鎖擲酵母破壁技術的研究

呂天琪，杜 超，曹小彥，王海鳴，錢 和*

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣東 廣州 510000）

鎖擲酵母破壁技術的研究

呂天琪1，杜 超1，曹小彥2，王海鳴2，錢 和1*

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣東 廣州 510000）

分析比較了酸熱法、二甲基亞砜法、細胞自溶法、高壓均質法及酶促法對鎖擲酵母的破壁效果，及對類胡蘿卜素提取率的影響。結果表明，與其他4種破壁方法相比，高壓均質法具有破壁效果好（破壁率達72.4%）、類胡蘿卜素提取率高（67.3%）、破壁時間短、工藝簡單、安全無污染等優點。通過均質壓力、均質次數和菌液濃度這3個因素對高壓均質法進行工藝優化，發現均質壓力80 MPa、均質3次、菌液濃度為8%時，細胞破壁及類胡蘿卜素提取效果最佳，分別是78.3%和82.5%。該研究結果為鎖擲酵母的開發利用及類胡蘿卜素的提取提供了理論依據及技術支持。

鎖擲酵母；細胞破壁；高壓均質；工藝優化

類胡蘿卜素具有預防癌癥和心血管疾病等多種生理功能，目前已廣泛應用于食品、化妝品、醫藥和水產養殖業中[1-2]。動物體內無法合成類胡蘿卜素，必須通過食物來攝入，植物中的類胡蘿卜素含量低，難以大規模生產，而化學合成的類胡蘿卜素生物活性較低[3]。酵母培養時間較短、異氧代謝快速且易于實現高密度培養，因而利用酵母工業化生產天然類胡蘿卜素一直是國內外研究的熱點，有廣泛的實用價值和開發前景[4]。當前，鎖擲酵母屬（Sporidiololus）、紅酵母屬（Rhodotorula）、法夫酵母屬（Phaffia）、紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium）、擲孢酵母屬（Sporobolomyces）和三孢布拉霉（blakeslea trispora）等是生產天然類胡蘿卜素的主要菌種[5-8]。

但是類胡蘿卜素是鎖擲酵母的胞內產物，破壁后才能被加以利用，所以破壁效果直接影響到鎖擲酵母生產類胡蘿卜素的產量和質量[9]。酵母細胞除了含類胡蘿卜素外，還含有豐富的人體必需氨基酸、B族維生素、不飽和脂肪酸等營養物質[10]。因此，為充分利用酵母細胞內豐富的營養資源，研究鎖擲酵母的高效破壁方法尤為重要，具有重要的現實意義。目前已被應用于酵母破壁的方法有物理[11]、化學[12]及生物破壁[13-16]等方法。本研究以一株自行分離的鎖擲酵母為試驗材料，比較酸熱法、二甲亞砜法、細胞自溶法、高壓均質法及酶促法的破壁效果，選擇一種工藝簡單、安全衛生、破壁效果好、類胡蘿卜素保留率高的破壁方法，并對其工藝進行優化，以期為將來高效利用鎖擲酵母提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus）JD-2-8：由本實驗室篩選而得；濃鹽酸、二甲亞砜、氯化鈉、丙酮（分析純）：國藥上海化學試劑有限公司；堿性蛋白酶：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

JHG-Q54-P100高壓均質機：上海普麗盛融合機械設備有限公司；XSP-2C生物光學顯微鏡：蘇州歐卡精密光學儀器有限公司；XB-K-25血細胞計數板：上海求精生化試劑儀器有限公司；AB204-N電子天平：Mettler-Toledo Group；centrifugae5804R離心機：德國Eppendorf AG；ZNCL-GS智能磁力攪拌器：鄭州科華儀器設備有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海齊欣科學儀器有限公司；WFJ7200可見分光光度計：龍尼柯上海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

