褐藻膠裂解酶的基因克隆及表達條件優化

許 超，黃桂媛，王巧貞，盧明倩，張榮燦，廖 威，張云開*，黃庶識

（1.廣西科學院 廣西海洋天然產物與組合生物合成重點實驗室，廣西 南寧 530007；2.廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧 530003；3.廣西北部灣海洋研究中心，廣西 南寧 530007；4.廣西職業技術學院，廣西 南寧 530226）

褐藻膠裂解酶的基因克隆及表達條件優化

許 超1，2，黃桂媛1，王巧貞1，盧明倩1，張榮燦3，廖 威4，張云開2*，黃庶識1

（1.廣西科學院 廣西海洋天然產物與組合生物合成重點實驗室，廣西 南寧 530007；2.廣西大學 生命科學與技術學院，廣西 南寧 530003；3.廣西北部灣海洋研究中心，廣西 南寧 530007；4.廣西職業技術學院，廣西 南寧 530226）

采用大腸桿菌（Escherichia coli）表達海洋弧菌（Vibriosp.）X511的褐藻膠裂解酶基因，以實現對該酶的大量制備及酶學性質研究。通過序列分析，預測該酶的前20個氨基酸為信號肽，去除信號肽后的蛋白質分子質量約為30 254.28 Da，等電點8.75，分子式為C1368H2100N364O401S6，對應的基因序列命名為alg1987。按如下方案構建重組菌：設計特異性核酸引物，PCR擴增得到alg1987；將重組質粒pET-30（a）-alg1987導入大腸桿菌Trans5α進行測序；提取陽性pET-30（a）-alg1987質粒導入大腸桿菌BL21，利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電⒕（SDS-PAGE）檢測誘導后的重組菌胞液上清，發現異源表達的褐藻膠裂解酶分子質量大小與預測值相近。對重組菌中的褐藻膠裂解酶進行表達條件優化，結果顯示，最適參數為誘導溫度16℃，誘導時間16 h，誘導劑IPTG濃度0.8 mmol/L。

褐藻膠裂解酶；基因；克隆；條件優化；表達

褐藻膠包括海藻酸及其可溶性鹽，是地球上可再生碳水化合物中總儲量僅次于纖維素的多糖物質[1-3]，廣泛存在于海洋褐藻門植物的細胞壁外層及內層，其含量可達到褐藻干質量的10%～40%[4-5]。組成褐藻膠的基本單糖是β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid，M）和α-L-古羅糖醛酸（α-L-guluronic acid，G），M與G互為差向異構體，僅C5所連羧基的位置存在差異[4]。在褐藻膠中通常存在聚甘露糖醛酸（ploymannuronic acid，pM）、聚古羅糖醛酸（polyguluronic acid，pG）、pM/G、M/G共4種結構單元，以隨機比例通過1,4-糖苷鍵的聚合作用形成直鏈、無分支、具有負電荷的線性大分子多糖[6]。此外，在少數細菌如假單胞菌和固氮菌屬等細菌中也存在褐藻膠，但一般只含多聚甘露糖醛酸[7]，而無多聚古羅糖醛酸[8]。褐藻膠廣泛應用于飼料、食品、農業及醫藥[9-11]等多個行業。但是褐藻膠分子質量大，黏度高，不容易被直接使用[12]，而通過對褐藻膠進行降解或改性的方法，可得到可發酵的寡糖及的衍生物，且具有特殊生物活性，拓寬了褐藻膠應用領Ⅱ[7]。

目前水解褐藻膠方法可分為3類：①物理降解，包括熱解、輻射和超聲降解，此方法的操作過程較為繁瑣，且存在能耗大及原料轉化率低的問題，在工業上應用得不多[13]；②化學降解，包括酸堿及氧化降解，酸水解法是目前比較主流的一種方法，該方法操作繁瑣，反應過程難以控制，廢棄物處理難度大[14-15]；③生物酶法，應用褐藻膠裂解酶進行水解作用獲得寡糖或者單糖，與物理或者化學法相比，生物酶法工藝效率高，能耗少，環境友好，優勢明顯。

