廣州市售瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌污染現狀及其耐藥現象研究

周臣清，張 娟，黃寶瑩，佘之蘊，范安妮，趙 玲

（廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 佛山 528300）

廣州市售瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌污染現狀及其耐藥現象研究

周臣清，張 娟，黃寶瑩，佘之蘊，范安妮，趙 玲

（廣東產品質量監督檢驗研究院，廣東 佛山 528300）

為了解廣州市售瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌的污染現狀及其耐藥狀況，采用國標GB 8538—2016對抽查的392件瓶（桶）裝水樣品進行檢測，用革蘭氏陰性菌藥敏卡片（AST-GN09）對陽性菌株進行藥敏實驗。結果表明，392件樣品中銅綠假單胞菌檢出率為5.1%，不合格樣品均為桶裝水，純凈水檢出率為6.3%，礦泉水檢出率為2.4%；按抽查月份分析，檢出率從高到低依次為：6月（16%）＞8月（7.0%）＞7月（5.6%）＞4月（3.8%）＞5月（2.0%）＞3月（0）；藥敏結果顯示，95%（19/20）的菌對所有11種抗生素完全敏感，并發現一株7重耐藥菌株。瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌污染與產品包裝方式極顯著相關（P＜0.01），而與產品過濾方式無關，6月的檢出率極顯著高于其他月份（P＜0.01），水源性銅綠假單胞菌抗生素耐藥性處于較低水平。

銅綠假單胞菌；瓶裝水；桶裝水；耐藥性

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種常見的環境微生物，為重要的食源性和水源性致病菌，其分布廣泛，具有很強的環境適應能力，且具有天然耐藥性[1]。近年來，時有成品水中檢出銅綠假單胞菌的報道，馬群飛等[2]在福建省80份礦泉水中18份檢出銅綠假單胞菌，檢出率為22.5%，魏磊等[3]在全國共9省采集108份水樣30份檢出銅綠假單胞菌，檢出率為31.5%，李莉等[4]在連云港市采集150件桶裝水檢出39件桶裝水，檢出率為26.0%。國外亦有相應報道，VARGA L[5]在匈牙利492份水樣7份檢出銅綠假單胞菌，檢出率為1.4%。國內外各地水中銅綠假單胞菌檢出率不盡相同，但均顯示了一定的污染率，而廣州地區尚未有系統的調查瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌的污染狀況。

銅綠假單胞菌具有多種致病因子，可以導致急性腸道疾病和皮膚炎癥的發生，抵抗力低下的群體飲用了被銅綠假單胞菌污染的瓶裝水很有可能導致相關疾病的發生[6]。由于抗生素的廣泛使用，在臨床上，銅綠假單胞菌一直是醫院內感染的主要致病菌之一，據張祎博等[7]的調查顯示，2014年在所有臨床分離株中銅綠假單胞菌占9.5%，其對各抗菌藥物的敏感率在38.5%～83.7%之間（2005～2014），且其中1.7%為泛耐藥菌株（即對所有抗生素耐藥）。銅綠假單胞菌具有高耐藥性的特點，而目前中國少有研究涉及食源性或水源性銅綠假單胞菌耐藥性的研究。

為了解廣州市售瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌污染情況，本研究采用國標GB 8538—2016《飲用天然礦泉水檢驗方法》共對廣州地區167家瓶裝水生產企業的392件瓶裝水樣品進行檢測，用革蘭氏陰性菌藥敏卡片（AST-GN09卡）對分離得到的銅綠假單胞菌進行藥敏試驗，以期為監管部門防控銅綠假單胞菌污染提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

革蘭氏陰性菌生化鑒定卡（GN卡）、革蘭氏陰性菌藥敏卡片（AST-GN09卡）（含實驗藥物）：法國梅里埃公司；0.45 μm濾膜：美國Millipore公司；假單胞菌瓊脂基礎培養基/CN瓊脂、乙酰胺肉湯、金氏B（King's B）培養基、鈉氏試劑、標準菌株銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginos）ATCC 27853和大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

VITEK 2 Compact微生物全自動鑒定系統：法國生物梅里埃公司；HTY-30B不銹鋼六聯過濾系統：浙江泰林生物技術股份公司；GHP-9160隔水式恒溫培養箱：上海一恒科技有限公司；CL-40M高壓蒸汽滅菌鍋：日本ALP公司。1.3方法

