低鹽腐乳生產過程及加工環境中的微生物分析

喻世哲，范 熠，韓北忠，陳晶瑜*

（中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京 100083）

低鹽腐乳生產過程及加工環境中的微生物分析

喻世哲，范 熠，韓北忠，陳晶瑜*

（中國農業大學 食品科學與營養工程學院，北京 100083）

腐乳是中國傳統發酵食品的典型代表，其生產過程多為開放式生產，微生物的動態變化影響著產品的品質和風味。該研究通過對車間空氣、主要接觸面以及低鹽腐乳生產過程中原輔料、半成品和成品取樣，采用傳統培養及微生物計數的方法，進行了微生物的動態監測和分析。結果表明，夏季湯料車間菌落總數為4.53 lg（CFU/m3），冬季白坯車間菌落總數為4.48 lg（CFU/m3）；主要接觸面的微生物在冬季的菌落總數較夏季略低，白坯造型工序工人的手表面檢出較多的大腸菌群。確定了大豆、生產用水、白坯、前酵和灌湯為影響低鹽腐乳微生物產生的關鍵工序，煮漿、鹽腌、后酵工序可降低半成品及成品中的微生物數量，對保證低鹽腐乳的衛生質量和安全起著關鍵性的作用，確定了低鹽腐乳生產過程中微生物的動態變化及主要來源。

低鹽腐乳；生產過程；微生物；加工環境

腐乳是我國傳統的大豆發酵食品，風味獨特，營養豐富，具有抗氧化、降膽固醇、抗老年癡呆等生理功能[1]。然而，市售腐乳的鹽含量在6.2%～14.8%[2]，但高鹽含量不但對人體健康有害，而且腐乳的抗氧化性和抑制血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制能力都會降低[3]。近年來我國腐乳行業開發了低鹽發酵工藝，生產了食鹽含量低至5%的低鹽腐乳。但降低鹽含量可能會引起腐乳質構松散，易腐敗變質，引起安全問題[4]。并且，腐乳是開放式生產，大多為傳統的手工操作，加工過程容易引入各種環境微生物[5-7]。因此，在發展低鹽腐乳生產新工藝的同時，更加需要對產品加工過程中引入的微生物進行監測[8]。

目前，我國的腐乳發酵通常采用絲狀真菌，如毛霉、根霉、米曲霉等。也有生產細菌型腐乳，如藤黃微球菌（Micrococcus luteus）發酵的黑龍江克東腐乳、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）發酵的武漢腐乳。鄒家興等[6]采用16S rDNA-聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）序列分析技術分析了腐乳生產過程中的微生物群落結構，結果發現腐乳中的微生物有乳桿菌屬、不動桿菌屬、鏈球菌屬、志賀氏菌屬、腸桿菌屬和腸球菌屬等。HAN BZ等[2]檢測了腐乳生產過程中總好氧性菌、蠟樣芽孢桿菌、腸道菌群、細菌芽孢孢子、霉菌和酵母菌的變化，對我國腐乳的微生物安全性進行了全面的探究。FENG Y等[7]采用聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電⒕（polymerase chainreaction-denaturing gradientgelelectrophoresis，PCR-DGGE）的方法研究了克東腐乳的細菌群落結構，發現了鳥腸球菌、糞腸球菌、肉葡萄球菌為優勢菌群，以及腸膜明串珠菌、腐生葡萄球菌、玫瑰考克氏菌、克氏庫克菌、蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等其他細菌。

本研究通過對低鹽腐乳加工過程中車間空氣、主要接觸面以及生產過程中的原輔料、半成品和成品中微生物進行檢測，了解低鹽腐乳生產過程中微生物的來源和分布特性，確定影響引入微生物的關鍵環節和相關控制措施，以期為保障低鹽腐乳的品質和制定提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低鹽腐乳生產過程中的原輔料、半成品和成品：中國北方某腐乳生產企業；瓊脂、平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養基、乳酸細菌培養基（MRS）、結晶紫中性膽鹽瓊脂（violet red bile agar，VRBA）培養基、煌綠乳糖膽鹽肉湯培養基（brilliant green lactose bile broth，BGLB）：北京奧博星生物技術有限公司；Baird-Parker瓊脂平板、凍干兔血漿：北京陸橋技術有限公司。