褐藻膠裂解酶來源廣泛，在海洋藻類、海洋軟體動物和棘皮動物以及微生物（包括土壤微生物、海洋微生物、噬菌體和少數病毒）中均有報道。在海洋微生物中，又以弧菌屬（Vibrio）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、交替單胞菌（Alteromonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、交替假單胞菌屬（Pseudoaltermonas）、鞘氨醇菌屬（Sphingosinas）和鏈霉菌屬（Streptomyces）等被研究的最多[16-18]。褐藻膠在褐藻膠裂解酶（alginatelyase）的作用下生成不飽和醛糖酸[19]，可經非酶促反應轉變為4-脫氧-L-赤式-5-己酮糖糖醛酸（4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronate，DEH）[20-21]，DEH可被還原酶作用變成2-酮基-3-脫氧-D-葡萄糖酸（2-keto-3-deoxy-D-gluconate，KDG），進而醛酸為丙酮酸進入糖酵解途徑被利用[22-23]。

隨著基因工程技術的發展，通過構建工程菌對某一特定功能的基因進行大量表達，是實現工業化生產的有效途徑。目前國內外對褐藻膠裂解酶的異源表達也做了大量研究，如SHINABARGER D等[24-25]分別將銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）的褐藻膠裂解酶基因克隆至大腸桿菌（Escherichia coli）并成功表達；劉航等[26-27]利用大腸桿菌分別表達得到了紫色鏈霉菌（Treptomyces violaceoruber）和海洋弧菌QY105的褐藻膠裂解酶基因。此外，TAKEDAH等[28]通過整合鞘氨醇菌（Sphingomonassp.）A1和運動發酵單胞菌（Zymomonas mobilis）中褐藻膠的吸收及轉化的多個基因，并阻斷了代謝通路上副產物的代謝途徑，率先在實驗室以褐藻膠為唯一碳源利用重組菌株A1生產乙醇，其發酵3d后的乙醇產量達到13.0g/L。WARGACKIAJ等[29]將褐藻膠降解及乙醇合成途徑上的多個關鍵酶基因導入大腸桿菌的染色體，得到了可直接利用褐藻膠生產乙醇的重組菌，其乙醇產量可到達到理論值的80%。ENQUISTNEWMAN M等[30]構建的可直接將褐藻膠轉化為乙醇的酵母工程菌株達到了工業生產的要求。

本研究克隆篩自北部灣海Ⅱ的海洋弧菌（Vibriosp.）X511中的褐藻膠裂解酶基因，構建重組質粒導入大腸桿菌（Escherichia coli），通過條件優化，實現該酶的異源大量表達，以期為大量制備褐藻膠裂解酶及進一步研究提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

海藻酸鈉：阿拉丁試劑有限公司；酵母浸膏、蛋白胨：英國Oxoid公司；七水硫酸鎂、硫酸銨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵：國藥集團化學試劑公司；所有試驗所用試劑均為分析純。細菌總DNA提取試劑盒：杭州博日科技公司；PCR高保真ExTaq酶、DNA及RNA Marker、DNA連接試劑盒：大連TakaRa公司；限制性內切酶Nde I、Xho I：美國NEB公司；質粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒：美國Bioflux生物公司。

1.1.2 菌株及質粒

海洋弧菌（Vibriosp.）X511為本實驗室篩選保存；質粒pET-30（a）：上海捷瑞生物公司；大腸桿菌（Escherichia coli）Trans5α、BL21（DE3）：北京全式金生物技術有限公司。

1.1.3 培養基

海藻酸鈉培養基：海藻酸鈉6 g/L，NaCl 15 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，硫酸鎂1 g/L，硫酸亞鐵0.001 g/L，pH 7.5。

活化培養基：海藻酸鈉培養基中的硫酸銨用蛋白胨替代，其他成分保持不變。

LB培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH調至7.0。

LA培養基：在LB培養基的基礎上添加1.5%的瓊脂。以上培養基均在121℃條件下滅菌20 min備用。

1.2 儀器與設備

TProfessionalstandard96GradientPCR儀：德國Biometra公司；UNIVERSAL 32R臺式冷凍離心機：德國Hettich科學儀器公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度儀：北京普析通用儀器公司；OmegaFlour凝膠成像儀：美國Aplegen公司。

1.3 方法

1.3.1 序列分析

借助SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析褐藻膠裂解酶基因的信號肽；利用ExPASy（http：//web.expasy.org/compute_pi/）預測目的蛋白質的分子質量及等電點信息；在美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）蛋白質數據庫中Blast目的蛋白，下載同源序列，利用MEGA6.0軟件基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.2 基因克隆

取1 mL于-80℃冰箱中保藏的菌種X511至活化培養基中活化，按1%的接種量轉入海藻酸鈉培養基培養過夜，培養條件均為30℃、200 r/min。根據細菌總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic，DNA）提取試劑盒的操作步驟，提取菌株X511的總DNA經稀釋后作為聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）模板。