1.3.1 采樣及細菌分離

2017年3月至2017年8月，按照隨機抽樣法，從廣州市流通環節上銷售的各品牌瓶（桶）裝飲用水抽取392件尚在保質期內的樣品，其中純凈水268件，礦泉水124件。根據GB 8538—2016《飲用天然礦泉水檢驗方法》[8]，將250 mL水樣用孔徑為0.45 μm的濾膜過濾，然后用無菌鑷子將濾膜移至CN瓊脂培養基上，于（36±1）℃恒溫培養箱中培養48h，用微生物全自動鑒定系統對可疑菌進行確認。以銅綠假單胞菌ATCC27853作為陽性對照菌株，以大腸埃希氏菌ATCC25922作為陰性對照菌株。將分離得到的陽性菌株用甘油保存法保存于-70℃冰箱中。

1.3.2 抗生素敏感實驗

本研究采用法國梅里埃公司的革蘭氏陰性菌藥敏卡片（AST-GN09卡）對分離得到的20株銅綠假單胞菌進行藥敏試驗，試驗的藥物分別為：哌拉西林（piperacillin，PRL）、哌拉西林/他唑巴坦（tazobactam，TZP）、頭孢他啶（ceftazidime，CAZ）、鹽酸頭孢吡肟（cefepime，FEP）、亞胺培南（imipenem，IMP）、美羅培南（meropenem，MEM）、阿米卡星（amikacin，AMK）、慶大霉素（gentamicin，GEN）、妥布霉素（tobramycin，TOB）、環丙沙星（ciprofloxacin，CIP）和左氧氟沙星（levofloxacin，LVX）共11種抗生素，以銅綠假單胞菌ATCC 27853作為質控菌株。

2 結果與分析

2.1 廣州市流通環節水中銅綠假單胞菌污染情況

由表1可知，392件瓶（桶）裝水中有20件檢出銅綠假單胞菌，總體污染率為5.1%，其中6月抽查的50件樣品，有8件樣品檢出銅綠假單胞菌，檢出率最高，達到16.0%，其次為8月份（3/43，7.0%），7月次之（5/90，5.6%），4月次之（3/79，3.8%），5月次之（1/50，2.0%），而3月份抽查的瓶（桶）裝水未檢出銅綠假單胞菌（0/80）。6月份抽檢的瓶（桶）裝水的銅綠假單胞菌檢出率極顯著高于其他月份抽檢的瓶裝水（P＜0.01）。

表1 2017年3～8月廣州市瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌檢出情況Table 1 Detection results ofP．aeruginosain bottled water&barreled water from March to August 2017，Guangzhou

廣州地區的瓶（桶）裝水總體保持在較低的污染水平，桶裝水在6月銅綠假單胞菌檢出率極顯著高于其他月份的檢出率（P＜0.01），這可能跟溫濕度有關，銅綠假單胞菌其最適生長溫度為25～30℃，并喜歡在潮濕的環境中繁殖，在廣州地區6月正值梅雨季節，溫濕度均在銅綠假單胞菌最適范圍內，而在3月份，氣溫較低且氣候較為干燥，不利于其生長。

2.2 銅綠假單胞菌檢出與產品包裝及過濾方式的相關性

392件樣品按包裝分為瓶裝水和桶裝水，按過濾方式分為純凈水和礦泉水。銅綠假單胞菌檢出與產品包裝及過濾方式的相關性的分析見表2、表3。

表2 銅綠假單胞菌檢出與產品包裝的相關性Table 2 Correlation betweenP．aeruginosadetection and product packaging

表3 銅綠假單胞菌檢出與產品過濾方式的相關性Table 3 Correlation betweenP．aeruginosadetection and product filtration mode

由表2可知，本次抽查檢出的銅綠假單胞菌均來自桶裝水，瓶裝水中未檢出銅綠假單胞菌。瓶裝水和桶裝水之間的銅綠假單胞菌檢出率存在極顯著差異（P＜0.01）。由表3可知，按過濾方式分析，純凈水有268件，其中17件檢出銅綠假單胞菌，礦泉水124件，3件檢出銅綠假單胞，檢出率分別為6.3%和2.4%。純凈水和礦泉水的銅綠假單胞菌檢出無顯著差異（P＞0.05）。本次抽查認為銅綠假單胞菌的污染與產品包裝方式有關，而與產品的過濾方式無關。

