一株高產γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及應用

韓昱姝，李永轉，胡鳳山*，梁麗娟

（山西三盟實業發展有限公司，山西 太原 030032）

一株高產γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及應用

韓昱姝，李永轉，胡鳳山*，梁麗娟

（山西三盟實業發展有限公司，山西 太原 030032）

γ-氨基丁酸是存在于人體中樞神經系統中一種重要的抑制性神經遞質，具有鎮靜神經、抗焦慮等功效。以泡菜為原料，利用指示劑變色法和γ-氨基丁酸含量檢測篩選出7株產γ-氨基丁酸產酸菌，并從中篩選出一株穩定性較高菌株，經生理生化鑒定和16SrDNA序列分析為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），編號LF-fb-017。以牛奶為發酵底物，在溫度37℃，L-谷氨酸鈉濃度為0.5 g/100 mL條件下發酵3 d，終γ-氨基丁酸產量可達1.68 mg/mL。

γ-氨基丁酸；短乳桿菌；分離鑒定；牛奶

隨著生活節奏加快，工作壓力加大，疲勞已成為當今人們關注的熱點問題之一。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）廣泛存在于動植物體內（植物如豆屬、藻類、蕨類、蘚類等的種子、組織液和根莖中；動物則幾乎只存在于神經組織中，濃度最高的區Ⅱ為大腦中黑質，腦組織中含量大約為0.1～0.6 mg/g組織）[1-3]。γ-氨基丁酸具有許多重要的生理功能（如降壓、鎮靜、增強記憶、抗焦慮等），尤其對更年期的失眠、壓抑和自身失調療效良好。我國衛生部于2009年9月正式批準γ-氨基丁酸為新資源食品。隨著γ-氨基丁酸生理功能的不斷研究和闡明，目前已經發展成為一種新型的功能因子，正逐漸應用于醫藥、食品等行業[4-7]。

乳酸菌是一種存在于人類體內的益生菌，有幫助消化、有助于人體腸道的健康等功能，是人體必不可少的且具有重要生理功能的有益菌[8]。短乳桿菌是乳酸菌中一種，目前已有多篇報道短乳桿菌能夠高產γ-氨基丁酸[9-13]。因此，利用乳酸菌生產的GABA能達到食品安全級，并可進一步豐富乳酸菌作為益生菌的保健功效，應用前景廣闊[14]。

牛奶是最天然的飲料之一，營養豐富，含有豐富的礦物質和必需氨基酸，牛奶中所含的鈣質與L-色氨酸能產生誘發睡眠的荷爾蒙5-羥色胺與褪黑激素，有效助眠，與γ-氨基丁酸的功效相得益彰[15]。本試驗選用牛奶、谷物等綠色健康食品作為乳酸菌的發酵底物，開發一種純天然發酵的γ-氨基丁酸飲品，以期為γ-氨基丁酸在食品中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

韓國泡菜、酸白菜：市售；鹽白菜：實驗室自制。

MRS培養基：酪蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，乙酸鈉5.0 g，吐溫-80 1.0 g，檸檬酸二銨2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水補至1.0 L，pH6.8。

菌種篩選培養基：在MRS固體培養基中添加0.1%溴甲酚綠。

發酵培養基：①MRS液體培養基（對照）；②牛奶培養基；③脫脂奶粉培養基；④酸奶培養基；⑤馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基⑥；高粱培養基：3%粉碎高粱；⑦大米培養基：3%大米粉；⑧3%粉碎高粱+3%豌豆；⑨3%粉碎高粱+3%黃豆。

L-谷氨酸鈉（食品級），γ-氨基丁酸標準品、甲醇、乙腈（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；氨基酸衍生試劑（鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、9-芴甲基氯甲酸酯（9-fluorenylmethylchloroformate，FMOC））：安捷倫科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA224S型分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；PHS-3C型數顯酸度計：上海儀電科學股份有限公司；DH-500A型電熱恒溫培養箱：北京中興偉業儀器有限公司；UV5100型分光光度計：上海元析儀器有限公司；1260型高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高產γ-氨基丁酸菌種篩選

檢測3種泡菜汁中γ-氨基丁酸含量，選擇含量較高的泡菜汁，從中篩選高γ-氨基丁酸乳酸菌菌株。取泡菜汁2 mL，于無菌的MRS液體培養基中，恒溫培養箱37℃靜置培養48 h，富集菌種。將富集后菌種發酵液用無菌生理鹽水稀釋至10-12，吸取1 mL至無菌平皿中，傾注法倒平板，37℃倒置培養48 h。