去除信號肽后的目的基因長度為798 bp，采用Vector NTI Advance 11.5軟件設計引物，分別在引物兩段添加限制性酶切位點及保護堿基：alg1987-F：GGAATTC CATATG TCTGATGTAAATAATGGTATCG（下劃線部分為Nde玉酶切位點）；alg1987-R：CCG CTCGAG TTACTTGCCGTTTAGCTTAA（下劃線部分為Xho玉酶切位點）。委托北京奧科生物公司進行引物合成。PCR總反應體系為：ExTaq酶1μL，6xExTaq酶Buffer5μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）混合物2.0 μL，上游引物（F）2.0 μL，下游引物（R）2.0 μL，DNA模板2.0 μL，加ddH2O至25μL。PCR擴增條件為：98℃預變性5min，98℃變性10s，50℃退火15 s，68℃延伸50 s，68℃延長5 min，16℃保存；循環數為30次。

1.3.3 表達載體的構建

根據試劑盒操作步驟，切膠回收PCR擴增產物，在37℃條件下對目的基因及pET-30（a）載體進行雙酶切，體系為：CutSmartTM 5 μL，Nde玉2 μL，Xho玉2 μL，加入目的基因至50μL，反應時長2h；分別切膠回收目的基因及載體的雙酶切產物，于16℃按以下條件過夜連接，體系為：Solution玉10 μL，pET-30a 4 μL，目的DNA 12 μL；將重組載體pET-30（a）-alg1987轉化至大腸桿菌感受態細胞Trans5α，挑選陽性轉化子送上海生工公司測序，提取序列正確的重組質粒轉化至感受態細胞大腸桿菌BL21（DE3）[31]。

1.3.4 優化誘導表達條件

挑取陽性轉化子接至LB培養基中培養過夜，得到種子液；以1%的接種量將種子液轉接至LB培養液中，振蕩培養至OD600nm介于0.6～0.8之間，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）至終濃度為0.4 mmol/L，分別為16℃、25℃、37℃三組不同溫度條件下誘導表達，在誘導時間為0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h時取樣，測定重組菌破胞液中的褐藻膠裂解酶粗酶活性，選取粗酶活性最高時對應的條件作進一步優化。

IPTG可誘導重組菌中異源基因的表達，但其自身對微生物細胞體具有一定的毒害作用，過高的濃度甚至會殺死細胞，影響重組菌的表達效率。為得到較優的添加量，分別對IPTG終濃度為0、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L進行優化，選擇褐藻膠裂解酶粗酶活性最高時對應的IPTG濃度。

1.3.5 褐藻膠裂解酶活性測定

將培養好的菌液于6 000 r/min、4℃條件下離心10 min收集菌體，用濃度為0.1mol/L，pH值為7.5的Tris-HCl等體積重懸；在冰浴條件下超聲20 min破碎菌體，8 000 r/min，4℃離心5 min，取上清作為粗酶。酶活測定方法為：向900 μL底物（海藻酸鈉溶于0.1mol/LpH值為7.5的Tris-HCl至質量體積比為0.2%）中加入100μL粗酶液，30℃水浴反應10min，12 000 r/min條件下離心2 min，測定上清液在波長235 nm條件下的OD235nm值[26]，定義光密度值每分鐘上升0.01為一個酶活力單位（U）。

相對酶活是指定義同一批試驗中酶活性最高一組的為100%，其他試驗組的相對酶活性為該試驗組與最高組之間酶活性的比值。

1.3.6 SDS-PAGE電泳

將誘導后的重組菌破胞液液進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電⒕（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），以初步確定重組菌表達的褐藻膠裂解酶的分子質量。

2 結果與分析

2.1 序列分析結果

采用SignalP4.1Server分析褐藻膠裂解酶基因（見圖1A）對應的蛋白質序列（全長共285個氨基酸），預測該蛋白質的前20個氨基酸為信號肽序列（見圖1B下劃線部分）。

圖1 目的基因及蛋白質序列Fig.1 Target gene and protein sequence

利用ExPASy分析不含信號肽的褐藻膠裂解酶序列，預測其理論的分子質量大小為30 254.28 Da，等電點8.75，分子式為C1368H2100N364O401S6。在NCBI中進行蛋白質序列比對，發現該酶與褐藻膠裂解酶PL-7家族中多個酶的結構Ⅱ較為相似，下載同源序列，利用MEGA6.0軟件構建的系統發育樹，結果見圖2。

