731-738.

[13]SKOOG T,DICHTL W,BOQUIST S,et al.Plasma tumour necrosis factor-alpha and early carotid atherosclerosis in healthy middle-aged men[J].European Heart Journal,2002,23(5):376-383.

[14]KOUGIAS P,CHAI H,LIN P H,et al.Lysophosphatidylcholine and secretory phospholipase A2 in vascular disease:mediators of endothelial dysfunction and atherosclerosis[J].Medical Science Monitor,2006,12(1):RA5-16.

Plasma metabonomics characteristics in prehypertension

Zhi-gang You,Lin Huang,Xing-hua Jiang
(Department of Cardiology,the Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang,Jiangxi 331728,China)

ObjectiveTo investigate the alterations of plasma metabolism in prehypertension.MethodsA group of 53 individuals were within the range of prehypertension during repeated measurements in a 3-year period.This group was compared with control group of 53 normotensive subjects who were matched for age and gender.Metabolomic profiles were analyzed with UPLC-LTQ-Orbitrap mass spectrometry.ResultsThe prehypertensive group showed higher levels of lysophosphatidylcholines (lysoPCs)containing C14∶0,C16∶1,C16 ∶0,C18 ∶2,C18 ∶1,C18 ∶0,C20 ∶5,C20 ∶4,C20 ∶3,and C22 ∶6,higher activity of circulating Lp-PLA 2,oxidized LDL(ox-LDL),interleukin 6(IL-6),urinary 8-epi-PGF 2α,and higher brachial-ankle pulse wave velocity (baP-WV),by adjusting for factors including BMI,WHR,smoking,alcohol consumption,serum lipid profiles,glucose,and insulin.LysoPC (16∶0)was a plasma metabolite for evaluating the difference between the control and the prehypertensive groups and it showed a significant statistic difference (P＜0.05)and independent association with DBP and SBP.The level of lysoPC (16∶0)in the prehypertensive group was positively correlated with ox-LDL,Lp-PLA 2 activity,8-epi-PGF 2α,ba-PWV,and IL-6 by adjusting for confounding variables.ConclusionsPrehypertension-associated increases in lysoPCs,Lp-PLA 2 activity,ox-LDL,urinary 8-epi-PGF 2α,IL-6,and ba-PWV indicate increasing oxidative stress by Lp-PLA2-catalyzed hydrolysis of PC in increasing LDL oxidation process,which enhances proinflammation and arterial stiffness.

prehypertension;metabonomics;lysoPC

R544.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.30.017

1005-8982（2017）30-0093-05

2016-06-21

（王榮兵 編輯）