苯并咪唑混合離子液體在孔雀石綠及結晶紫檢測中的應用

吳永寶，洪 霞，錢瀅文，高志瑩，劉 琦，周鑫魁*

（1.甘肅省商業科技研究所，甘肅 蘭州 730010；2.甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司，甘肅 蘭州 730010）

苯并咪唑混合離子液體在孔雀石綠及結晶紫檢測中的應用

吳永寶1，2，洪 霞1，2，錢瀅文1，2，高志瑩1，2，劉 琦1，2，周鑫魁1，2*

（1.甘肅省商業科技研究所，甘肅 蘭州 730010；2.甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司，甘肅 蘭州 730010）

以1-芐基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸鹽作為萃取試劑，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽作為輔助溶劑及載體，按照1∶9（V/V）混合，得到混合離子液體。利用混合離子液體液-液分散萃取養殖水及水產品中的孔雀石綠及結晶紫，并優化萃取條件。通過高效液相色譜-熒光檢測器檢測孔雀石綠及結晶紫的含量。結果表明，選擇混合型離子液體進行吸附，以乙腈為分散劑，采用液-液分散萃取，在pH值為4～8的環境下對目標物進行萃取，效果良好。孔雀石綠和結晶紫回收率分別為90.16%～93.73%和90.25%～93.88%，相對標準偏差（RSD）分別為1.42%和1.63%。表明所建立的樣品前處理方法及檢測方法準確度高，可用于孔雀石綠及結晶紫的檢測。

苯并咪唑混合離子液體；孔雀石綠；結晶紫；液-液分散萃取；高效液相色譜

孔雀石綠、結晶紫是一種N-甲基三苯甲烷類染料，由于其抗菌效果好、價格便宜、容易獲得，曾被廣泛用于防治水產動物的真菌病、細菌病和寄生蟲病等。由于孔雀石綠、結晶紫在生物體內的代謝產物分別為隱色孔雀石綠、隱色結晶紫，其具有高毒性、高致癌、高致畸、致突變等副作用[1-2]。我國于2002年5月將孔雀石綠、結晶紫列入《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》中。目前，檢測孔雀石綠的方法有免疫法[3-4]、表面增強拉曼光譜法（surface enhanced raman scattering，SERS）、紫外光譜法、熒光光譜法[5]、量子點熒光淬滅法[6]、液相色譜-質譜聯用法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[7]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[8-9]、電化學發光分子印跡法[10]等。液相色譜法和液相色譜-質譜串聯法自動化程度高，儀器重復性好，被廣泛應用。但實際試驗過程中需要對樣品進行比較繁瑣的樣品前處理工作，實驗過程可能出現二氯甲烷層忽上忽下[11]，易乳化等現象，耗時長，穩定性差，回收率不高等。因此很有必要建立一種簡單、快捷、穩定、回收率高的樣品前處理提取方法。

根據陰離子種類不同，離子液體可以表現出親水性和憎水性；而根據陽離子結構不同，可以表現出不同程度的共軛性或根據陽離子支鏈鑲嵌官能團不同，被廣泛應用在分離、萃取、合成、催化等方面[12]。其中烷基咪唑類離子液體常被用于萃取和富集苯及苯的衍生物等[13-14]。但是咪唑環共軛程度較低，對共軛結構的物質吸附效果不夠理想。然而苯并咪唑類離子液體具有很高的共軛性，可以吸附具有共軛結構的有機分子[15-16]。所以考慮利用苯并咪唑類離子液體富集萃取樣品中的孔雀石綠及結晶紫，然而，苯并咪唑類離子液體室溫下呈白色固體的性狀，無法有效地提取樣品中的目標物。因此，選擇將苯并咪唑離子液體和咪唑類離子液體按一定比例混合使用，既可滿足液體的流動性，也可滿足對目標化合物的吸附性。

混合離子液體對目標物吸附性的表現方式也極其重要，常用液-液萃取、固相萃取等。液-液分散萃取因其所需溶劑量小，萃取速度快，富集倍數高，操作簡單和環境友好等優點[17-18]，已成為一種新型且具有潛力的分離富集手段。本研究在此基礎上建立了混合離子液-液分散萃取法萃取樣品中孔雀石綠及結晶紫的方法，并對液-液分散萃取條件進行了優化，以期建立一種對孔雀石綠及結晶紫操作簡便、穩定性好、回收率更高的檢測方法，并為混合離子液體在液-液分散萃取技術研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孔雀石綠標準品（純度99.5%）、結晶紫標準品（純度99.7%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；硼氫化鉀（分析純）：上海中秦化學試劑有限公司；乙腈（色譜純）：北京百靈威科技有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽、1-芐基-3-乙基苯并咪唑溴化鹽：按參考文獻[15]本實驗室自主合成；六氟磷酸鹽（分析純）：阿拉丁試劑上海有限公司；魚、蝦、養殖水樣品：蘭州市區綜合市場、水產市場及超市。

