生物轉化提高黃芪多糖含量的發酵條件優化

陳 弘，鄭衛紅，楊勝利*

（1.浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014；2.湖州師范學院 生命科學院，浙江 湖州 313000）

生物轉化提高黃芪多糖含量的發酵條件優化

陳 弘1，鄭衛紅2，楊勝利1*

（1.浙江工業大學 藥學院，浙江 杭州 310014；2.湖州師范學院 生命科學院，浙江 湖州 313000）

以黑曲霉（Aspergillus niger）為出發菌株，黃芪提取液為唯一碳源進行生物轉化。在單因素試驗的基礎上采用正交試驗設計，以黃芪多糖含量為指標對發酵條件中的發酵時間、發酵溫度、起始pH及搖床轉速進行優化。結果表明，在起始pH 5.0、發酵溫度30℃、搖床轉速180 r/min的條件下發酵6 d，黃芪多糖含量最高，為（2.473±0.062）g/L。利用紅外光譜分析發酵前后黃芪多糖的結構變化，結果表明發酵前后黃芪多糖的結構沒有發生較大變化。

黃芪提取液；正交試驗；發酵條件優化；紅外光譜

黃芪（Astragalus memberanaceus）是一種常用的中藥，含有多糖、生物堿、氨基酸、黃酮類、苷類等多種生物活性物質，其中黃芪多糖（Astragalus polysacharides，APS）是其主要生物活性成分。黃芪多糖的組成主要為葡聚糖和雜多糖，目前認為其單糖種類主要包括L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖和D-甘露糖等。 黃芪多糖作為一類生物大分子成分，具有提高免疫力、抗病毒、抗菌、抗氧化、調節血糖等多方面的生物活性與功能[1-5]。

隨著傳統中藥的推廣和普及，人們對黃芪等中藥的需求量不斷增加，通過改善其生長條件提高其中有效物質含量成為越來越熱門的研究方向。20世紀80年代后期人們發現了微生物和植物之間有機結合的中藥生產工藝，利用微生物的代謝作用，對中藥中的有效成分進行轉化和利用，從而提高了其有效成分的含量，起到減毒增效的作用[6-9]。

以中藥為基質進行固態發酵，提高多糖含量的研究有所報道[10-12]，但是以中藥提取物進行發酵的研究未見報道。本試驗采用液體深層發酵技術，選用安全的黑曲霉為發酵菌種，以中藥黃芪提取物為基質進行發酵，比較發酵前后多糖的變化，為新藥的研發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芪：河北金開中藥材有限公司；黑曲霉（Aspergillus niger）：浙江工業大學生物制藥實驗室；葡萄糖、蔗糖、NaNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O（均為分析純）：廣東光華科技股份有限公司；KCl（分析純）：上海凌峰化學試劑有限公司；FeSO4（分析純）：天津福晨化學試劑廠；苯酚（分析純）：杭州雙林化工試劑廠；H2SO4（分析純）：西隴科學股份有限公司。

種子培養基：NaNO33 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO40.01 g/L，蔗糖30 g/L。

發酵培養基：黃芪提取液多糖1.4 g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO34g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O0.8g/L，KCl0.6g/L。

1.2 儀器與設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南㈣華儀器有限公司；SWCJ-1F單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；UV-1402053紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；HXBL-38立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫用核子儀器有限公司；ZHWY-2102C恒溫培養搖床：上海智誠分析儀器制造有限公司；SC-3610低速離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃芪提取液的制備

用高速粉碎機將黃芪藥材粉碎至100目。黃芪粉末以1∶20（g∶mL）的固液比與蒸餾水混合，90 ℃條件下冷凝回流提取150 min。將黃芪提取液4 000 r/min離心10 min，除去殘渣后取上清液冷藏備用[13-15]。

1.3.2 種子液的制備

從斜面保藏培養基中挑取適量菌落接種于100 mL種子培養基中，在32℃、160 r/min條件下培養48 h，作為種子液備用。

1.3.3 黃芪提取液發酵條件優化單因素試驗

將種子液以10%的接種量接入100 mL發酵培養基中，分別考察發酵時間（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）、發酵溫度（30℃、32℃、34 ℃、36℃、38 ℃）、起始pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）、搖床轉速（160 r/min、170 r/min、180 r/min、190 r/min、200 r/min）對發酵液中黃芪多糖含量的影響。