圖2 目的蛋白的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the target protein

由圖2可知，褐藻膠裂解酶Alg1987與噬瓊膠菌屬菌株Agarivoranssp.JAM-Alm中的褐藻膠裂解酶BAH70324.1以及白色噬瓊膠菌屬菌株Agarivorans albus中的褐藻膠裂解酶WP 040307007.1和Agarivorans albusMKT 106中的褐藻膠裂解酶GAD01352.1一致性最高，為81%，遠低于同種酶之間的95%，說明Vibriosp.X511 Alg1987可能是一種新型褐藻膠裂解酶。

利用SWISS-MODEL對褐藻膠裂解酶Alg1987的第29～259個氨基酸進行在線同源建模，得到多個推薦模型。由圖3可知，與Alg1987同源性最高的模型為2za9.1.A，兩者的相似性僅為23.08%，該模型富的C端富含β折疊，其余部分為α螺旋。

圖3 褐藻膠裂解酶Alg1987的三維結構模擬圖Fig.3 Three-dimensional structure simulation diagram of alginate lyase Alg1987

2.2 基因克隆及表達載體的構建

圖4 瓊脂糖凝膠電⒕結果Fig.4 Results of agarose gel electrophoresis

以海洋弧菌Vibriosp.X511的總DNA為模板進行PCR擴增，結果見圖4。由圖4a可知，得到的擴增產物長度約800bp，采用NCBI將目的基因的序列與測序結果進行在線比對，結果顯示兩者的相似度為100%，說明已成功獲得目的基因；由圖4b可知，菌落PCR的凝膠電⒕結果顯示，多個大腸桿菌轉化子均能擴出與目的基因長度一致的條帶，初步證明目的基因已成功導入受體菌。由圖4c可知，提取菌落PCR驗證結果為陽性轉化子的質粒，用Nde玉和Xho玉雙酶切質粒，以空載的pET-30（a）質粒為對照，經0.4%瓊脂糖凝膠電⒕后發現重組質粒中含有與目的基因大小一致的片段（圖4c中1號⒕道），進一步說明目的基因可能已成功導入了質粒中。將質粒送至生物公司測序并比對，顯示該質粒中存在與目的基因相似度為100%的DNA片段，重組質粒構建成功，-80℃甘油保藏含目的基因的Trans5α克隆載體。

2.3 褐藻膠裂解酶的表達優化

2.3.1 誘導溫度及時間

分別優化重組菌的誘導劑添加量及誘導時間，結果見圖5。由圖5可知，在誘導時間4 h以內，3組不同的誘導溫度對重組菌表達褐藻膠裂解酶幾乎沒有影響；隨著培養時間的延長，重組菌在較低誘導溫度下表達的褐藻膠裂解酶粗酶活性較高；在誘導溫度為16℃時，重組菌經16 h的誘導后，其超聲破碎細胞液上清中的褐藻膠裂解酶活性達到最大值，繼續誘導至24 h，酶活性無明顯變化；在誘導溫度分別為25℃和37℃條件下誘導8h時，重組菌的破碎細胞液中開始出現包涵體，且褐藻膠裂解酶粗酶活性明顯較低。故選擇誘導溫度16℃，誘導時間16 h為誘導條件。

圖5 不同誘導溫度對重組菌表達褐藻膠裂解酶的影響Fig.5 Effects of different induction temperatures on the expression of aginate lyase in recombinant bacteria

圖6 不同誘導溫度下的重組菌破碎細胞液上清Fig.6 Supernatant of recombinant bacteria cytosol at different induction temperatures

分別取16℃、25℃及37℃誘導溫度條件下誘導16 h的重組菌破胞液上清進行SDS-PAGE電⒕，結果見圖6。由圖6可知，重組菌在3個不同誘導溫度下大量表達的蛋白質分子質量大小一致且與預測值（約30 kDa）相近，檢測發現樣品1，2，3均有褐藻膠裂解酶活性，而樣品4（空載）無酶活性，說明重組大腸桿菌正確表達了褐藻膠裂解酶基因alg1987。

2.3.2 誘導劑濃度

將重組菌在IPTG終濃度分別為0、0.2 mmol/L、0.4mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L條件下下于16℃誘導16 h，收集菌體，超聲波破碎細胞，離心后得到的上清液中褐藻膠裂解酶粗酶活性結果見圖7。由圖7可知，當誘導劑濃度介于0～0.2mmol/L時，不同IPTG濃度下破胞液上清中檢出的粗酶活性較為穩定，酶活性較低，約為最高值的45%；隨著IPTG濃度的升高，重組菌的褐藻膠裂解酶活性也呈上升趨勢，并在濃度為0.8 mmol/L時達到最大；當IPTG濃度高于0.8 mmol/L時，酶活性迅速下降，推測0.8 mmol/L可能為該重組菌耐受的IPTG臨界濃度。