1.2 儀器與設備

RX-II離心機：天美中國科學儀器有限公司；20A高效液相色譜儀：日本島津企業管理中國有限公司；XB220電子天平：普利賽斯國際貿易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶劑的配制

稱取1-芐基-3-乙基苯并咪唑溴化鹽20 g溶于水中，邊攪拌邊滴加飽和六氟磷酸鹽水溶液，出現白色絮狀沉淀，滴加至不產生沉淀，即停止滴加，抽濾，并用水多次洗滌濾餅，70℃真空干燥，得到白色粉末狀固體，即為1-芐基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸鹽。分別稱取1-芐基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸鹽5.00 g和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽溶液45.00 mL，置于雞心瓶中，加入100 mL乙腈，溶解1-芐基-3-乙基苯并咪唑六氟磷酸鹽和1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，70℃旋轉蒸發60 min，去除乙腈，得到無色透明黏稠的液體，即為混合離子液體。稱取0.54 g硼氫化鉀，溶于50 mL超純水中，得到還原劑，現用現配。

1.3.2 樣品前處理方法[7-8]

待檢測樣品制備：魚類樣品，去除魚鱗，取背部魚肉在勻漿機中打成肉泥；蝦類樣品，去除蝦殼和蝦頭，取所有蝦肉在勻漿機中打成肉泥；養殖水樣可直接稱取。

對制備好的樣品進行液-液分散萃取。稱取5.00 g待檢測樣品于離心管中，按順序加入20mL乙腈作為混合離子液體液-液分散萃取的分散劑，1.00mL混合離子液體和10 mL還原劑，10000r/min均質1min，超聲提取5min，10000r/min離心3min，得上清液和沉淀物，將該上清液轉入雞心瓶中，用5 mL乙腈洗滌沉淀物，將洗滌后的溶液合并到盛放上清液的雞心瓶中，50℃旋轉蒸發5 min，除去分散劑乙腈，出現明顯分層，上層為水層，下層為混合離子液體，將雞心瓶中液體于4℃、10 000 r/min離心3 min，取下層液過孔徑為0.45 μm的濾膜后，備用待高效液相色譜檢測。

1.3.3 萃取條件的優化

按照1.3.2操作方法處理10份加標樣品，合并上清液至雞心瓶后，調節雞心瓶中液體pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。在進行旋轉蒸發、離心、過膜操作后待高效液相色譜測定。

采用常規液-液萃取、鹽析萃取、混合離子液體液-液分散萃取3種萃取方式，對比3種萃取方式對目標物的回收率。

常規液-液萃取：稱取5.00 g待檢測樣品于離心管中，按順序加入20 mL乙腈和10 mL還原劑，10 000 r/min均質1min，超聲提取5 min，10 000 r/min離心3 min，得上清液和沉淀物，將該上清液轉入雞心瓶中，用5 mL乙腈洗滌沉淀物，將洗滌后的溶液合并到盛放上清液的雞心瓶中，50℃旋轉蒸發5 min，除去乙腈，在剩余液體中加入1.00 mL混合離子液體渦旋提取5 min，將所有液體于4℃、10 000 r/min離心3 min，取下層液過孔徑為0.45 μm的濾膜后，備用待高效液相色譜檢測。

鹽析萃取：稱取5.00 g待檢測樣品于離心管中，加入4 g氯化鈉，其余步驟同常規液-液萃取。

混合離子液體液-液分散萃取：分別以乙腈、1%十二烷基硫酸鈉水溶液、1%吐溫-20水溶液為分散劑，按照1.3.2方法處理5份加標樣品，分析對比使用不同分散劑的回收率。

1.3.4 高效液相色譜檢測方法

檢測條件：色譜柱C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙酸銨緩沖液（pH=3.5）∶乙腈為20∶80（V/V）；流速：1mL/min；柱溫：35℃；進樣量：20 μL；激發波長：265 nm，發射波長：360 nm。

1.3.5 定性定量分析

以混合離子液體為溶劑，配制不同質量濃度的孔雀石綠及結晶紫混合標準溶液，依次分別為0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL。以標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標，繪制孔雀石綠及結晶紫標準溶液的工作曲線；根據測得的樣品制備液的峰面積值，計算孔雀石綠及結晶紫的含量，待測水及水產品中孔雀石綠及結晶紫含量的計算公式如下：

