響應面法優化桑葚果酒發酵工藝

葉學林，程水明*，溫露文，曾 霞，周國鈺

（1.茂名市農業科學研究所，廣東 茂名525000；2.廣東省嶺南特色果蔬加工及應用工程技術研究中心，廣東普通高校食品科學創新團隊，廣東 茂名 525000；3.廣東石油化工學院 環境與生物工程學院，廣東 茂名 525000）

響應面法優化桑葚果酒發酵工藝

葉學林1，程水明2，3*，溫露文3，曾 霞2，周國鈺3

（1.茂名市農業科學研究所，廣東 茂名525000；2.廣東省嶺南特色果蔬加工及應用工程技術研究中心，廣東普通高校食品科學創新團隊，廣東 茂名 525000；3.廣東石油化工學院 環境與生物工程學院，廣東 茂名 525000）

以桑甚為原料，采用響應面法優化桑甚果酒的發酵工藝參數。在單因素試驗基礎上，選取起始糖度、起始pH值和主發酵溫度作為影響因子，以桑甚果酒感官評分為響應值，通過響應面分析進行桑甚果酒發酵工藝優化。結果表明，在起始糖度22.6%，起始pH 3.6，主發酵溫度15℃，接種量0.6%時所釀桑甚果酒酒體澄清透亮，香氣協調馥郁，口感醇厚綿長，感官評分達88.64分。

桑甚果酒；發酵工藝；響應面法；優化

桑甚（Fructus mori）是多年生桑科落葉喬木植物桑（Morus alba）的果穗，又名桑棗、桑果。桑甚富含多種糖分、有機酸、維生素、花色苷、白藜蘆醇、礦物質及多種人體所必需的氨基酸，富含營養物質并具藥用價值，是我國權威公布的“藥食兩用”水果之一[1]。我國桑甚產量位居世界第一，將不易貯存的桑甚釀制成酒，既可減少原料浪費和環境污染，又可延長桑蠶產業鏈，提高桑蠶種植附加值，增加桑農收入，還可豐富果酒品種，使消費者的選擇性更寬更廣[2]。

桑甚的主要生物活性成分是類黃酮物質，其中的水溶性色素——花青素含量較高，花青素具有抗氧化、清除人體自由基的作用[3]。我國桑甚資源豐富，桑甚產量以及桑樹品種均位居世界第一[4]。我國既是水果生產大國，也是水果消費大國，但水果加工業與發達國家相比較還有較大的差距，近年來才逐漸進入深加工處理階段[5]。雖然市面上已經有了較具特色的桑甚酒[6]、桑甚茶[7]、桑甚醋[8]、桑甚膏以及桑果丁等各種桑甚加工產品。針對桑甚酒的開發研究也越來越多，但是總體來說桑甚的加工利用率并不高，原料浪費的問題依然非常突出。并且一些產品尚處在初步的小試或者中試階段，還未形成規模化的產業鏈。因此，以桑甚為基礎原料的產品加工在廣度和深度方面仍需進一步提高，不斷地推進桑甚產品規模化和工業化生產的進程。將不易貯存的桑甚釀制成酒，既可減少桑甚的堆積浪費和環境污染，又提高桑蠶種植附加值，豐富果酒品種[9]。

桑甚果酒作為一種新興的保健型果酒，具有極高的營養價值。現今果酒市場上葡萄酒占據主導地位，但桑甚果酒中的蛋白質含量約為葡萄酒的8～9倍，微量元素硒含量比葡萄酒高12倍以上，且作為人體必需氨基酸之一的賴氨酸，在桑甚果酒中的含量是葡萄酒的9倍之多；此外，作為人們所熟知的天然抗氧化劑花青素，其含量為葡萄酒的5倍，桑甚果酒中還含有較高含量的白藜蘆醇[10]，營養及保健功能均高于葡萄酒，為充分利用桑甚的資源優勢，延伸蠶桑產業產品鏈，促進蠶桑傳統產業的轉型升級，本研究探討起始糖度、主發酵的溫度、起始pH值以及接種量對桑甚果酒風味的影響，此外，在單因素試驗基礎上，利用響應面法優化桑甚果酒發酵工藝條件，以期釀造出優質的桑甚果酒。同時也為桑甚果酒的發酵工藝提供相關的技術參數和科學支撐，為桑甚果酒的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

