清蛋白維生素C片的安全性毒理學評價

楊 曉，王 畋，2，劉 暢，黃 瑩，鄒國林

(1.武漢躍萊健康產業有限公司研究院，湖北 武漢 430090；2.中國保健協會，北京 100142；3.武漢大學生命科學院，湖北 武漢 430072)

清蛋白維生素C片的安全性毒理學評價

楊 曉1，王 畋1，2，劉 暢1，黃 瑩1，鄒國林3*

(1.武漢躍萊健康產業有限公司研究院，湖北 武漢 430090；2.中國保健協會，北京 100142；3.武漢大學生命科學院，湖北 武漢 430072)

根據我國衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003版)，通過小鼠急性毒理學試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、鼠傷寒沙門菌/哺乳動物微粒體酶試驗(Ames試驗)、大鼠30 d喂養試驗對清蛋白維生素C片的安全性毒理學進行評價。結果表明，清蛋白維生素C片的小鼠無毒，急性經口最大耐受劑量大于20 g·(kg BW)-1；清蛋白維生素C片的小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗和Ames試驗的結果均為陰性；1.5 g·kg-1、3.0 g·kg-1、6.0 g·kg-1劑量組大鼠喂養30 d的生長狀況良好，攝食量和體重不斷增加，各個臟器絕對重量和血液值都處于正常水平，無任何異常情況。可以判定清蛋白維生素C片具有較好的食用安全性。

清蛋白維生素C片；安全性；毒理學；評價

清蛋白多肽作為一種功能性大分子蛋白質，對調節人的免疫系統、提高血清蛋白含量、改善身體循環、增強體質、預防疾病都有著較好的作用[1-2]，是人體不可或缺的營養物質[3]。研究表明，清蛋白多肽對腸道菌群具有調節作用，對短腸綜合征有促進康復作用，對消化系統具有明顯的改善作用，同時還具有促進鐵的吸收的功能。在食品中添加清蛋白多肽類物質，對肝腎疾病、消化系統疾病以及老年人體質差等具有良好的營養支持和輔助治療作用。

維生素C(L-抗壞血酸)是一類在水果蔬菜中廣泛存在的維生素，是人體必需的微量營養元素之一，也是人體需要量最大的一種維生素[4]。維生素C對惡性貧血、壞血病、動脈粥樣硬化、衰老、癌癥等具有預防和治療作用[5-8]，同時也參與合成膠原蛋白、促進類固醇的代謝、維持骨骼和牙齒的正常功能、維持細胞膜的完整性，還具有增強機體免疫力的能力[9]。目前，許多疾病的發生均與機體的免疫功能低下有關，補充適量的維生素C可以糾正和提高機體的免疫反應[10]。維生素C主要通過調節各種免疫細胞的生長和分化影響細胞因子、趨化因子和活性氧的水平，提高白細胞的吞噬能力，提高人體對疾病的抵抗力和對寒冷的耐受力，在機體免疫反應中發揮著重要的作用[11-12]。

清蛋白多肽是一種生物活性較強的蛋白質，廣泛應用于食品、醫藥等行業，文獻報道清蛋白多肽有較強的生物活性，例如：具有較強的抗氧化活性[13]，并能顯著提高亞急性衰老小鼠的抗氧化能力[14]，改善小鼠學習記憶功能[15]，對鈣有明顯的吸收作用，能增加骨中鈣的含量[16]，增強免疫力[17]。

以清蛋白多肽粉和維生素C為主要原料制成的清蛋白維生素C片，具有生物利用率高、穩定性好、衛生等優點，同時還具有抗氧化、預防和抵抗疾病、維持機體正常運行的功能；并通過了國家食品藥品監督管理局檢測機構的檢測。作者通過小鼠急性毒理學試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、鼠傷寒沙門菌/哺乳動物微粒體酶試驗(Ames試驗)、大鼠30 d喂養試驗等5項食品安全性毒理學試驗研究清蛋白維生素C片的安全性，以期為清蛋白維生素C片開發成為保健食品提供理論依據。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

清蛋白維生素C片，自制，主要成分為清蛋白多肽粉、維生素C、微晶纖維素、包衣粉等。清蛋白多肽粉，武漢天天好生物制品有限公司；維生素C，石藥集團維生藥業(石家莊)有限公司；微晶纖維素，浙江巨星生物材料有限公司；包衣粉，上海新菲爾生物制藥工程技術有限公司。

磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、甲醇、氯化鈉、二甲亞砜、氯化鎂、氯化鉀、硫酸鈉、環磷酰胺、Giemsa染液、伊紅染色液、牛肉膏、胰蛋白胨、瓊脂粉、營養肉湯培養基、磷酸氫鈉銨、檸檬酸、硫酸鎂、葡萄糖、結晶紫溶液、四環素、氨芐青霉素，國藥集團化學試劑有限公司；D-生物素、L-組氨酸、輔酶Ⅱ，上海春曉生物技術有限公司；小牛血清，北京博爾西科技有限公司。

ACS-3A 90401582型電子秤，上海信衡電子有限公司；BP310S-91006909型天平、JH56101 2026型電子天平、CP124S 138006200型電子天平、Sartorius CP124S 13806202型電子天平、Bp3100s 91006823型電子天平，德國賽多利斯有限公司；eclipse 80i50686型Nikon顯微鏡，北京中儀光科科技發展有限公司；GNP-9270型隔水式恒溫培養箱，上海頓克儀器科技有限公司；AU68054854型全自動生化儀，美國貝克曼庫爾特有限公司；XT-2000i 66541型血液分析儀，希森美康醫用電子(上海)有限公司；Mikro22 1105型臺式離心機，杭州普瑞特儀器有限公司；HM340E 15782型切片機，上海名元實業有限公司；HMP110 15784型脫水機，東莞啟隆研磨機械有限公司；AP280 15787型包埋機，孝感亞光醫用電子技術有限公司；HMS70 15788型染色機，上海倍曼生物科技有限公司。

1.2 試驗動物與菌株

SPF級昆明種小鼠(生產許可證號：SCXK(滬)2013-0006，試驗動物使用許可證號：SYXK(滬)2013-0008)，上海斯萊克實驗動物有限責任公司；SPF級SD大鼠(生產許可證號：SCXK(滬)2013-0016，試驗動物使用許可證號：SYXK(滬)2013-0008)，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司；動物飼料(登記證號：蘇飼審(2009)05032)，飼養溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，蘇州雙獅實驗動物飼料科技服務有限公司。

菌株TA97、TA98、TA100、TA102由美國分子毒理學有限公司提供，產品質量保證書批號分別為：4584D、4599D、4600D、4604D，經生物學特性鑒定符合試驗要求。將保存好的菌株取出，制作主平板，選擇分離度好的單菌落懸浮于15 mL營養肉湯培養基中，于37 ℃、120 r·min-1振蕩暗培養12 h。

1.3 方法

參照《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003版)毒理學檢驗方法[18]分別進行如下試驗：小鼠急性毒理學試驗(最大耐受劑量(MTD)試驗方法)、小鼠骨髓細胞微核試驗(Giemsa染色法)、小鼠精子畸形試驗、Ames試驗(平板摻入法)、大鼠30 d喂養試驗。

1.4 數據分析

采用SPSS16.0軟件進行方差分析。

2 結果與討論

2.1 小鼠急性毒理學試驗

將雌雄小鼠各10只按20 g·kg-1劑量喂食清蛋白維生素C片，進行急性經口毒性試驗，結果見表1。

表1 小鼠急性毒性試驗結果

試驗期間雌雄小鼠活動正常，毛色光澤度好，體重逐漸增加，未見任何癥狀和死亡。本試驗的使用劑量是20 g·kg-1，因此雌雄小鼠的最大耐受劑量均大于20 g·(kg BW)-1，按照急性毒性試驗的分級，清蛋白維生素C片對小鼠是無毒的。

試驗結束后將小鼠處死，解剖后肉眼觀察到小鼠各個臟器并無任何異常。

2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

將雌雄小鼠各25只，均分成5組：陰性對照組(蒸餾水20 mL·kg-1，下同)、陽性對照組(環磷酰胺40 mg·kg-1，下同)、2.5 g·kg-1劑量組、5.0 g·kg-1劑量組、10.0 g·kg-1劑量組，進行小鼠骨髓細胞微核試驗，受檢細胞數均為5 000，結果見表2。

由表2 可知，與陰性對照組相比，陽性對照組微核率具有顯著性差異(P<0.01)，而清蛋白維生素C片各劑量組的PCE/NCE值與微核率均無顯著性差異，無統計學意義(P>0.05)。表明，清蛋白維生素C片的小鼠骨髓細胞微核試驗結果為陰性，清蛋白維生素C片對小鼠骨髓細胞無抑制作用。