1.3.4 黃芪提取液發酵條件優化正交試驗

根據單因素試驗的結果，以黃芪多糖含量為指標，采用正交試驗法[16-17]考察發酵時間（A）、發酵溫度（B）、起始pH（C）、搖床轉速（D）4個因素對黃芪多糖含量的影響。正交試驗因素與水平見表1。

表1 黃芪提取液發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization ofAstragalusextract

1.3.5 黃芪多糖含量的測定方法

精確稱取無水D-葡萄糖100mg，加水溶解定容于100mL容量瓶中，搖勻得1 mg/mL的葡萄糖標準液。精密吸取葡萄糖標準液2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL于100 mL容量瓶中，定容搖勻。精密吸取上述各溶液2 mL于具塞試管中，分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，立即加入濃硫酸5.0mL，振蕩2 min后放入沸水浴中加熱15 min，然后放入冷水浴中冷卻30 min，以蒸餾水作為空白對照，在波長490nm處測定吸光度值，繪制葡萄糖標準曲線[18]。根據葡萄糖標準曲線回歸方程計算發酵液中黃芪多糖的含量。1.3.6紅外光譜檢測

將發酵前后的黃芪多糖粗提樣干燥至無水的粉末狀態，利用紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內掃描測定紅外光譜。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的建立

以葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，建立葡萄糖標準曲線，結果如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標準曲線的回歸方程為y=15.643x+0.033 9，相關系數R2=0.994。結果表明，葡萄糖質量濃度與吸光度值之間呈現較好的線性關系。

2.2 發酵條件優化單因素試驗

2.2.1 起始pH對黃芪多糖含量的影響

黑曲霉生長的最適pH范圍為4.0～6.0。考察發酵培養基起始pH對黃芪多糖含量的影響，結果如圖2所示。

圖2 起始pH對黃芪多糖含量的影響Fig.2 Effect of initial pH of fermentation medium onAstragalus polysaccharide content

由圖2可知，起始pH在3.0～5.0之間對黃芪多糖含量的影響不大，并且當起始pH值為5.0時，黃芪多糖的含量最高，為（1.984±0.039）g/L，說明該黑曲霉生長的最適起始pH范圍為3.0～5.0。之后隨著起始pH的升高，黃芪多糖的含量明顯下降。因此，選擇起始pH值為5.0。

2) z方向升降臺調整標準件的位置，同時對激光二維掃描傳感器的高度也進行調整，使標準件處于激光二維掃描傳感器的測量范圍內；

2.2.2 搖床轉速對黃芪多糖含量的影響

通過調節搖床轉速來改變溶解氧，考察不同的搖床轉速對黃芪多糖含量的影響，結果如圖3所示。

圖3 搖床轉速對黃芪多糖含量的影響Fig.3 Effect of shaker speed onAstragaluspolysaccharide content

由圖3可知，隨著搖床轉速的增大，黃芪多糖含量增加。當搖床轉速為190r/min時，黃芪多糖含量為（2.045±0.048）g/L，之后黃芪多糖含量的增加明顯減緩，說明190 r/min的搖床轉速已經能夠滿足黑曲霉生長發酵的耗氧需求。因此，選擇搖床的轉速為190 r/min。

2.2.3 發酵溫度對黃芪多糖含量的影響

在最適溫度下有利于微生物的生長和發酵。考察發酵溫度對黃芪多糖含量的影響，結果如圖4所示。

圖4 發酵溫度對黃芪多糖含量的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature onAstragalus polysaccharide content

由圖4可知，隨著發酵溫度的升高，黃芪多糖的含量也隨之增加。當發酵溫度達到32℃時，黃芪多糖的含量為最大值（2.093±0.041）g/L，隨著發酵溫度繼續升高，黃芪多糖的含量明顯降低，說明32℃是黑曲霉內酶參與代謝的最適發酵溫度。因此，選擇發酵溫度為32℃。

2.2.4 發酵時間對黃芪多糖含量的影響

由圖5可知，隨著發酵時間的增加，黃芪多糖的含量先增加再減少，在發酵5 d時達到最大值（2.093±0.073）g/L。之后由于培養基中營養成分不足，菌體生長利用了積累的代謝產物，所以導致黃芪多糖含量下降。因此，選擇發酵時間為5 d。