桑甚鮮果（品種粵椹大十）：茂名市蠶業技術推廣中心；釀造果酒專用酵母RW：安琪酵母股份有限公司；降酸酵母Lalvin 71B：煙臺帝伯仕自釀酒有限公司。

氫氧化鈉：天津市百世化工有限公司；檸檬酸：天津市廣成化學試劑有限公司；檸檬酸鈉：天津市致遠化學試劑有限公司；酚酞：廣東光華科技股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

BSP-250生化培養箱：長春博迅生物技術有限責任公司；PHS-3C pH計：上海雷磁儀器廠；PAL-1數顯糖度計：日本ATAGO愛宕公司；0～50%酒精濃度計：上海壘固儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑甚果酒的釀造工藝流程及操作要點

原料挑選→破碎榨汁→殺菌處理→成分調整→活化酵母→接種→主發酵→過濾分離→陳釀→成品果酒

操作要點：

原料挑選：剔除質量不佳的桑甚，挑選顆粒飽滿、無病蟲害、無腐爛的成熟桑甚作為釀酒原料。破碎榨汁：桑甚浸泡清洗后，榨汁機破碎榨汁，取果汁。殺菌處理：榨汁后，在桑甚汁中加入偏重亞硫酸鉀（K2S2O5）殺菌，放置24 h。

成分調整：以白砂糖、檸檬酸和檸檬酸鈉調整果汁的起始糖度和起始pH值。

菌種活化：1∶1的比例混合安琪酵母RW和降酸酵母Lalvin71B，取5g混合酵母于100mL的2%糖水中，37℃條件下搖床培養30 min，備用。

接種：將活化好的酵母以0.6%的接種量加到調配好的桑甚汁中。

主發酵：將接種后的桑甚汁置于不同的溫度（15℃、20℃、25℃、30℃）條件下發酵7 d。每天測定殘糖變化，以確保發酵正常進行。殘糖不再變化時結束發酵。

過濾分離：主發酵結束后，將發酵液進行酒渣分離。

陳釀：將分離后得到的酒液進行密封陳釀，為避免氧化作用，應盡量滿罐封藏，以減少酒體和空氣的接觸。于4℃條件下陳釀30 d。

1.3.2 發酵工藝優化單因素試驗

選取起始糖度（16%、18%、20%、22%、24%、26%）、起始pH值（2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2）、主發酵溫度（15 ℃、20 ℃、25℃、30℃）及接種量（0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%）為考察因素，定時取樣檢測發酵液殘糖含量，依據殘糖量變化情況確定發酵進程。陳釀結束后，測發酵液酒精度、揮發酸、殘糖、總酸含量，探究不同因素變化對桑甚果酒發酵程度及風味的影響。

1.3.3 發酵工藝優化響應面優化試驗

為優化桑甚果酒釀造工藝，在單因素試驗基礎上，選取接種量為0.6%，以起始糖度（A）、起始pH值（B）和主發酵溫度（C）為影響因子，以感官評分（Y）為響應值，采用Box-Behnken設計進行試驗，探究不同因素和水平對桑甚果酒品質的影響，獲取優化工藝組合，利用優化工藝進行驗證試驗。Box-Behnken試驗的因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.4 基本指標測定方法

酒精度、總酸（以酒石酸計）及揮發酸（以乙酸計）：分別按照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精計法、電位滴定法及酸堿滴定法進行測定[11]；殘糖：手持糖度計測定法；pH：酸度計法測定。

1.3.5 感官評定

感官評定評分指標和標準如表1所示。評分標準用語和評分細則具體參考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的感官分析及葡萄酒感官評定要求[11]，滿分100分，桑甚果酒感官評分標準見表2。

表2 桑甚果酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of mulberry wine

續表

1.3.6 數據處理

單因素試驗數據利用Origin 9.0軟件進行分析繪圖，響應面試驗數據采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 起始糖度對桑甚果酒品質的影響

調整桑甚汁起始糖度分別為16%、18%、20%、22%、24%、26%，起始pH值3.6，接種量1%，25℃條件下恒溫發酵7 d。陳釀結束后，取樣測酒精度及殘糖含量，考察起始糖度對桑甚果酒發酵的影響，結果見圖1。

圖1 起始糖度對桑甚果酒品質的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on the quality of mulberry wine