表2 小鼠骨髓細胞微核試驗結果

注：PCE/NCE為嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比值；**表示與陰性對照組相比(經卡方檢驗)，P<0.01。

2.3 小鼠精子畸形試驗(表3)

表3 小鼠精子畸形試驗結果

注：**表示與陰性對照組相比(經卡方檢驗)，P<0.01。

由表3可知，與陰性對照組相比，陽性對照組精子的畸形率具有顯著性差異(P<0.01)；而清蛋白維生素C片3個劑量組的精子畸形率無顯著性差異(P>0.05)。表明，清蛋白維生素C片的小鼠精子畸形試驗結果為陰性。

2.4 Ames試驗(表4)

由表4可知，在2次試驗中無論是否加入S9活化系統，清蛋白維生素C片8～5 000 μg·mL-1劑量組的回復菌落數小于溶劑對照組的2倍，呈陰性反應，并且未見計量-反應關系；而各個陽性對照組的回復菌落數均為空白對照組的2倍以上，呈明顯的陽性反應，有強烈的誘變作用。因此，清蛋白維生素C片的Ames試驗結果為陰性。

2.5 大鼠30 d喂養試驗

2.5.1 對大鼠每周體重、攝食量、增重、食物利用率的影響(表5)

試驗期間，大鼠的生長狀況良好，無任何異常情況。由表5可知，雄性大鼠和雌性大鼠的體重和攝食量不斷增加，且雄性大鼠的體重和攝食量的增加幅度明顯大于雌性大鼠；雄性大鼠對食物的利用率大于雌性大鼠；在不同時間點時，各個劑量組大鼠的體重和攝食量與對照組相比無統計學意義(P>0.05)。表明，清蛋白維生素C片對大鼠的體重和攝食量無影響。

表4 Ames試驗結果

注：空白對照組(蒸餾水0.1 mL)，溶劑對照組(二甲基亞砜0.1 mL)，ICR、對硝基喹啉、甲基甲烷磺酸酯、2-氨基芴、1,8-二羥基蒽醌為陽性對照。括號內數值為劑量。

2.5.2 對大鼠臟器絕對重量及臟/體比的影響(表6)

由表6可知，不管是雄性大鼠還是雌性大鼠，與對照組相比，低、中、高劑量組的清蛋白維生素C片對其肝臟、腎臟、脾臟以及睪丸(卵巢)的絕對重量基本沒有影響，臟/體比基本一致，無統計學意義(P>0.05)。表明，清蛋白維生素C片對大鼠臟器沒有影響。

2.5.3 對大鼠血常規的影響(表7)

由表7可知，雄性大鼠和雌性大鼠各個劑量組的白細胞和紅細胞個數與對照組基本沒有差異，不具有統計學意義；每升血液中血紅蛋白的含量與對照組相比，無統計學意義；在檢測白細胞時，其中淋巴細胞、單核細胞、中性細胞、嗜酸細胞以及嗜堿細胞所占的百分比與對照組相比均無顯著性差異(P>0.05)。表明，清蛋白維生素C片對大鼠的血液沒有影響。

表5 大鼠體重、攝食量、增重、食物利用率

注：括號外為雄性大鼠數據，括號內為雌性大鼠數據。

表6 大鼠臟器絕對重量及臟/體比

表7 大鼠的血常規測定結果

2.5.4 對大鼠血液生化值的影響(表8)

表8 大鼠血液生化指標檢測結果

由表8可知，大鼠各個劑量組的谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶、總蛋白、白蛋白、尿素氮、肌酐、葡萄糖、甘油三酯、膽固醇的含量與對照組相比基本一致，無統計學意義(P>0.05)。表明，清蛋白維生素C片對大鼠各項生化指標無影響。