式中：X表示試樣中的孔雀石綠或結晶紫含量，ng/g；C1表示測得的樣品制備液的峰面積所對應的孔雀石綠或結晶紫的含量，ng/mL；C0表示試樣空白液中孔雀石綠或結晶紫的含量，ng/mL；m表示試樣質量，g；V表示所用混合離子液體的體積，mL。

2 結果與分析

2.1 標準溶液及樣品高效液相色譜檢測結果

采用高效液相色譜法檢測孔雀石綠及結晶紫標準溶液和樣品，結果如圖1所示。

圖1 孔雀石綠及結晶紫標準溶液（a）及樣品（b）高效液相色譜圖Fig．1 HPLC chromatography of standard solution （a）and sample （b）of malachite green and crystal violet

由圖1可知，孔雀石綠和結晶紫標準溶液的出峰時間分別為10.577 min和11.323 min，樣品中孔雀石綠和結晶紫的出峰時間分別為10.547 min、11.293 min，孔雀石綠及結晶紫峰型對稱，有較好的分離度，該波長下熒光信號響應強，說明該色譜條件能完全滿足孔雀石綠及結晶紫的分離和檢測。

2.2 提取液pH值對萃取效果的影響

考察樣品提取液pH值對混合離子液體萃取效果的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知，當樣品提取液pH值范圍在6.0～8.0時，萃取效果最好；當pH值從4.0～8.0變化時，萃取效率僅增加了不到2%，說明該混合離子液體對目標物的富集作用受pH值影響很小。孔雀石綠及結晶紫分子結構中并不含有可以成鹽的酚羥基或者羧基，pH值的變化也不會改變兩者分子狀態，所以在較寬的pH值范圍內，混合離子液體對兩種目標物的富集效果基本不變，在萃取過程中不需要調節pH值，操作更簡便。

圖2 提取液pH對混合離子液體萃取效果的影響Fig．2 Effect of extracting solution pH on extraction of mixed ionic liquid

2.3 離子液體選擇

考察不同種類離子液體對目標物萃取效果的影響，結果如表1所示。

表1 不同離子液體對目標物萃取效果的影響Table 1 Effect of different ionic liquids on the extraction of target objects

由表1可知，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽萃取目標物，回收率＜79%；1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽萃取目標物，回收率＜74%；由于1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽較1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽在結構上增加了更長的直鏈烷烴，共軛程度變弱，萃取效果略微降低。混合離子液體萃取效果明顯強于其他兩種常規離子液體，這說明常規離子液體對目標物有一定的富集作用，但是由于共軛性弱，導致吸附能力不如共軛程度較高的苯并咪唑離子液體。因此，選用混合型離子液體吸附目標物。

2.4 萃取方式對萃取效果的影響

考察不同萃取方式對混合離子液體萃取效果的影響，結果見表2。

表2 萃取方式對萃取效果的影響Table 2 Effects of extraction method on extraction

由表2可知，對孔雀石綠回收率常規液-液萃取最低，鹽析法萃取次之，液-液分散萃取效果最優；對結晶紫回收率鹽析法萃取最低，常規液-液萃取次之，液-液分散萃取效果最優。由于預先將混合離子液體溶于乙腈，再均勻的分散在提取液中，混合離子液體與目標物分子充分接觸，增大萃取效率，達到最優萃取效果。因此，選擇液-液分散萃取方式對孔雀石綠和結晶紫進行萃取。

2.5 不同種類分散劑對萃取效果的影響

考察不同分散劑對混合離子液體萃取效果的的影響，回收率計算結果見表3。

表3 不同分散劑對萃取效果的影響Table 3 Effects of different dispersants on extraction

由表3可知，以十二烷基磺酸鈉水溶液為分散劑，孔雀石綠回收率為53.7%～62.5%，結晶紫回收率為52.8%～60.7%；以吐溫-20水溶液為分散劑，孔雀石綠回收率為59.3%～64.4%，結晶紫回收率為51.7%～59.3%；乙腈作為分散劑回收率最好，且明顯高于其他兩種分散劑。乙腈作為分散劑更容易除去，離心后得到離子液體更多，回收率更高。因此，選擇乙腈作為該實驗過程中的分散劑。

2.6 線性方程、線性范圍、相關性系數及最低檢出限

配制不同質量濃度的孔雀石綠及結晶紫混合系列標準溶液，按照1.3.4方法采用高效液相色譜法檢測，得到質量濃度對應的色譜峰面積，繪制標準工作曲線，分別得到孔雀石綠及結晶紫標準回歸方程及方程相關系數（R2）。以3倍信噪比對應的質量濃度為儀器最低檢出限，樣品按5倍濃縮處理，可以計算出相應的方法檢出限，結果見表4。

表4 孔雀石綠及結晶紫的線性回歸方程、相關性系數、線性范圍及檢出限Table 4 Linear regression equation，correlation coefficient，linearity range and detection limit of malachite green and crystal violet

