東方伊薩酵母FJ-J-3發酵特性的研究

姚淑敏，徐凱峰，宋晴晴，陳 珊，王 萍

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

東方伊薩酵母FJ-J-3發酵特性的研究

姚淑敏，徐凱峰，宋晴晴，陳 珊，王 萍

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273165）

該實驗研究了東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）FJ-J-3菌株在不同初始葡萄糖含量、培養溫度條件下細胞生長、葡萄糖利用及產乙醇情況。結果表明，在培養基中含有50 g/L葡萄糖時菌體生長量較高，生長速率最快；且乙醇產量較高，產率最高。在培養溫度為28℃時菌體生長量最高，且乙醇產量最高。菌株FJ-J-3能夠耐受16%vol的乙醇，且在72 h時細胞仍能正常存活。

純種發酵；東方伊薩酵母；釀酒酵母；生長特性；初始培養條件

生物乙醇是一種可再生的清潔能源，受到人們廣泛的關注。但酵母的耐受性決定著乙醇產量和生產效率[1]。乙醇對酵母細胞存在很大毒害作用[2]，同時在發酵的過程中不斷增加的乙醇所產生的壓力也是限制乙醇生產和最終阻止乙醇發酵的重要因素[3]。乙醇含量為60 g/L的情況下，季也蒙有孢漢遜酵母被完全抑制[4]；乙醇含量120 g/L的情況下，日本清酒酵母被完全抑制[5]；張強等[6]在研究釀酒酵母的乙醇耐受性的結果表明，室溫條件下培養基中培養48 h，其中能在30～60 g/L乙醇含量條件下生長的菌株，乙醇耐受性為差，60～100 g/L為耐受性中等，而100～130 g/L則為耐受性高。酵母的溫度耐受性是乙醇產量的基本保障，溫度的變化會引起酵母細胞內的脂肪酸、磷脂、麥角固醇等成分的變化，從而影響細胞本身正常生理活動[7]。溫度越高越易引起酵母早衰、死亡，同時高溫也增加了乙醇對酵母細胞的毒害作用[8]。甜酒釀發酵不是一種微生物單獨起作用，實際上是多種菌群的混合發酵，發酵過程中存在菌相的變化[9-10]。近年來，已有學者開始了東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）的研究，覃香香等[11]發現，東方伊薩酵母能降解木糖醇發酵抑制物；張慕明等[12]證實，東方伊薩酵母YP-1對活性艷紅K-2BP有較好的脫色作用；TONDEE T等[13]得出結論，東方伊薩酵母SF9-246對廢水有脫色作用。王風芹等[14]新分離一株耐高溫東方伊薩酵母HN-1，探究出其乙醇產量較高；KWON Y J等[15]新分離出一株耐熱東方伊薩（Issatchenkia orientalis）IPE 100，探究其在不同甜高粱莖稈固態發酵（solid state fermentation，SSF）時的產乙醇量，并證實其有相應的酶水解木質纖維素[16]。

本實驗利用從甜酒釀中分離出一株東方伊薩酵母FJ-J-3，研究該菌株在培養基不同初始葡萄糖含量和不同培養溫度條件下的發酵特性，為該菌株的進一步利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑[17]

東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）FJ-J-3：分離自甜酒釀。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養基：葡萄糖50g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH，115℃滅菌15 min。

YPD固體培養基：YPD培養基中加入瓊脂20 g/L。1.2儀器與設備

GC-2010氣相色譜儀（配氫火焰離子檢測器（flame ionization detector，FID）檢測器、微機工作站及色譜柱）：日本島津公司。GN-9080隔水式恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；HNY-2102c恒溫培養振蕩器：天津歐諾儀器股份有限公司；H.H.S-214B電熱恒溫水浴鍋：上海醫療器械五廠；H2050R臺式高速冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；UV-5500可見光分光光度計：上海元析儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化[4]

挑取一環菌株FJ-J-3，接種在含有50 mL YPD液體培養基的錐形瓶中，28℃、170 r/min培養36 h，離心去上清，將菌體用無菌水洗滌2次，最后懸于2 mL無菌水中，作為種子液。