圖7 IPTG濃度對表達的影響Fig.7 Effect of IPTG concentration on expression

綜合上述的優化結果，選擇誘導溫度16℃、誘導時間16 h、誘導劑濃度為0.8 mmol/L為重組菌的表達褐藻膠裂解酶的最佳誘導條件。

3 結論

褐藻膠及其寡糖具有很大的應用潛力，但目前從自然環境中篩選到的大多數產褐藻膠裂解酶菌株的酶活性較低，產物復雜，分離純化難度大，生產成本高，不利于褐藻膠裂解酶的規模化應用。利用基因工程手段將褐藻膠裂解酶基因導入遺傳背景清晰的工程菌株獲得高產的重組菌，使褐藻膠裂解酶的工業化大規模生產成為可能。

以本實驗室篩選的海洋弧菌X511的基因組DNA為模板，克隆得到了褐藻膠裂解酶基因alg1987；經NCBI數據庫同源比，下載與Alg1987同源性較高的序列，構建了進化樹，發現該酶同源性最高（79%）的蛋白屬于褐藻膠裂解酶PL7家族，推測Alg1987可能為褐藻膠裂解酶PL7家族中的一個新型酶；采用生物信息學工具預測褐藻膠裂解酶Alg1987的分子質量為30 254.28 Da，等電點8.75，分子式為C1368H2100N364O401S6；選用PET-30（a）為載體構建重組質粒并轉化大腸桿菌BL21，利用IPTG誘導重組菌的表達，SDSPAGE凝膠電⒕檢測誘導后重組菌的破碎細胞液上清，顯示異源表達的褐藻膠裂解酶Alg1987與預測的分子質量大小一致。優化表達條件以提高重組菌中褐藻膠裂解酶的表達效率，得到的最適條件為：誘導溫度16℃，誘導時間16 h，誘導劑IPTG濃度0.8 mmol/L。本研究為菌株海洋弧菌Vibriosp.X511產褐藻膠裂解酶Alg1987的大量制備及酶學性質研究打下了基礎。

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Conditions optimization of gene cloning and expression of alginate lyase

XU Chao1,2,HUANG Guiyuan1,WANG Qiaozhen1,LU Mingqian1,ZHANG Rongcan3,LIAO Wei4,ZHANG Yunkai2*,HUANG Shushi1
（1.Guangxi Key Laboratory of Marine Natural Products and Combinatorial Biosynthesis Chemistry,Guangxi Academy of Sciences,Nanning 530007,China;2.College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530003,China;3.Guangxi Beibu Gulf Marine Research Centre,Nanning 530007,China;4.Guangxi Vocational and Technical College,Nanning 530226,China）

The alginate lyase gene in marineVibriosp.X511 was expressed byEscherichia colito realize the large-scale preparation of alginate lyase and research enzymatic properties.By analyzing the sequence,the first 20 amino acids of the enzyme were predicted as the signal peptide,the protein molecular mass without the signal peptide was 30 254.28 Da,the isoelectric point was 8.75,the molecular formula was C1368H2100N364O401S6,and the corresponding gene sequence was named asalg1987.The construction program of bacteria recombination was as follows:the specific nucleic acid primers were designed and thealg1987was obtained by PCR;the recombinant plasmid pET-30（a）-alg1987was introduced intoE.coliTrans5α for sequencing;the positive plasmid pET-30（a）-alg1987was extracted and introduced intoE.coliBL21,then expressed by the induce of IPTG.The supernatant of recombinant bacteria cytosol was induced and detected by SDS-PAGE,it was found that the molecular mass of the alginate lyase by heterologous expression was similar to the predicted value.The expression conditions of alginate lyase in recombinant bacteria were optimized.The results showed that optimum parameters were as follows:induction temperature 16℃,time 16 h,induction agent IPTG concentration 0.8 mmol/L.

alginate lyase;gene;cloning;conditions optimization;expression

Q814

0254-5071（2017）12-0120-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.025

2017-09-13

國家自然科學基金（31560017）；廣西自然科學基金重點項目（2014GXNSFDA118012）；廣西科技計劃重點研發項目（桂科AB16380071）；廣西科技計劃科技基地和人才專項（桂科AD17129019）

許 超（1991-），男，碩士研究生，研究方向為海洋微生物。

*通訊作者：張云開（1972-），男，副研究員，博士，研究方向為微生物工程。