1.3.2 高產γ-氨基丁酸菌種的分離純化

從平板上的雜菌中挑選使溴甲酚綠變黃的菌株，在MRS固體平板上劃線培養，直至培養出菌落形態單一的純菌種為止。

1.3.3 高產γ-氨基丁酸菌種鑒定

將菌株37℃培養48 h后收集菌體，送北京中國食品發酵工業研究院微生物檢測中心進行菌種鑒定，包括生理生化鑒定，DNA序列分析，并應用MEGA5.0軟件與相關種的16S rDNA序列進行多次重復比對計算。

1.3.4 高產γ-氨基丁酸菌種培養基選擇

以2%的接種量接入1.1部分的培養基篩選出的高產γ-氨基丁酸菌種，37℃靜置培養48 h后，檢測發酵液中γ-氨基丁酸含量。

1.3.5 發酵條件優化單因素試驗

以γ-氨基丁酸產量為衡量指標，設置發酵時間（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、γ-氨基丁酸底物質量濃度（L-谷氨酸鈉）（0.1 g/100 mL、0.2 g/100 mL、0.5 g/100 mL、0.7 g/100 mL、1.0 g/100 mL）的單因素試驗，考察發酵時間、γ-氨基丁酸底物質量濃度對飲品中γ-氨基丁酸產量的影響。

1.3.6 測定方法

將發酵液樣品充分混勻后，取適量于離心杯中，5000r/min離心10min，取上清液。將上清液經過0.22 μm微孔濾膜過濾。色譜條件為：色譜柱為ZorbaxEclipse-AAA氨基酸分析柱；流動相A為40mmol/L NaH2PO4，調節pH為7.8；流動相B為甲醇、乙腈和水，混合比例為45∶45∶10；流速為2 mL/min；進樣量為0.5 μL；柱溫為40℃；檢測波長為338 nm。

2 結果與分析

2.1 菌種初篩

表1 泡菜樣品中γ-氨基丁酸含量Table 1 γ-aminobutyric acid contents in pickle samples

由表1可知，韓國泡菜中γ-氨基丁酸含量最高，為0.728 mg/mL。因此從韓國泡菜中篩選高產γ-氨基丁酸菌株。

利用含有溴甲酚綠指示劑的MRS固體培養基共篩得變色圈較大的產酸菌株31株，在MRS液態培養基中分別對其進行單菌種培養，檢測發酵液中γ-氨基丁酸含量，結果見表2。

表2 產γ-氨基丁酸菌株初篩結果Table 2 Preliminary screening results of strains producing γ-aminobutyric acid

由表2可知，可得到7株產γ-氨基丁酸菌株，其中僅1株為革蘭氏陰性菌，剩余6株均為革蘭氏陽性，且菌落形態與鏡檢形態都較為相似，僅γ-氨基丁酸含量有差異。

2.2 菌種鑒定

對上述篩得的6株革蘭氏陽性菌株經3～5次繼代培養后，選擇其中一株穩定性較好且γ-氨基丁酸含量較高的菌株H-3，分離純化后，收集菌體，進行菌落形態鑒定及鏡檢測定，結果如圖1所示。生理生化分析結果和16S rDNA基因序列分析結果如表3所示。與相關種的16S rDNA構建系統發育樹如圖2所示。

圖 1菌株LF-fb-017菌落（A）及細胞（B）形態Fig．1 Colony （A）and cell（B）morphology of strain LF-fb-017

由圖1可知，該菌株菌落呈乳白色，圓形，表面光滑，濕潤，凸起，半透明，邊緣整齊；菌體呈桿狀，大小為（0.4～0.5）μm×（0.8～2.1）μm，單個或成對排列，革蘭氏陽性。

表3 菌種LF-fb-017生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain LF-fb-017

圖2 基于16S rDNA基因序列構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

由表3、圖2可知，該菌種與安全等級為1級的模式短乳桿菌ATCC 14869相似度100%，將該菌種鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），編號LF-fb-017。