1.3.2 不同初始葡萄糖含量對菌株FJ-J-3生長的影響

分別取0.3 mL種子液接種于葡萄糖含量為20 g/L、50 g/L、80 g/L、120 g/L、150 g/L的YPD液體培養基中，在28℃、170 r/min條件下培養，每隔6 h取樣，測定菌株FJ-J-3的生長情況、葡萄糖利用量、乙醇產生情況。

1.3.3 不同培養溫度對FJ-J-3生長的影響

分別取0.3 mL種子液分別接種于5組相同的YPD液體培養基中，分別在溫度為25℃、28℃、33℃、37℃、42℃的條件下170 r/min搖床培養，每隔12 h取樣，測定菌株FJ-J-3的生長情況、葡萄糖利用量、乙醇產生情況。

1.3.4 菌株FJ-J-3的乙醇耐受性

取0.3 mL種子液分別接種于乙醇含量為0、40 g/L、80g/L、120g/L、160g/L、200g/L的YPD液體培養基中28℃、170 r/min條件下培養，每隔12 h取樣，測定菌株FJ-J-3的生長情況和死活細胞數。

1.3.5 測定方法

菌體生長情況測定：利用分光光度計法，在波長600nm處測定吸光度值。

葡萄糖含量的測定：按照參考文獻[18]的方法測定。

乙醇產量的測定：按照參考文獻[19]的方法測定。

菌體的比生長速率=OD600nm值/初始葡萄糖含量

降糖率=剩余糖的量/時間

乙醇產率=乙醇產量/初始葡萄糖含量×100%

2 結果與分析

2.1 不同初始葡萄糖含量對菌株FJ-J-3生長的影響

從圖1可看出，當培養基中初始葡萄糖含量為20g/L時，細胞生長量偏低，最大OD600nm值為17.77。初始葡萄糖含量為50g/L時，培養40h時菌體濃度達到最大，OD600nm值為26.065。初始葡萄糖含量為80 g/L時OD600nm值最大為23.9，比初始葡萄糖含量50 g/L時低。當培養基中葡萄糖含量為120 g/L和150 g/L時，細胞的最大生長量OD600nm值分別為31.73和33.74，但此時菌體的比生長速率從初始葡萄糖含量50 g/L時的536 h-1下降至265 h-1和224 h-1，因此，培養基中添加50 g/L的葡萄糖是YPD培養基的最佳含糖量。

圖1 不同初始葡萄糖含量條件下FJ-J-3菌株的生長曲線Fig.1 Growth curve of strain FJ-J-3 at different initial glucose concentrations

圖2 不同初始葡萄糖含量對菌株FJ-J-3利用葡萄糖的影響Fig.2 Effects of different initial glucose concentrations on glucose utilization of strain FJ-J-3

由圖2可知，培養至40h時初始葡萄糖含量50g/L的培養基中殘留葡萄糖已經接近為零，降糖率達到0.125 g/（L·h），其細胞生長也接近穩定期。而在初始葡萄糖含量120 g/L、150 g/L的培養基中，40 h時培養基中細胞的降糖率分別為0.015 g/（L·h）和0.016 g/（L·h）。這說明5%的葡萄糖含量是細胞生長最佳濃度，高濃度的葡萄糖會對酵母菌的生長有抑制作用。

圖3 不同初始葡萄糖含量對菌株FJ-J-3乙醇產量的影響Fig.3 Effects of different initial glucose concentrations on ethanol production of strain FJ-J-3

由圖3可知，初始葡萄糖含量為150 g/L時，培養40 h

時所產的乙醇量達到最大值0.027 mL/mL，其乙醇產率為18%。而在初始葡萄糖含量為50 g/L時，菌株在40 h時乙醇量達到最大為0.026 mL/mL，其產率為52%。由此可見東方伊薩酵母FJ-J-3在低濃度葡萄糖含量的情況下的乙醇產率高于高含量葡萄糖培養條件。從圖1～圖3可以看出，菌株FJ-J-3在培養基中含有50 g/L葡萄糖時菌體生長量較高，生長速率最快；且乙醇產量較高，產率最高。因此在后續實驗中選擇培養基中葡萄糖含量為50 g/L。