圖5 發酵時間對黃芪多糖含量的影響Fig.5 Effect of fermentation time onAstragaluspolysaccharide content

2.3 發酵條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，通過3因素3水平正交試驗考察發酵時間（A）、發酵溫度（B）、起始pH（C）、搖床轉速（D）對黃芪多糖含量的影響。正交試驗結果見表2，方差分析見表3。

表2 黃芪提取液發酵工藝優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization ofAstragalusextract

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2、表3可知，發酵條件為A3B1C1D2，即發酵時間6d、發酵溫度30℃、起始pH 5.0、搖床轉速180 r/min，在此條件下黃芪多糖的含量達到（2.473±0.062）g/L。FA=125.56，FB=4.44，FC=27.22，FD=10.27，按α=0.05的檢驗標準F0.05（2，2）=19。其中FA和FC＞F0.05（2，2），所以因素A（發酵時間）和因素C（起始pH）有顯著性（P＜0.05）。

2.4 紅外光譜檢測

發酵前后黃芪多糖粗提物的紅外光譜如圖6所示。

圖6 發酵前（A）、后（B）黃芪多糖粗提物的紅外光譜Fig．6 Infrared spectroscopy of crude extract ofAstragalus polysaccharide before （A）and after（B）fermentation

由圖6可知，在4000～400cm-1波長范圍內，發酵前的黃芪多糖粗提物于3384cm-1、2929cm-1、1648cm-1、1416cm-1、1 021 cm-1、854 cm-1、573 cm-1處有明顯吸收峰，為糖類化合物的一般吸收峰，發酵后的黃芪多糖粗提物的吸收峰與發酵前較為相似，除了后者在1 500～1 200 cm-1之間有多個特征吸收峰，可能是因為（-CH3）上的C-H鍵斷裂形成C-N鍵或者（-CH3）上的H被NO2取代，其余吸收峰范圍基本一致（3 390～3 384 cm-1、2 929～2 928 cm-1、1 648～1 644 cm-1、1 542～1 536 cm-1、787～760 cm-1、523～518 cm-1）[19-21]。

3 結論

本研究以黑曲霉（Aspergillus niger）為出發菌株，黃芪提取液為唯一碳源進行生物轉化。對發酵條件中的發酵時間、發酵溫度、起始pH及搖床轉速進行了優化，得到較優的發酵條件為起始pH 5.0，發酵溫度30℃，搖床轉速180 r/min，發酵時間6 d。在該條件下發酵所得黃芪多糖含量為（2.473±0.062）g/L。利用紅外光譜對發酵前后黃芪多糖結構進行分析，證明發酵前后黃芪多糖的結構沒有發生較大變化。

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Optimization of fermentation conditions for increasingAstragaluspolysaccharide contents by biotransformation

CHEN Hong1,ZHENG Weihong2,YANG Shengli1*
（1.College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China;2.College of Life Science,Huzhou University,Huzhou 313000,China）

The biotransformation was carried out withAspergillus nigeras the starting strain andAstragalusextraction as the only carbon source.The orthogonal experiments were designed on the basis of single factor experiments.The optimized fermentation conditions were investigated by orthogonal experiments with the content ofAstragaluspolysaccharide as the index which was determined by fermentation time,temperature,initial pH and shaker speed.The results showed that the content ofAstragaluspolysaccharide was the highest of（2.473±0.062）g/L and the concentration of polysaccharide was increased by 76%under the conditions of initial pH 5.0,fermentation temperature 30℃,shaker speed 180 r/min and fermentation time 6 d.The structural changes ofAstragaluspolysaccharides before and after fermentation were analyzed by infrared spectroscopy,and the results showed that there was little change in structurae ofAstragaluspolysaccharides before and after fermentation.

Astragalusextract;orthogonal experiments;fermentation conditions optimization;infrared spectroscopy

TQ920.9

0254-5071（2017）12-0130-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.027

2017-10-17

陳 弘（1993-），男，碩士研究生，研究方向為微生物制藥。

*通訊作者：楊勝利（1972-），男，副教授，博士，研究方向為微生物制藥。