由表4可知，該方法線性范圍較寬，線性關系良好（相關系數R2＞0.999），方法檢出限低，均達到0.02 ng/g，適用于痕量檢測和微量檢測。由于離子液體不易揮發，進樣體積穩定，且對目標物進行5倍濃縮富集，以便提高靈敏度，得到更低檢出限。

2.7 回收率及重復性試驗

在樣品中加入不同質量濃度的標準溶液，試驗平行5次。按照1.3方法進行樣品處理和檢測。計算每種添加水平的平均回收率和相對標準偏差（relativestandarddeviation，RSD），結果見表5。

表5 回收率試驗結果Table 5 Results of recovery rate tests

由表5可知，本方法孔雀石綠和結晶紫的回收率分別為90.16%～93.73%和90.25%～93.88%，回收率較高。文獻[11]提供的方法的孔雀石綠和結晶紫的回收率為78.3%～100.9%，國標方法的孔雀石綠和結晶紫的回收率為75%～85%，可見，用現有方法測定水和水產品中孔雀石綠及結晶紫時，孔雀石綠和結晶紫的回收率不夠穩定。回收率結果的RSD值＜2.00%，表明該方法準確度高，可用于樣品中孔雀石綠及結晶紫的檢測。

2.8 樣品中孔雀石綠和結晶紫的檢測

在市場及超市隨機抽取25份魚肉樣品，10份蝦肉樣品，5份養殖水樣品，檢測其中孔雀石綠及結晶紫含量，結果見表6。

表6 市售水產品中孔雀石綠及結晶紫的檢測結果Table 6 Detection results of malachite green and crystal violet in aquatic products sold in the market

由表6可知，有一例鯉魚樣品檢測出孔雀石綠。不合格率為2.5%，雖然孔雀石綠及結晶紫為非法添加藥物，但市場中流通樣品種類及數量非常龐大，仍然有少部分不法商販在使用一些危害性很高的禁用藥物。

3 結論

本試驗采用共軛性高的苯并咪唑混合型離子液體液-液分散萃取技術對樣品進行前處理預分離，用液相色譜方法分析養殖水及水產品中殘留孔雀石綠及結晶紫。本試驗優化了萃取pH值、萃取方式、離子液體種類、分散劑種類等條件，縮短了分析時間，提高了分析效率。結果表明，孔雀石綠和結晶紫的回收率分別為90.16%～93.73%和90.25%～93.88%，相對標準偏差（RSD）值＜2.00%，表明該方法對孔雀石綠及結晶紫的檢測準確、可靠，適應大規模樣品的快速分析要求。本研究為離子液體液-液分散萃取在食品安全方面的應用提供參考。

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Application of benzimidazole mixed ionic liquids in the detection of malachite green and crystal violet

WU Yongbao1,2,HONG Xia1,2,QIAN Yingwen1,2,GAO Zhiying1,2,LIU Qi1,2,ZHOU Xinkui1,2*
（1.Gansu Institute of Business and Technology,Lanzhou 730010,China;2.Gansu Zhongshang Food Quality Test and Detection Co.,Ltd.,Lanzhou 730010,China）

With 1-benzyl-3-ethyl benzimidazole hexafluorophosphate as extraction reagent,1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate as auxiliary solvent and carrier,mixing with 1∶9 （V/V）,the mixed ionic liquid was obtained.The extraction conditions of the malachite green and crystal violet in aquaculture water and aquatic products were optimized by mixed ion liquid liquid-liquid dispersion extraction.The contents of the malachite green and crystal violet were detected by high performance liquid chromatography-fluorescence detector.The results showed that selecting the mixed ion liquid for adsorption,with acetonitrile as a dispersant,the target objects were extracted in pH 4-8 by liquid-liquid dispersion extraction,and the extraction effect was good.The recovery rate of malachite green and crystal violet were 90.16%-93.73%and 90.25%-93.88%,respectively.The relative standard deviation （RSD）were 1.42%and 1.63%,respectively,which indicated that the established sample preparation method and detection method had high accuracy,and could be used for the detection of malachite green and crystal violet.

benzimidazole mixed ionic liquids;malachite green;crystal violet;liquid-liquid dispersive extraction;HPLC

TB34

0254-5071（2017）12-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.034

2017-06-24

甘肅省科技計劃資助（1606RTSA337，1309RTSA025，1605JTCA011）；甘肅省公共安全檢驗檢測服務平臺項目

吳永寶（1989-），男，工程師，碩士，主要從事食品檢測工作。

*通訊作者：周鑫魁（1986-），男，工程師，碩士，主要從事有機合成、食品檢測工作。