對結果進行分析，桶裝水的污染情況極顯著高于瓶裝水可能是由于桶裝水的灌裝環節或包裝環節消毒不徹底造成的[9]（P＜0.01），桶裝水生產過程中桶裝包裝反復使用，且桶身的體積較大，消毒難度較大，小微企業自動化程度較低，手工程序多，而銅綠假單胞菌是一種常見的環境致病菌，從而造成產品污染機會增加。礦泉水生產主要以物理手段去除微生物，而純凈水生產則消毒手段比較多樣[9]，通過本次抽查可知礦泉水和純凈水中銅綠假單胞菌污染水平相當，這說明銅綠假單胞菌雖然對常規消毒手段具有較強的抗性，但如確保生產企業過濾和純化系統的正常運轉，并在濾膜及反滲透膜系統前增加紫外殺菌裝置等，可以在一定程度上控制銅綠假單胞菌的污染。

2.3 分離菌株抗生素藥敏結果

對分離得到的20株銅綠假單胞菌進行抗生素抗性測試，結果見表4。由表4可知，其中有19株菌對所有抗生素都敏感（占95%），所有菌對哌拉西林/他唑巴坦，頭孢他啶，環丙沙星和左氧氟沙星這4種抗生素都不耐藥，有1株銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）-03對哌拉西林/頭孢吡肟/亞胺培南/美羅培南/阿米卡星/慶大霉素/妥布霉素共7種抗生素具有抗性。

表4 20株銅綠假單胞菌的藥敏結果Table 4 Antibiotic susceptibility tests results of 20 P.aeruginosastrains

對比國內其他報道，李飛[10]收集的69株水源性銅綠假單胞菌和魏磊等[3]篩查得到的30株水源性銅綠假單胞菌均未發現耐藥性，2016年曾曉琮等[11]研究表明23株水源性銅綠假單胞菌則對磺胺甲基異惡唑/甲氧芐氨嘧啶、四環素、米諾環素的耐藥率分別為69.4%、13.2%和39.2%。對比臨床上，國內外的報告均顯示[12-16]，臨床分離株的耐藥水平要遠高于水源性分離株的耐藥水平，這與銅綠假單胞菌所處的環境不同相關。本研究發現水源性銅綠假單胞菌總體上耐藥水平較低，與國內同行報道基本一致，但仍發現了一株7重耐藥菌株，研究表明[6，12]，多重耐藥銅綠假單胞菌幾乎具有目前已知的所有細菌耐藥機制，是引起獲得性肺炎主要細菌之一，其引起的院內感染治療難度極大。因此，有必要評估水源性銅綠假單胞菌的耐藥特征及耐藥變化趨勢，加強銅綠假單胞菌耐藥機制的研究，并加強監測飲用水中銅綠假單胞菌的污染現狀及其耐藥情況，從而保障廣大消費群體的飲水安全。

3 結論

本次抽查結果顯示，廣州市瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌污染率總體處于較低水平，總體污染率為5.1%（20/392），銅綠假單胞菌污染與產品包裝方式極顯著相關，而與產品過濾方式無關，具體表現為桶裝水中銅綠假單胞菌污染水平遠高于瓶裝水，而純凈水與礦泉水中銅綠假單胞菌檢出率無顯著差別；瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌污染具有一定的季節性，其中6月份銅綠假單胞菌的檢出率極顯著高于其他月份的檢出率（P＜0.01）。藥敏結果顯示，水源性銅綠假單胞菌耐藥性總體處于較低水平，但仍存在一定的抗藥性，發現一株7重耐藥菌株，這值得引起相關部門的注意。衛生及監察部門應繼續加強對本地區飲用桶裝水的監督管理力度，保障群眾的飲水健康。

[1]XIAO M I,WANG Y,YANG Q W,et al.Antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosain China:a review of two multicenter surveillance programmes,and application of revised CLSI susceptibility breakpoints[J].Int J Antimicrob Agents,2012,40（5）:445-449.