1.2 儀器與設備

DHP-9052電熱恒溫培養箱、DHG-9053A烘箱：上海一恒科學儀器有限公司；ZDZX-40B1壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；ZG720EA4-S微波爐：廣東美的微波爐制造公司；MS2-Minishaker渦旋震蕩儀：德國IKA公司；SPS202F分析天平：梅特勒-托利多稱重設備有限公司；TY-CJ-2ND超凈工作臺：哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；XSP-M生物顯微鏡：重慶光學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 腐乳生產工藝流程及采樣點

大豆→浸泡→磨漿→豆漿→加熱凝固→劃塊→白坯→接種毛霉→毛坯→腌制→鹽坯→配料裝瓶→后酵→腐乳

根據腐乳的生產工藝[8]，選擇腐乳生產過程中的4個車間空氣，操作過程中的主要接觸面，以及生產過程中的夏季和冬季主要生產工序進行取樣，研究微生物的變化情況。2014年的7月（夏季）和2015年1月（冬季）分別對腐乳工廠車間空氣（白坯車間、毛坯車間、腌坯車間、湯料車間）、主要接觸面（切刀、榨板、傳送帶、包布、毛坯屜、工人的手表面）、主要生產工序中的原輔料、半成品和成品（原料大豆、生產用水、湯料、熟漿、白坯、前酵24 h和48 h毛坯、鹽坯、后酵10 d、30 d、50 d的樣品）進行采樣。

1.3.2 車間空氣采樣方法

參照GB/T 18204.1—2000《公共場所空氣微生物檢驗方法細菌總數測定》[9]中自然沉降法，采集車間空氣中的微生物。

1.3.3 接觸面采樣方法

參照GB 1579—2002《一次性使用衛生用品衛生標準》[10]附錄E的涂抹測試法，采集車間主要接觸面的微生物。將經滅菌的內徑為5 cm×5 cm的滅菌規格板放在被檢物體表面，用一浸有滅菌生理鹽水的棉簽在其內涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10 mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。

1.3.4 原輔料、半成品和成品采樣方法

液體樣品：采樣前均質攪拌液體，用采樣管吸出250mL液體，置于滅菌的三角瓶內，采樣過程需確保容器口不被污染；顆粒和塊狀樣品：采用無菌手套，隨機抽取250 g樣品，裝于無菌真空袋中真空封口。樣品采集后放入裝有冰袋的保溫箱中，快速運回實驗室檢測，一般不超過3 h。

1.3.5 微生物計數

菌落總數的測定參照GB 4789.2—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[11]進行；霉菌和酵母菌的測定參照GB 4789.15—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗霉菌和酵母菌計數》[12]進行；乳酸菌的測定參照GB 4789.35—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[13]進行；大腸菌群的測定參照GB4798.3—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》[14]進行；金黃色葡萄球菌的測定參照GB 4789.10—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》[15]進行。

1.3.6 數據處理

試驗重復測定3次，應用SPSS 16.0軟件分析，用單因素方差分析（one-way analysis of variance，ANOVA），以Tukey范圍檢驗（Tukey′s range test）。實驗結果以均值±標準差（X±SD）表示，P＜0.05時表示具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 車間空氣中微生物檢測結果

低鹽腐乳生產車間空氣中的微生物可沉降在食品上，因此空氣中的微生物對腐乳的生產過程中的微生物菌群組成和產品質量有較大的影響[16]。夏季和冬季腐乳廠不同車間空氣的微生物檢測結果如圖1所示。