2.3 發酵培養基的篩選

將LF-fb-017菌種種子液按照2%的添加量分別加入液體發酵培養基①～⑨中，于37℃恒溫培養箱中靜置培養3 d后，檢測發酵液中γ-氨基丁酸含量，結果見表4。

表4 不同發酵培養基對γ-氨基丁酸含量的影響Table 4 Effects of different fermentation media on γ-aminobutyric acid content

由表4可知，該乳酸菌在MRS培養基、牛奶培養基和脫脂奶粉培養基中發酵培養可產生較高γ-氨基丁酸（分別為2.119 mg/mL、0.765 mg/mL、0.903 mg/mL），在牛奶與脫脂奶粉培養基中γ-氨基丁酸含量低于MRS培養基，猜測可能是由于該培養基中缺乏碳源導致，因此向上述兩種培養基中補加碳源。谷物培養基中幾乎不產生γ-氨基丁酸，可能是由于復配谷物中仍缺乏乳酸菌產γ-氨基丁酸所必需營養因子，還有待繼續研究[16]。

牛奶培養基中葡萄糖添加量對γ-氨基丁酸含量的影響如圖3所示，脫脂奶粉培養基中葡糖糖添加量對γ-氨基丁酸含量的影響如圖4所示。

圖3 牛奶培養基中葡萄糖添加量對γ-氨基丁酸含量的影響Fig.3 Effect of glucose addition in milk medium on γ-aminobutyric acid content

圖4 脫脂奶粉培養基中葡糖糖添加量對γ-氨基丁酸含量的影響Fig.4 Effect of glucose addition in the skimmed milk powder medium on γ-aminobutyric acid content

由圖3、圖4可知，葡萄糖添加量為1%時，兩種發酵液中γ-氨基丁酸含量基本達到最大值，之后隨著葡萄糖添加量增加，γ-氨基丁酸含量趨于平緩或增加緩慢，因此可確定上述兩種培養基中最適葡萄糖添加量為1%。對比圖3、圖4可發現，添加葡萄糖后牛奶培養基中γ-氨基丁酸含量增幅較大，最大值達到1.682 mg/mL，高于脫脂奶粉培養基中的最大值（1.372 mg/mL），因此選擇含有1%葡萄糖的牛奶培養基為最適培養基。

2.4 發酵條件優化

該菌種的發酵過程共4個影響因素：發酵溫度、發酵時間、γ-氨基丁酸底物質量濃度、發酵液pH值。其中發酵溫度由菌株LF-fb-017的最適溫度決定，為37℃；為確保牛奶的營養價值以及成分不被破壞，pH為牛奶固有pH值，不做改變。

2.4.1 不同發酵時間對γ-氨基丁酸含量的影響

圖5 不同發酵時間對γ-氨基丁酸含量的影響Fig.5 Effects of different fermentation times on γ-aminobutyric acid content

由圖5可知，不同發酵時間對γ-氨基丁酸含量的影響較大，前2dγ-氨基丁酸含量激增，在第2天即可達到1.2mg/mL以上，但第3天增長緩慢，達到最大值1.653mg/mL，第4天開始下降，這可能是由于γ-氨基丁酸在第4天時消耗量大于產生量，導致含量下降。因此，選擇3d為最佳發酵時間。

2.4.2 不同L-谷氨酸鈉含量對γ-氨基丁酸含量的影響

圖6 不同L-谷氨酸鈉含量對γ-氨基丁酸含量的影響Fig.6 Effects of different L-glutamate concentrations on γ-aminobutyric acid content

由圖6可知，不同L-谷氨酸鈉含量對γ-氨基丁酸含量有一定的影響，當L-谷氨酸鈉含量較低時，γ-氨基丁酸含量隨L-谷氨酸鈉含量的增加而增加；當L-谷氨酸鈉含量達到一定值（0.5 g/100 mL）時，γ-氨基丁酸含量變化較小，這可能是由于發酵液中其他因素限制了短乳桿菌對L-谷氨酸鈉的轉化。因此，選擇0.5 g/100 mL為最適底物質量濃度。

3 結論

本研究以泡菜為原料，篩選出7株產γ-氨基丁酸菌株，并從中篩選出一株穩定性較高菌株，經鑒定為短乳桿菌（Lactobacillus brevis），編號LF-fb-017。 該菌株在MRS液體培養基中可產生γ-氨基丁酸2.119 mg/mL，以牛奶為發酵底物，在溫度37℃，γ-氨基丁酸底物濃度為0.5 g/100 mL的條件下發酵3 d，γ-氨基丁酸終產量可達1.682 mg/mL。

[1]劉佳榮.微生物發酵合成γ-氨基丁酸（GABA）的研究[D].哈爾濱：哈爾濱商業大學，2015.