酸熱法：取發酵液10 mL，8 000 r/min離心10 min，收集菌泥，用去離子水清洗2～3遍，加入等體積的3 mol/L鹽酸室溫浸泡1 h，沸水浴加熱3 min，迅速進行冰浴，冷卻后離心（4 000 r/min、5 min），洗滌沉淀2次，加入足量丙酮振蕩萃取20 min，得類胡蘿卜素浸提液。

二甲亞砜法：取發酵液10 mL，8 000 r/min離心10 min；棄上清，加入30 mL預熱至55℃的二甲基亞砜，在磁力攪拌器上55℃攪拌5 h；4 000 r/min離心10 min，洗滌沉淀2次，加足量丙酮振蕩萃取20 min，得類胡蘿卜素浸提液。

細胞自溶法：在50 mL發酵液中加入4 g無菌NaCl，40℃、100r/min搖床中自溶72 h；取10 mL自溶后的發酵液，4 000 r/min離心10 min，洗滌沉淀2次，用足量丙酮振蕩萃取20 min，得類胡蘿卜素浸提液。

高壓均質法：發酵液在60 MPa的壓力下，連續高壓均質3次，均質流速為250 mL/min；取10 mL高壓均質后的發酵液，4000r/min離心10min，洗滌沉淀2次后加入足量丙酮振蕩萃取相同時間（20 min），得類胡蘿卜素浸提液。

酶促法：在發酵液中，按4 mg/g酵母干質量的添加量加入堿性蛋白酶，用NaOH溶液將pH值調至10.0；于37℃酶解9 h，煮沸5 min滅酶活，取10 mL酶解后的發酵液，4 000 r/min離心10 min，洗滌沉淀后加足量丙酮振蕩萃取20 min，得類胡蘿卜素浸提液。

1.3.2 工藝優化試驗方案

以鎖擲酵母細胞破壁率及類胡蘿卜素提取率為評價指標，選取菌液濃度、均質壓力和均質次數為評價因素，優化高壓均質法的工藝條件。首先考察單個因素的影響，找到3個因素的影響規律及優化范圍。隨后根據單因素試驗結果，進一步采用3因素3水平正交試驗對均質條件進行優化。正交試驗的因素水平見表1。

表1 鎖擲酵母破壁工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for Sporidiobolus pararoseuscell wall breaking process optimization

1.3.3 測定方法

酵母破壁率：破壁前鎖擲酵母菌液取樣稀釋，在生物學顯微鏡下觀察血球計數板上所有酵母細胞個數C。不同方法破壁后，取樣稀釋后在顯微鏡下觀察血球計數板上未破壁的酵母細胞個數C’[17]。采用XB-K-25血球計數板，每個樣品重復計數3次，每次數值差距不應相差過大，取平均值。破壁率計算公式：

式中：B為破壁率，%；C為破壁前的酵母細胞數（相同稀釋倍

數）；C’為破壁后未破壁的酵母細胞數（相同稀釋倍數）。

類胡蘿卜素提取率：取不同方法破壁后丙酮萃取得到的類胡蘿卜素浸提液，稀釋相同倍數后，測定吸光度值，總類胡蘿卜素含量計算公式如下：

式中：W為總類胡蘿卜素含量，μg/g干質量；A為波長475 nm處的吸光度值；m為細胞干質量，g；D為稀釋倍數；V為提取類胡蘿卜素丙酮總體積，mL；0.16為類胡蘿卜素的消光系數。

用珠磨法[18]將離心后的酵母細胞完全破壁，測得破壁前的總類胡蘿卜素含量。

2 結果與分析

2.1 不同酵母破壁方法比較

2.1.1 不同酵母破壁方法破壁率的比較

圖1 不同破壁方法對破壁率的影響Fig.1 Effects of different methods on wall breaking rate

由圖1可知，酸熱法的破壁效果最佳，破壁率約為99.9%，說明酵母細胞壁破碎完全。高壓均質法和二甲基亞砜法次之，破壁率分別為72.4%和51.6%，但是二甲基亞砜破壁需5 h，消耗時間過長。酶促法破壁率較低，為19.5%，可能是僅使用了蛋白酶，沒有破壞細胞壁外層的葡聚糖和甘露聚糖網狀結構，導致效果不佳。細胞自溶法的破壁率最低，僅為1.3%，表明酵母細胞壁幾乎沒有破碎。

