獼猴桃乳酸菌飲料的研制

張業芳，唐 詩，周 艷，孫曉紅*

（1.貴州醫科大學 公共衛生學院，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫科大學 食品安全學院，貴州 貴陽 550000）

獼猴桃乳酸菌飲料的研制

張業芳1，唐 詩1，周 艷2，孫曉紅2*

（1.貴州醫科大學 公共衛生學院，貴州 貴陽 550000；2.貴州醫科大學 食品安全學院，貴州 貴陽 550000）

以獼猴桃為原料，以pH值和感官評價作為檢測指標，依次經過菌種篩選、單因素試驗及正交試驗確定獼猴桃乳酸菌飲料的最佳工藝條件，并分析該飲料在保藏期期間總酚酸、維生素C以及乳酸菌含量的變化情況。結果表明，適用于獼猴桃乳酸菌飲料的最佳菌種為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），最佳發酵工藝條件為初始pH值5.0，加糖量10%，料液比1∶1（g∶mL），接種量106CFU/g，發酵溫度37℃，發酵時間28 h。在此最佳工藝條件下，產品總酚酸含量174.89 mg/100 g，維生素C 46.84 mg/100 g，pH值4.27，可溶性固形物18%，活菌數對數值9.96，微生物指標符合相關標準。

獼猴桃；乳酸菌；飲料；發酵工藝；優化

乳酸菌是指發酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱，它是人和動物體腸道內最重要的益生菌群，具有多種生理功能，如緩解乳糖不耐受癥[1]；改善人體胃腸道功能等[2]。隨著人們對乳酸菌認識的不斷深入，將乳酸菌應用于果蔬加工業應運而生，如乳酸菌發酵胡蘿卜、龍眼、山藥等[3-5]。由于接種了乳酸菌，相對于普通果蔬制品發酵果蔬制品不僅增加了益生功效，而且增進產品的風味；延長食品的保藏期，提高產品的附加值[6]。因此，發酵果蔬制品具有廣闊的市場空間。

獼猴桃又稱“奇異果”，由于其風味獨特，營養豐富，口感酸甜，深受大眾的喜愛。研究表明獼猴桃具有豐富的營養價值，含有豐富的維生素C、礦物質、膳食纖維及多酚類化合物[7]。既往對獼猴桃飲品的研究主要集中在獼猴桃果酒和果醋飲料的開發兩個方面。周翠英[8]選用篩選出的酵母菌研制出口感醇厚的獼猴桃發酵果酒，劉延嶺等[9]選用酵母菌對獼猴桃進行發酵，開發出一種新型的獼猴桃果醋飲料。王曉晴等[10]采用馴化的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵獼猴桃汁及脫脂乳，得到含乳的獼猴桃發酵果汁。上述獼猴桃飲料類產品獼猴桃利用不徹底，會產生大量的果渣副產物。

本研究以獼猴桃果漿作為發酵基質，進行乳酸菌發酵，研制出一種獼猴桃乳酸菌飲料。以貴州地區優勢獼猴桃品種——“貴長”獼猴桃為原料，依次經過菌種篩選、單因素試驗及正交試驗確定獼猴桃乳酸菌飲料生產的最佳工藝條件，同時探討其保藏期間總酚、維生素C、以及乳酸菌含量的變化情況。該研究為豐富獼猴桃加工企業的產品種類，提高其綜合經濟效益和產品的市場競爭力有實際意義；有利于提高獼猴桃種植戶的經濟收入，同時也迎合了消費者的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“貴長”獼猴桃：貴陽市修文縣；植物乳桿菌（Lactobacil-lusplantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）凍干粉：山東中科嘉億生物工程有限公司；白砂糖、檸檬酸鈉、葉綠素銅鈉鹽、羧甲基纖維素鈉（均為食品級）：市售；沒食子酸（純度≥98%）、抗壞血酸（純度≥98%）：天津市瑞金特化學品有限公司；福林酚試劑、甲醇、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸、固藍鹽B（均為分析純）、MRS固體培養基：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

KMT-200C型多功能營養破壁機：佛山市維爾庫科機有限公司；SPH-160型生化培養箱：上海三發科學儀器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設廠；PHB-5型便攜式pH計：上海晶磁儀器有限公司；LT1002C型電子天平：常熟市天量儀器有限責任公司；721型可見分光光度計：上海菁華科機儀器有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 獼猴桃乳酸菌飲料加工工藝流程