[2]YANG R Q,HUI Q R,GU Z X.Effects of ABA and CaCl2on GABA accumulation in fava bean germinating under hypoxia-NaCl stress[J].Biosci Biotech Biochem,2016,3:540-546.

[3]胡 珊，王小波，戴 甄，等.產γ-氨基丁酸紅曲菌種的篩選及其發酵工藝條件研究[J].食品與發酵科技，2011，47（4）：64-67.

[4]趙玉娟，牛春華，張 健，等.一株高產γ-氨基丁酸短乳桿菌的篩選、鑒定及發酵優化[J].吉林農業科學，2015，40（1）：95-99，103.

[5]高愛同.高產γ-氨基丁酸乳酸菌發酵條件優化及分離純化工藝研究[D].杭州：浙江師范大學，2013.

[6]黃桂東，毛 健，姬中偉，等.一株產氨基丁酸植物乳桿菌MJ0301培養基的優化[J].食品科學，2013，34（17）：165-166.

[7]蔣冬花，高愛同，畢 珂，等.乳酸菌發酵小米糠生產γ-氨基丁酸的配方和條件優化[J].浙江師范大學學報，2013，36（1）：6-10.

[8]范 杰，孫君社，張曉杰，等.高產γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及鑒定[J].中國釀造，2011，30（4）：39-41.

[9]宋明明.產GABA的乳酸菌菌株的選育及最佳發酵條件研究[D].哈爾濱：黑龍江大學，2008.

[10]賢乾隆.產γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及其功能性發酵酸奶的研制[D].柳州：廣西科技大學，2013.

[11]黃柳舒，沈蓮清，王向陽.改良比色法測桑葉中γ-氨基丁酸含量及其熱穩定性研究[J].食品科技，2010，35（8）：328-335.

[12]王向陽，仝義超，施青紅，等.γ-氨基丁酸的檢測方法和熱殺菌穩定性研究[J].食品研究與開發，2009，30（4）：13-16.

[13]周 鵬.含牛乳米乳飲料的工藝及穩定性研究[D].無錫：江南大學，2008.

[14]彭春龍，黃 俊，趙偉睿，等.酸脅迫下短乳桿菌谷氨酸脫羧酶系統關鍵基因的表達及酶活性響應[J].高校化學工程學報，2015，29（2）：359-365.

[15]TUNG Y T,LEE B H,LIU C F,et al.Optimization of culture condition for ACEI and GABA production by lactic acid bacteria[J].J Food Sci,2011,9:585-591.

[16]KIM M J,KIM K S.Isolation and Identification of γ-aminobutyric acid（GABA）-producing lactic acid bacteria from Kimchi[J].J Korean Soc Appl Biol Chem,2012（55）:777-785.

Screening and application of lactic acid bacteria with a high yield γ-aminobutyric acid

HAN Yushu,LI Yongzhuan,HU Fengshan*,LIANG Lijuan
（Shanxi Three-League Industrial Development Co.,Ltd.,Taiyuan 030032,China）

γ-aminobutyric acid is an important inhibitory neurotransmitter in the central nervous system of human,with the effects of nerves sedative,anxiolytic and so on.In this study,7 γ-aminobutyric acid-producing strains were screened from pickle by using indicator color change method and detection of γ-aminobutyric acid content.A strain with high stability was screened out and identified by physiological biochemical tests and 16S rDNA sequencing asLactobacillus brevisLF-fb-017.Using milk as fermentation substrate,the γ-aminobutyric production was 1.68 mg/ml at the conditions of temperature 37℃,L-glutamate 0.5 g/100 ml and fermentation time 3 d.

γ-aminobutyric acid;Lactobacillus brevis;isolation and identification;milk

TS201.3

0254-5071（2017）12-0072-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.015

2017-10-09

山西三盟實業發展有限公司專項基金（2016）

韓昱姝（1989-），女，助理工程師，碩士，研究方向為食品微生物發酵工程。

*通訊作者：胡鳳山（1965-），男，高級工程師，碩士，研究方向為食品微生物發酵工程。