由圖1可知，起始糖度為24%時發酵液酒精度最高，達到14.1%vol。但相應殘糖量也達到8.9%。糖既是酵母生長的碳源，也是酵母生長的能源。在厭氧條件下，酵母能將糖轉化為乙醇。但起始糖度過高會導致高滲透壓環境而不利于酵母生長繁殖，使得發酵不徹底[12]。由圖1殘糖量變化可知，發酵液起始糖度Ⅹ高，發酵結束后殘糖量亦Ⅹ高。當起始糖度達26%，最終殘糖量為10.7%。綜合考慮各方因素，認為發酵液起始糖度以22%為宜。

2.1.2 起始pH值對桑甚果酒品質的影響

調整桑甚果汁起始pH值分別為2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2，起始糖度22%，酵母接種量1%，25℃條件下恒溫發酵7 d，取樣測酒精含量及殘糖含量，考察起始pH值對桑甚果酒發酵的影響，測定結果見圖2。

圖2 起始pH值對桑甚果酒品質的影響Fig.2 Effect of initial pH value on the quality of mulberry wine

由圖2可知，起始pH值為3.9時，酒精度達到最大值13%vol，但此時殘糖量較高，達到8.5%。而當起始pH值為3.6時，酒精度達到12.7%vol，殘糖量為8.2%。說明酵母在pH3.6以及3.9的環境中生長旺盛，對糖的利用較為徹底。但是當起始pH值達到4.2時，發酵液的酒精度急劇下降，殘糖量也相應升高。結果表明，在pH為4.2的環境中，酵母的生長繁殖受到抑制。這可能是因為在該pH條件下，容易感染雜菌，從而影響了酵母菌的正常的代謝活動。在進行響應面優化時，選取起始pH值為3.3、3.6和3.9。

2.1.3 主發酵溫度對桑甚果酒品質的影響

調整桑甚汁的起始糖度22%，起始pH值3.6，酵母接種量1%，將發酵液分別置于15℃、20℃、25℃、30℃條件下恒溫發酵7 d，取樣測桑甚果酒的酒精含量及殘糖含量，考察主發酵溫度對桑甚果酒發酵的影響，結果見圖3。

圖3 主發酵溫度對桑甚果酒品質的影響Fig.3 Effect of main fermentation temperature on the quality of mulberry wine

由圖3可知，隨發酵溫度升高，糖耗速率逐漸增加，發酵時間亦不斷縮短。當主發酵溫度為25℃時，達到最高酒精度12.5%vol，但殘糖量也較高，為8.2%。可能是因為溫度過高，酵母繁殖速率快，代謝旺盛，但同時，高溫也會使得酵母較早地進入衰亡期，從而縮短了發酵周期[14-15]。而溫度過低則會抑制酵母的生長繁殖，難以啟動發酵，不利于酒精的積累，同時還易引起雜菌污染。綜合考慮各方因素，發酵液主發酵溫度定為20℃較為宜。

2.1.4 接種量對桑甚果酒品質的影響

調整桑甚汁起始糖度22%，起始pH值3.6，將接種量分別調整為0.2%、0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%，25℃條件下恒溫發酵7 d，取樣測酒精含量及殘糖含量，考察接種量對桑甚果酒發酵的影響，測定結果見圖4。

圖4 接種量對桑甚果酒品質的影響Fig.4 Effect of inoculum on the quality of mulberry wine

由圖4可知，殘糖量隨著接種量的增加而呈現一定的波動。接種量過小，酵母生長緩慢，繁殖速率降低，糖耗速率也隨之減小，最終使得殘糖量過高。在接種量為0.2%～1.0%時，殘糖量隨接種量增加反而有所下降，當接種量增加至1.4%時，殘糖量反而有所上升，這可能是因接種密度過大，導致溶氧不足，從而抑制了酵母的生長。若繼續增大接種量，殘糖量又出現下降，同時酒精度也降低，原因可能是由于酵母進行旺盛的生長繁殖而消耗了大部分的糖，因而也使得酒精產量降低[16]。綜合考慮各方面因素，最終將酵母接種量定為0.6%。同時，考慮到接種量對整個發酵影響并不明顯，故而在響應面試驗中接種量不作為考察因子進行考慮。

2.2 響應面試驗優化發酵參數

2.2.1 數學模型的建立及分析

在單因素試驗基礎上結合Box-Behnken設計，選取接種量為0.6%，以起始糖度（A）、起始pH值（B）和主發酵溫度（C）為影響因子，以感官評分（Y）為響應值，設計3因素3水平響應面試驗，以優化桑甚果酒發酵工藝參數，Box-Behnken試驗結果見表2，采用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對表2試驗數據進行回歸模型方差分析，結果見表3。