由圖1A可知，夏季車間空氣潔凈程度為：湯料車間＜白坯車間≈毛坯車間＜腌坯車間，湯料車間菌落總數顯著高于其他車間（P＜0.05），為4.53 lg（CFU/m3），可能與該車間是一個半敞開體系、塵埃多、濕度大、空間無消毒設施等有關。這與張偉偉[17]研究結果不同，其研究發現空氣潔凈程度為：鹽坯車間＜湯料車間＜毛坯車間＜白坯車間，分析可能與生產地點和工藝不同有關。冬季白坯車間空氣中微生物較多，菌落總數為4.48 lg（CFU/m3），較夏季上升了約0.6 lg（CFU/m3）。其次為腌坯車間，湯料車間和毛坯車間較低，分別為3.14 lg（CFU/m3）和2.85 lg（CFU/m3），與其他車間差異顯著（P＜0.05）。大腸菌群和金黃色葡萄球菌在所有車間中均沒有檢出，腐乳生產過程中白坯的加工操作都暴露于空氣中，因此不僅要合理調整車間布局，更要定期對車間進行消毒處理[18-19]。

圖1 夏季（A）和冬季（B）車間空氣微生物檢測結果Fig．1 Detection results of microorganism from workshop air in summer（A）and winter（B）

由圖1B可知，冬季毛坯車間空氣中霉菌和酵母菌數較高，為4.81lg（CFU/m3），顯著高于其他車間（P＜0.05）。結合具體生產現場來看，可能是由于車間的面積較大，空氣流動性差，伴隨著白坯接種毛霉，并且進行前期發酵，真菌孢子飛散到空氣溶膠中，導致空氣中真菌數量豐富[20]。而白坯車間溫度較高，這一生產環節中工人的勞動強度較大，車間內使用風扇降溫，以便適合工人作業。所以白坯車間內空氣流通性相對較大，真菌數量最少，為2.92lg（CFU/m3）。而夏季白坯車間空氣中霉菌和酵母菌數較高，為4.10lg（CFU/m3），較冬季上升了約1.18 lg（CFU/m3），可能與溫度變化有關。夏季僅在白坯車間檢出乳酸菌，冬季白坯車間乳酸菌數為4.69lg（CFU/m3），其余3個車間乳酸菌數都在2.5lg（CFU/m3）左右，白坯車間明顯高于其他車間，同菌落總數結果一致。金黃色葡萄球菌和大腸菌群在所有車間均未檢出。

2.2 主要接觸面微生物檢測結果

在低鹽腐乳的加工過程中，直接接觸食品的加工設備、器具和工作人員的手也是微生物的重要來源，會對微生物菌群組成造成一定影響。夏季和冬季低鹽腐乳生產過程中主要接觸面微生物檢測結果如圖2所示。

由圖2可知，總體上，主要接觸面的微生物分布在夏季和冬季呈現出相同的規律，冬季的總體微生物菌落數較夏季略低，推測與環境溫度變化有關。在六個主要接觸面中，包布和切刀的微生物數量最少，傳送帶、毛坯屜以及夏季的榨板微生物檢出較多。可能與榨板和傳送帶反復使用，清洗不及時有關。無論夏季還是冬季毛坯屜菌落總數均較多，并檢出大腸菌群。可能是由于毛坯屜中會殘留碎豆花渣，雖然在使用后進行清洗，但是可能與操作人員衛生存在問題以及使用過程中接觸面的清洗消毒不徹底有關。因此，毛坯屜、傳送帶、榨板要作為重點監控對象，生產結束后首先要及時清除設備和器具上黏附的豆渣、豆花碎片等固體殘渣及油污，然后徹底清洗消毒。本研究主要監測了白坯造型工序中工人的手微生物數量，夏季菌落總數達到3.62lg（CFU/cm2），并且冬季檢出的大腸菌群2.46lg（CFU/cm2）。可能與該工序的工人頻繁接觸傳送帶和搬運毛坯屜有關。夏季榨板真菌總數最高，為4.35lg（CFU/cm2）。切刀和包布真菌數量最少，分別為2.63 lg（CFU/cm2）和2.61lg（CFU/cm2），顯著低于其他設備和器具（P＜0.05）。夏季乳酸菌在切刀和包布并未檢出，工人的手乳酸菌數為2.53 lg（CFU/cm2），其余均在3.8 lg（CFU/cm2）左右。冬季僅有榨板和包布中乳酸菌數下降，其余設備和器具均有不同程度上升。無論冬季和夏季在主要接觸面中均未檢出金黃色葡萄球菌。