2.1.2 不同酵母破壁方法類胡蘿卜素提取率的比較

圖2 不同破壁方法對類胡蘿卜素提取率的影響Fig．2 Effects of different methods on carotenoid extraction rate

不同破壁方法對類胡蘿卜素提取率的影響見圖2。由圖2可知，高壓均質法破壁后類胡蘿卜素提取率最高，達到67.3%，說明細胞壁破碎較完全，類胡蘿卜素損失較少；二甲亞砜法效果次之，類胡蘿卜素提取率為50.1%，推測是由于破壁時間過長，類胡蘿卜素被氧化損失；酸熱法的類胡蘿卜素提取率僅為52.3%，推測高溫使類胡蘿卜素發生了氧化反應，在加熱過程中造成大量的損失。此外，在試驗條件下，細胞自溶法破壁后，沒有提取到類胡蘿卜素。

綜合上述試驗結果發現，酸熱法破壁雖高，但高溫容易使類胡蘿卜素發生氧化反應，在破壁過程中造成過多的類胡蘿卜素損失，導致類胡蘿卜素提取率較低。二甲基亞砜法消耗時間較長，在此過程中類胡蘿卜素已被氧化，且二甲基亞砜沸點較高難回收，不能用于食品中，故此法只能用于試驗室研究，無法應用于工業化生產。用酶促法破壁時，存在產物抑制的問題，導致胞內物質釋放率降低，同時酶法破壁相對成本較高，試驗結果也不理想。鎖擲酵母細胞壁過厚，細胞自溶法不適用于鎖擲酵母的破壁。而高壓均質法破壁效果好、類胡蘿卜素提取率高，且操作簡單、耗時短，類胡蘿卜素損失較少，不會造成有機溶劑的污染，是鎖擲酵母細胞破壁最理想的方法。

2.2 高壓均質法工藝優化單因素試驗

根據工業化要求和設備的限制，均質壓力不宜過大，均質次數不宜太多，物料濃度不宜過高，故均質壓力取40～100 MPa，均質次數取1～6次，菌液濃度取1%～10%進行單因素試驗，結果見圖3。

由圖3可知，隨著均質壓力的增大，酵母破壁類胡蘿卜素提取率先升高后降低，在均質壓力為80 MPa時達到最大，因此選擇均質壓力70 MPa、80 MPa、90 MPa進行后續試驗；隨著均質次數的增加，類胡蘿卜素提取率先升高后降低，均質次數為3次時，類胡蘿卜素提取率最高，破壁率持續升高，但超過3次后破壁率增長趨勢平緩，說明再增加均質次數對破壁率的影響很小，而且還會造成類胡蘿卜素的損失，故選擇優化范圍取2次、3次、4次；隨著酵母菌液濃度的增大，酵母細胞的破壁率先增加后減小，在6%濃度時破壁率最大，類胡蘿卜素提取率持續升高，但菌液濃度超過6%后，類胡蘿卜素提取率增長緩慢，故選擇優化范圍為4%、6%、8%。

圖3 均質壓力（A）、均質次數（B）、菌液濃度（C）對破壁率和類胡蘿卜素提取率的影響Fig．3 Effect of homogenization pressure （A），times （B）and bacteria concentration （C）on wall breaking rate and carotenoid extraction