用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對表2試驗結果進行多元回歸方程擬合，獲得以感官評分為目標函數的二次回歸擬合方程：

表2 Box-Behnken設計試驗方案及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，用響應面法建立的二次回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.072 7＞0.05），說明所得模型擬合程度較好，該回歸模型能夠很好地對響應值進行預測。一次項C以及交互項BC為顯著（P＜0.05），一次項A及二次項A2、B2為極顯著（P＜0.01）。各因素對桑甚果酒感官評分的影響強弱次序為起始糖度（A）＞主發酵溫度（C）＞起始pH值（B）。

2.2.2 影響因子間交互作用分析

固定一個參數在零水平，探究其余兩個參數間的交互作用對桑甚果酒感官評分的影響[17-18]，其響應面及等高線見圖5。

圖5 起始糖度、起始pH值及主發酵溫度交互作用對感官評分影響的響應面及等高線Fig．5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial sugar content，initial pH value and main fermentation temperature on sensory evaluation

由圖5可直觀地反⒊出起始糖度、起始pH值和主發酵溫度之間的交互作用對感官評分的影響程度。響應面越陡峭，表明兩因素間的交互作用越明顯[19-20]。由圖5可看出，起始pH值和主發酵溫度的交互作用對桑甚果酒感官評分的影響顯著（P＜0.05），其余因素間交互作用影響不顯著（P＞0.05），這與方差分析結果一致。

2.2.3 驗證試驗

通過軟件對所建立的模型進行分析，獲得釀造桑甚果酒的最佳發酵工藝條件為起始糖度22.62%，起始pH值3.64，主發酵溫度15℃，此時所釀造出來的桑甚果酒，其感官評分預測值可達到88.69分。考慮到實際操作的可行性，將發酵參數修正為起始糖度22.6%，起始pH值3.6，主發酵溫度15℃，接種量0.6%，在此條件下檢驗該回歸模型的可靠性，進行驗證試驗。經過3組平行試驗，桑甚果酒的感官品評得分平均值為88.64分，與模型的預測值非常接近，表明了本試驗所獲得的回歸模型方程具有良好的可靠性與實用性。

3 結論

在單因素試驗基礎上，選取起始糖度、起始pH值和主發酵溫度為影響因子，以桑甚果酒的感官評分為響應值，采用響應面法優化桑甚果酒的釀造工藝。試驗結果表明，最佳發酵工藝參數為起始糖度22.6%，起始pH值3.6，主發酵溫度15℃，接種量0.6%。在此條件下所釀造的桑甚果酒，酒體澄清透亮，呈深紫紅色，果香與酒香協調濃郁，口感醇厚綿長，酒體完整，酸度適中，典型性突出，感官評分達88.64分。為釀制優質的桑甚果酒提供了一定理論基礎。

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Optimization of fermentation technology for mulberry wine by response surface methodology

YE Xuelin1,CHENG Shuiming2,3*,WEN Luwen3,ZENG Xia2,ZHOU Gouyu3
（1.Maoming Agricultural Science Research Institute,Maoming 525000,China;2.Food Science Innovation Team of Guangdong Higher Education Institutes,Technology Research Center for Lingnan Characteristic Fruits&Vegetables Processing and Application Engineering of Guangdong Province,Maoming 525000,China;3.College of Environmental and Biological Engineering,Guangdong University of Petrochemical Technology,Maoming 525000,China）

Using the mulberry as raw material,the fermentation process parameters of mulberry wine were optimized by response surface methodology.Based on single factor experiments,with initial sugar content,initial pH value and main fermentation temperature as the influence factors,the sensory evaluation score of mulberry wine as response value,the fermentation process of mulberry wine was optimized by response surface analysis.The results showed that in the conditions of initial sugar content 22.6%,initial pH value 3.6,main fermentation temperature 15℃and inoculum 0.6%,the mulberry wine obtained had clear and transparent wine body,harmonious and fragrant aroma,mellow and long taste,and the sensory score was up to 88.64.

mulberry wine;fermentation technology;response surface methodology;optimization

TS261.4

0254-5071（2017）12-0105-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.022

2017-10-10

廣東省嶺南特色果蔬加工關鍵技術及應用工程技術研究中心項目（粵科函產學研字[2015]1487號）；廣東普通高校食品科學創新團隊項目（2016KCXTD020）；廣東省教育廳平臺項目（2012gczxB001）

葉學林（1962-），男，高級農藝師，本科，研究方向為蠶桑技術與推廣。

*通訊作者：程水明（1966-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。