圖2 夏季（A）和冬季（B）主要接觸面微生物檢測結果Fig．2 Determination results of microorganism from major contact surface in summer（A）and winter（B）

2.3 主要生產工序微生物檢測

低鹽腐乳加工過程中各工序微生物的動態變化可以大致反⒊各個工序中微生物的分布情況，夏季和冬季腐乳廠主要生產工序微生物檢測結果見表1。

表1 夏季和冬季腐乳主要生產工序微生物情況Table 1 Microbial community composition during the production of sufu in summer and winter lg（CFU/g）

由表1可知，原料大豆菌落總數較高，在4.8 lg（CFU/g）左右，霉菌和酵母菌數基本保持3.7 lg（CFU/g）水平。據此可見，大豆原料本身微生物較多。主要是因為大豆直接從土壤中收獲表面附著泥土，再加上運輸和堆放，使得攜帶大量微生物[21-22]；生產用水菌落總數較高，夏季和冬季分別為2.46 lg（CFU/mL）和2.16 lg（CFU/mL）。 何江等[23]在豆干加工過程中同樣發現大豆和生產用水菌落總數較高，分別5.45 lg（CFU/g）和4.34 lg（CFU/g）。因此，大豆和生產用水等原料可能是低鹽腐乳生產過程中微生物的主要來源之一。而經過蒸汽加熱煮制后，熟漿中菌落總數比大豆少了50%，真菌少了25%左右，乳酸菌少了15%。高溫處理使生漿中的大部分雜菌殺滅。由此可知，煮漿工序對滅菌，保證產品的衛生起到了重要作用。煮漿至接種之間的各個工序中，由于沒有高溫處理措施，因而白坯的菌落總數較熟漿顯著上升（P＜0.05）。主要是因為熟漿要經過過濾除渣再點鹵，由于濾布和凝固劑不做滅菌處理，可能將微生物引入熟漿[24]；壓榨后白坯需要剝去包布，倒入榨板置于傳送帶上，等待機械造型，此過程中由于傳送帶和造型機的微生物和空氣及堆疊過程中微生物會逐漸繁殖，導致白坯菌落總數增加至4.2 lg（CFU/g）左右，乳酸菌也顯著上升。卜宇芳等[25]同樣發現在鹵豆干生產過程中白坯菌落總數達到5.07 lg（CFU/g），分析其可能來源于壓榨設備、烘烤模具和傳送帶。

毛坯階段由于白坯接種了毛霉，真菌總數顯著上升（P＜0.05）夏季8.93 lg（CFU/g），冬季8.14 lg（CFU/g），夏季高于冬季，這是由于夏季溫度高、濕度大，適合真菌的繁殖。伴隨著毛霉的大量生長，其他雜菌也隨之繁殖，菌落總數和乳酸菌均達到8.0 lg（CFU/g）以上。隨著毛坯培養時間的延長，大部分微生物數量顯著上升（P＜0.05），在前期發酵48h后達到最大。經過加鹽腌制后，抑制或殺死了部分不耐鹽菌的生長，因此鹽坯中各類微生物均有所減少，其中真菌較為明顯，可見食鹽對真菌有較強的抑制作用，這與曹翠峰[26]研究結果一致。湯料中細菌總數達到6.64lg（CFU/mL），說明加入湯料時也會帶入一定的雜菌。