2.3 正交優化試驗

在單因素試驗的基礎上，考察均質壓力、均質次數、菌液濃度對酵母細胞破壁率及類胡蘿卜素提取率的影響，結果見表2，方差分析見表3和表4。

由表2～表4可知，影響酵母細胞破壁率的因素主次為均質壓力＞均質次數＞菌液濃度，最佳工藝參數組合為A3B3C3，即均質壓力為90 MPa、均質次數4次、菌液濃度為8%的工藝條件，在此條件下進行驗證試驗得到酵母細胞破壁率為88.5%，類胡蘿卜素提取率為65.3%。在置信度為95%條件下，均質壓力、均質次數對酵母細胞破壁率的影響達到顯著效果，而菌液濃度無顯著性。影響酵母細胞破壁后類胡蘿卜素提取率的因素主次為均質壓力＞菌液濃度＞均質次數，最佳的工藝參數組合為A2B2C3，即均質壓力為80 MPa、均質次數為3次、菌液濃度為8%，在此條件下得到酵母細胞破壁率為78.3%，類胡蘿卜素提取率為82.5%。在置信度為95%條件下，3個因素對類胡蘿卜素提取率的影響均達到顯著效果。鑒于實際生產中主要注重于類胡蘿卜素的提取率，故選擇A2B2C3為最佳工藝參數，即均質壓力為80MPa、均質次數為3次、菌液濃度為8%。

表2 鎖擲酵母進行破壁工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for Sporidiobolus pararoseuscell wall breaking process optimization

表3 以破壁率為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments using wall breaking rate as evaluation index

表4 以類胡蘿卜素提取率為評價指標的正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments using carotenoid extraction rate as evaluation index

3 結論

鎖擲酵母細胞壁比一般紅酵母更厚，更堅實，目前常用于紅酵母破壁的方法難以將鎖擲酵母破壁，而且當前對鎖擲酵母破壁方法的研究鮮有報道。為更好地利用鎖擲酵母的發酵產物，本試驗以酵母細胞破壁率和類胡蘿卜素提取率為考察指標，對鎖擲酵母破壁工藝進行研究，比較幾種破壁方法后發現高壓均質法破壁率高，類胡蘿卜素提取率高，破壁時間短，工藝簡單并且安全無污染，是最適合大規模地從鎖擲酵母中提取類胡蘿卜素的破壁方法。并且確定了最佳工藝條件：菌液濃度8%、均質壓力80 MPa、均質次數3次，在此條件下鎖擲酵母破壁率和類胡蘿卜素提取率分別達到了78.3%和82.5%，為鎖擲酵母發酵產物的后續研究提供了技術支撐，對鎖擲酵母工業化生產天然類胡蘿卜素具有指導意義。

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Breaking technology ofSporidiobolus pararoseuscell wall

LYU Tianqi1,DU Chao1,CAO Xiaoyan2,WANG Haiming2,QIAN He1*
（1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Guangzhou Grg Metrology&Test Co.,Ltd.,Guangzhou 510000,China）

Sporidiobolus pararoseuswas broken by five different technologies:acid heat method,dimethyl sulfoxide method,cell autolysis method,high pressure homogenization method and enzymatic method.The effect of different methods on cell-breaking and carotenoid extraction rate was analyzed and compared.Results showed that among the five breaking methods,the high pressure homogenization method had advantages of better breaking effect（wall breaking rate of 72.4%）,higher carotenoid extraction rate （67.3%）,short-time,simple process,safe and pollution-free and so on.The factors of homogenization pressure,homogenization times and microbial concentration of high pressure homogenization method were optimized,and results showed under the conditions of homogenization pressure 80 MPa,times 3 and bacterial concentration 8%,the cell wall breaking rate and the carotenoid extraction rate were 78.3%and 82.5%,respectively.The study provided theoretical basis and technical support for the development and utilization ofS.pararoseusand the extraction of carotenoids.

Sporidiobolus pararoseus;cell wall breaking;high homogenization;process optimization

TS201.1

0254-5071（2017）12-0088-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.018

2017-10-09

呂天琪（1994-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程。

*通訊作者：錢 和（1962-），女，教授，博士，研究方向為食品安全與質量控制。