2.2 不同培養溫度對菌株FJ-J-3生長的影響

圖4 不同培養溫度條件下菌株FJ-J-3的生長曲線Fig.4 Growth curves of strain FJ-J-3 at different culture temperatures

由圖4可知，培養溫度在28℃時酵母菌FJ-J-3的生長狀況最好。隨著培養溫度的升高，菌株的生長狀況明顯下降，當培養溫度達到42℃時，細胞生長嚴重受到影響，由此可以推測菌株FJ-J-3不能耐受高溫，28℃是最適生長溫度。

圖5 不同培養溫度對菌株FJ-J-3利用葡萄糖的影響Fig.5 Effects of different culture temperatures on glucose utilization of strain FJ-J-3

由圖5可知，28℃時葡萄糖消耗的速度最快，這與28℃時細胞生長狀況最好相對應。在28℃時菌株FJ-J-3在24 h時菌體濃度達到最大，其利用糖的量也達到最大，所以殘留的糖接近與零。

由圖6可知，菌株FJ-J-3的產乙醇量在不同的溫度梯度下不同，28℃時產乙醇量最多，42℃時產乙醇量最小，這與其生長狀況及糖的利用相對應。從圖4～圖6可以看出，菌株FJ-J-3在培養溫度為28℃時菌體生長量最高，且乙醇產量最高。因此選擇培養溫度為28℃。

圖6 不同培養溫度對菌株FJ-J-3乙醇產量的影響Fig.6 Effects of different culture temperatures on ethanol production of strain FJ-J-3

2.3 菌株FJ-J-3的乙醇耐受性

圖7 菌株FJ-J-3在不同乙醇體積分數條件下的生長曲線Fig.7 Growth curves of strain FJ-J-3 at different ethanol concentrations

由圖7可知，菌株FJ-J-3具有良好的乙醇耐受性。菌株FJ-J-3耐受最大乙醇含量為16%vol，此條件下在菌株FJ-J-3培養72h仍能正常存活，OD600nm值達到6。在12%vol乙醇含量下生長狀況良好，這與報道[5]的其他酵母菌乙醇耐受性相當。

3 結論

分離自甜酒釀的東方伊薩酵母FJ-J-3在培養基中含有50 g/L葡萄糖時菌體生長量較高，生長速率最快；且乙醇產量較高，產率最高。這將有大大提高設備的利用率，在工業生產上有一定的優勢。在培養溫度為28℃時菌體生長量最高，且乙醇產量最高。能夠耐受16%vol的乙醇，且在72 h時細胞仍能正常存活。是一株頗具工業開發潛力的酵母菌株。

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Fermentation characteristics ofIssatchenkia orientalis FJ-J-3

YAO Shumin,XU Kaifeng,SONG Qingqing,CHEN Shan,WANG Ping
（College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273165,China）

The cell growth,glucose utilization and ethanol production ofIssatchenkia orientalisFJ-J-3 were studied at the conditions of different initial glucose contents and culture temperatures.Results showed thatI.orientalisgrew well and the growth rate was the fastest in the medium containing glucose 50 g/L,and the ethanol production and productive rate were the highest.At the condition of culture temperature 28℃,the cell growth and the ethanol production were the highest.The ethanol tolerance of strain FJ-J-3 was good;it could tolerate 16%vol ethanol and grew well for 72 h.

pure fermentation;Issatchenkia orientalis;Saccharomyces cerevisiae;growth characteristics;initial culture condition

Q935

0254-5071（2017）12-0092-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.019

2017-07-15

國家青年科學基金項目（31200400）；曲阜師范大學本科科研訓練項目

姚淑敏（1967-），女，副教授，博士，研究方向為微生物資源和利用。