[2]馬群飛，林 堅，陳美蘭，等.飲用天然礦泉水水源銅綠假單胞菌污染調查[J].環境與健康雜志，2001，18（3）：157-159.

[3]魏 磊，吳清平，張菊梅，等.礦泉水和山泉水中銅綠假單胞菌污染調查及分離菌株毒力基因與耐藥性分析[J].微生物學通報，2015，42（1）：125-132.

[4]李 莉，朱曉露，馬會會.桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測分析[J].中國衛生檢驗雜志，2016（3）：409-410.

[5]VARGA L.Bacteriological quality of bottled natural mineral waters commercialized in Hungary[J].Food Control,2011,22（3）:591-595.

[6]李學如，孟 濤，王 艷.銅綠假單胞菌耐藥機理研究進展[J].國外醫藥抗生素分冊，2004，25（3）：105-108.

[7]張祎博，孫景永，倪語星，等.2005—2014年CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2016，16（2）：141-145.

[8]中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局.GB/T 8538—2016飲用天然礦泉水檢驗方法[S].北京：中國標準出版社，2008.

[9]馬群飛.瓶裝飲用水銅綠假單胞菌污染研究進展[J].微生物學免疫學進展，2003，31（2）：95-98.

[10]李 飛.包裝飲用泉水食源性致病菌分布規律和遺傳多樣性研究[D].廣州：華南理工大學，2013.

[11]曾曉琮，蘇妙貞，韓志杰，等.桶裝水中銅綠假單胞菌耐藥性分析及RAPD-PCR 分型研究[J].現代食品科技，2017，33（4）：114-119.

[12]金 輝，糜祖煌，錢小毛，等.銅綠假單胞菌耐藥基因的分子流行病學研究[J].中華醫院感染學雜志，2007，17（2）：134-136.

[13]沈 黎，嚴曉敏，李春紅，等.1998—2007年醫院感染銅綠假單胞菌及耐藥性分析[J].中華醫院感染學雜志，2010，20（4）：570-572.

[14]陳 越，孫景永，倪語星，等.2012年中國CHINET銅綠假單胞菌耐藥性監測[J].中國感染與化療雜志，2015，9（3）：199-203.

[15]LIVERMORE D M.Multiple mechanisms of antimicrobial resistance in Pseudomonas aeruginosa:our worst nightmare?[J].Clin Infect Dis,2002,34（5）:634-638.

[16]LIVERMORE D M.Role of beta-lactamase and impermeability in the resistance ofPseudomonas aeruginosa[J].Antibiot Chemoth,2015,42（42）:257-263.

Contamination status ofPseudomonas aeruginosain bottled water and barreled water in Guangzhou and analysis of its antimicrobial resistance

ZHOU Chenqing,ZHANG Juan,HUANG Baoying,SHE Zhiyun,FAN Anni,ZHAO Ling
（Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision,Foshan 528300,China）

The contamination situation and resistance characteristics ofPseudomonas aeruginosafrom bottled water&barreled water in Guangzhou were investigated.P.aeruginosawas detected according to national standard GB 8538—2016,antibiotic susceptibility tests were carried out by AST-GN09 cards.A total of 392 samples were examined and the positive detection rate ofP.aeruginosawas 5.1%,all unqualified samples were barreled water,and the detection rate of purified water was 6.3%,while the detection rate of mineral water was 2.4%.The detection rate ranged from high to low by time was June （16%）,August（7.0%）,July （5.6%）,April（3.8%）,May （2.0%）,March （0）.The results of antibiotic susceptibility tests showed that 95% （19/20）strains were completely sensitive to all 11 antibiotics and a strain resistant to seven kinds of antibiotics was found.The detection rate ofP.aeruginosawas extremely significantly correlated with the product packaging method （P＜0.01）,but not related to the product filtration mode.The detection rate ofP.aeruginosain June was extremely significantly higher than that in other months （P＜0.01）,and the resistance of water-borneP.aeruginosaantibiotics was at a low drug resistance level.

Pseudomonas aeruginosa;bottled water;barreled water;antimicrobial resistance

Q93-3

0254-5071（2017）12-0168-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.035

2017-10-13

廣東產品質量監督檢驗研究院院長基金項目（JFB2016011）

周臣清（1988-），男，工程師，碩士，研究方向為食品安全與微生物檢測。