后期發酵階段，由于腌坯階段含鹽量較高以及湯料中的酒精和紅曲，抑制了微生物的生長[27-28]。后酵10 d后腐乳中的菌落總數、真菌總數、乳酸菌數較鹽坯顯著下降（P＜0.05）。隨著發酵時間的延長，除乳酸菌外，大部分微生物數量呈下降趨勢。后酵50 d后菌落總數在7.0 lg（CFU/g）左右，冬季高于夏季，這與真菌總數結果一致，但與徐海蒂等[29]研究結果不一致，其僅在毛坯時和一周不添加乙醇的樣品中檢出霉菌和酵母菌。在夏季后酵過程中，乳酸菌數呈穩定的上升趨勢，冬季乳酸菌數顯著下降（P＜0.05），仍達到4.0 lg（CFU/g）以上。說明低鹽腐乳中較低的鹽含量并不能充分抑制乳酸菌的生長。有研究指出[7]，在一些沒有任何腐敗跡象的市售白腐乳中，發現了較高水平的乳酸菌（＞106（CFU/g））。乳酸菌在不同的產品中有較大的差異，可能與一些特殊產品的生產工藝不同有關。

除了在前酵和鹽坯中有大腸菌群檢出外，其他階段均未檢出。其中毛坯中大腸菌群較多，為5.90 lg（CFU/g）和4.33 lg（CFU/g）。經過加鹽腌制后，大腸菌群顯著下降（P＜0.05）。并且隨著湯料的加入和后酵過程的進行，大腸菌群不再檢出。金黃色葡萄球菌在不同階段的原料、半成品和成品中均未檢出，說明在低鹽腐乳生產過程中對于金黃色葡萄球菌的控制較好。

3 結論

本研究檢測了腐乳生產車間空氣、主要接觸面以及生產過程中的原輔料、半成品和成品中微生物，結果表明，榨板、傳送帶、毛坯屜、操作人員和車間環境容易在低鹽腐乳中引入微生物。夏季車間空氣微生物數量為：湯料車間＞白坯車間≈毛坯車間＞腌坯車間，湯料車間菌落總數為4.53 lg（CFU/m3）。冬季車間空氣微生物數量為：白坯車間＞湯料車間＞毛坯車間＞腌坯車間，白坯車間菌落總數為4.48 lg（CFU/m3），白坯造型工序工人的手表面檢出大腸菌群，需加強加工設備與器具的清潔消毒工作及工人的個人衛生監管。確定了大豆、生產用水、白坯、前酵和灌湯為影響低鹽腐乳微生物產生的關鍵工序。由于暴露在白坯車間中和工作人員流動頻繁，大豆和白坯真菌檢出較多。煮漿、鹽腌、后酵工序可降低半成品及成品中的微生物數量，對保證低鹽腐乳的衛生質量和安全起著關鍵性的作用。

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Analysis of microorganism during the production and processing environment of low-salt sufu

YU Shizhe,FAN Yi,HAN Beizhong,CHEN Jingyu*
（College of Food Science and Nutritional Engineering,China Agricultural University,Beijing 100083,China）

Sufu is a typical Chinese traditional fermented food,and its production process is mostly open production.Dynamic changes of microbes affect the quality and flavor of the products.The microbes from workshop air,major contact surface,raw materials,semi-finished products and finished products during the manufacturing process of low-salt sufu were monitored dynamically and analyzed by the traditional culture and microbial counting methods.The results showed that the total plate count in the dressing-mixture workshop in summer was 4.53 lg （CFU/m3）,and in the pehtze workshop in winter was 4.48 lg （CFU/m3）;The total plate count of microbes from major contact surface in winter was slightly lower than that of in summer,and a large number of coliform bacteria were detected from the hands surface of the workers in the pehtze-making process.The soybean,production water,pehtze,pre-fermentation and dressing mixture were determined as the keyprocesses affecting the microorganism compositions in low-salt sufu.Boiling pulp,salting,post-fermentation process could reduce the number of microbes in semi-finished products and finished products.The research played a key role in ensuring the quality and safety of low-salt sufu,and determined the dynamic changes and major sources of microbes during the manufacturing process of low-salt sufu.

low-salt sufu;production process;microorganisms;processing environment

TS207.4

0254-5071（2017）12-0018-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.005

2017-09-22

“十二五”國家863計劃現代農業技術領Ⅱ項目（2013AA102105-4）

喻世哲（1992-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物學。

*通訊作者：陳晶瑜（1978-），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物學。