2.5.5 組織病理學檢測

通過顯微鏡觀察6.0 g·kg-1劑量組和對照組大鼠喂養30 d后的組織病理學變化，發現：(1)肝臟被膜未發生改變，肝小葉無壞死、出血、空泡變、顆粒變性、肝細胞索斷裂、肝細胞腫脹、炎癥細胞浸潤、嗜酸變發生，匯管區無壞死、出血、膽管增生、炎癥細胞浸潤及其它現象發生。(2)腎臟被膜未發生改變；皮質部腎小管上皮細胞無壞死、腫脹、空泡變、管型、炎癥細胞浸潤發生，皮質部腎小球未發生變性，皮質部間質內未發生病變，皮質部未發生膿腫；髓質部曲管上皮細胞無壞死、腫脹、空泡變、管型、炎癥細胞浸潤發生，髓質部無一例間質炎癥細胞浸潤、無一例擴張；腎孟部乳頭無一例改變，移形上皮細胞也無一例改變。(3)對照組雌性大鼠有1例脾臟紅髓輕度擴張，雄性大鼠組織未見明顯病理學改變；6.0 g·kg-1劑量組雌性大鼠有2例脾臟紅髓輕度擴張，雄性大鼠有1例紅髓輕度擴張；無一例白髓萎縮、造血細胞增生、炎細胞浸潤、色素沉著等其它病變發生。(4)胃腸無一例黏膜出血、水腫、炎細胞浸潤、壞死、萎縮、增生等病變發生。(5)雄性大鼠睪丸無一例生精上皮細胞減少、生精上皮細胞變性、生精上皮細胞壞死、多核巨細胞、間質出血、間質水腫等病變發生。(6)雌性大鼠卵巢無一例萎縮、變性、出血、水腫、囊腫、淤血等病變發生。綜上，各試驗大鼠大體檢查均無異常，肝、腎、脾、腸胃、性器官等主要臟器的組織學檢查未發現與受試樣品有關的病理改變。

在本試驗條件下，以1.5 g·kg-1、3.0 g·kg-1、6.0 g·kg-1劑量的清蛋白維生素C片對大鼠進行30 d 喂養試驗。結果發現：大鼠的生長狀況良好，攝食量和體重不斷增加，各個臟器絕對重量和血液值都處于正常水平，無任何異常情況。表明，清蛋白維生素C片具有較好的食用安全性。

3 結論

通過小鼠急性毒理學試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗、Ames試驗和大鼠30 d喂養試驗對清蛋白維生素C片作為功能性食品食用的安全性毒理學進行了研究。結果表明，清蛋白維生素C片對小鼠急性經口最大耐受劑量大于20 g·(kg BW)-1，屬于無毒的；清蛋白維生素C片的小鼠骨髓細胞微核試驗、小鼠精子畸形試驗和Ames試驗的結果均為陰性；大鼠30 d喂養試驗結果表明，1.5 g·kg-1、3.0 g·kg-1、6.0 g·kg-1劑量組大鼠的生長狀況良好，攝食量和體重不斷增加，各個臟器絕對重量和血液值都處于正常水平，無任何異常情況。表明，在本實驗條件下清蛋白維生素C片具有較好的食用安全性。

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SafetyandToxicologyAssessmentofAlbuminVitaminCTablets

YANG Xiao1,WANG Tian1,2,LIU Chang1,HUANG Ying1,ZOU Guo-lin3*

(1.ResearchInstituteofWuhanTwinklifeHealthIndustryCo.,Ltd.,Wuhan430090,China; 2.ChinaHealthCareAssociation,Beijing100142,China; 3.CollegeofLifeScience,WuhanUniversity,Wuhan430072,China)

According to theTechnicalStandardsforTestingandAssessmentofHealthFood(2003) by Healthy Ministry,we evaluated the safety and toxicology of Albumin Vitamin C Tablets by mice acute toxicity test,mice bone marrow cell micronucleus test,mice sperm abnormality test,Salmonellatyphimurium/mammals microsomal enzyme test(Ames test),and 30 days feeding test in rats.The results indicated that the mice maximum tolerated dose of Albumin Vitamin C Tablets was more than 20 g·(kg BW)-1,so the sample fell into the scale of non-toxicity.The results of mice bone marrow cell micronucleus test,mice sperm abnormality test,and Ames test were all negative.The results of 30 days feeding test showed that the rats of each dose group(1.5 g·kg-1，3.0 g·kg-1，6.0 g·kg-1) were well alive,food intake and weight gain continued to increase,and all organs absolute weights and blood values were at a normal level,without any abnormalities by detection.Therefore,we can determine the Albumin Vitamin C Tablets have good food safety.

Albumin Vitamin C Tablets;safety;toxicology;assessment

2017-08-01

楊曉(1986-)，女，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：食品生物技術，E-mail：meredith.yang@twinklife.com；通訊作者：鄒國林，教授，E-mail：zouguolin@whu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.12.015

楊曉，王畋，劉暢，等.清蛋白維生素C片的安全性毒理學評價[J].化學與生物工程，2017，34(12)：63-69.

TQ466.3 R285

A

1672-5425(2017)12-0063-07

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