獼猴桃→打漿→調配→分裝→殺菌→冷卻→接種→發酵→冷藏→成品

1.3.2 操作要點

選果、清洗：選用成熟度高、果實豐滿、無霉變腐爛的獼猴桃鮮果，用清水清洗掉獼猴桃表面的毛及泥土等。

打漿：去皮后用多功能打漿機將洗凈的獼猴桃破碎成漿。

調配：按6 mg/100 g添加葉綠素銅鈉鹽調節獼猴桃果漿的顏色，按80 mg/100 g添加羧甲基纖維素鈉，添加白砂糖調整獼猴桃果漿至試驗設計含糖量，并用檸檬酸鈉調節pH值至試驗設計水平。

分裝：將處理完成后的獼猴桃果漿分裝入300 g的罐頭瓶中，裝樣量為200 g。

加熱、殺菌：在83℃加熱30 min以殺滅獼猴桃果漿中的有害微生物、致病菌等。

活化乳酸菌：稱取所需量的活性乳酸菌凍干粉，加入10倍體積的蒸餾水，攪拌至完全溶解后放入37℃水浴鍋中活化30 min，冷卻發酵母液，待其溫度與待發酵獼猴桃原漿溫差在5℃內開始接種。

發酵：滅菌處理后的獼猴桃果漿冷卻至室溫，加入經活化后的乳酸菌，控制發酵溫度為試驗設計溫度。發酵至試驗設計時間，以pH降至4.8以下為發酵終點。

冷藏：發酵完成后的獼猴桃果漿冷藏于4℃冰箱。

1.3.3 發酵菌種的選擇

分別選擇植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌3種乳酸菌分別對獼猴桃進行發酵，接種量為106CFU/g，發酵溫度37℃，加糖量為10%，獼猴桃和水按照料液比1∶1（g∶mL），以pH、感官評分檢測指標，分析其在發酵6h、12h、18h、24h、36 h、48 h的變化情況，從而篩選出在獼猴桃果漿中生長良好的菌種。結合感官評分，篩選出能在獼猴桃果漿中生長且發酵風味良好的菌株，并用于后續試驗。

1.3.4 最佳發酵工藝條件的確定

單因素試驗：選取加糖量（6%、8%、10%、12%、14%、16%）、初始pH值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、料液比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1（g∶mL））、接種量（103CFU/g、104CFU/g、105CFU/g、106CFU/g、107CFU/g、108CFU/g）、發酵溫度（31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃）、發酵時間（16 h、20 h、24 h、28 h、32 h、36 h），以感官評分為評價指標，進行單因素試驗。每個因素重復3次。

正交試驗：在單因素試驗的基礎上，選取發酵時間、接種量、發酵溫度、料液比、加糖量、初始pH進行6因素3水平正交試驗，以感官評分為評價指標，通過極差分析，方差分析得出最佳的發酵條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 發酵工藝優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.5 感官評定

由10個品評員組成的感官評分小組參照表2對獼猴桃乳酸菌飲料進行感官評分，總分100分，試驗重復3次，取平均值進行計算。評分標準見表2。

表2 獼猴桃乳酸菌飲料感官評定標準Table 2 Sensory evaluation standards of kiwifruit lactic acid bacteria beverage

1.3.6 理化指標及微生物指標的測定

（1）總酚的測定

取10 mL獼猴桃發酵原漿，加入30 mL體積分數為80%甲醇，在60℃、450 W條件下超聲20 min，離心取上清。參照文獻[11]，取0.1 mL多酚提取液，加入1 mL福林酚試劑，再加5.9 mL蒸餾水，然后靜置反應6 min。加入10%碳酸鈉溶液3 mL，避光靜置反應30 min后于波長764 nm條件下測定吸光度值。以沒食子酸標準品質量濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標制作標準曲線，達到標準曲線回歸方程為Y=0.009 0X+0.103 5，相關系數R=0.999 7。按照標準曲線回歸方程計算樣品中多酚（以沒食子酸計）的含量。

（2）維生素C的測定

精密吸取0.5 mL試樣于10 mL比色管中，各加0.3 mL乙二胺四乙酸二鈉溶液、0.5 mL乙酸溶液、1.25 mL固藍鹽B溶液（2 g/L），加水稀釋至刻度，混勻下室溫放置20 min，移入1 cm比色皿內，以零管為參比，于波長420 nm處測定吸光度值。以抗環血酸標準品質量濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標制作標準曲線，得到標準曲線回歸方程為Y=0.004 1X-0.032 6，相關系數R=0.995 3。按照標準曲線回歸方程計算樣品中維生素C含量。

（3）微生物指標的測定

分別參照國標GB 4789.35—2010《乳酸菌檢驗》，GB 4789.3—2016《大腸菌數測定》、GB 4789.4—2016《沙門氏菌檢驗》及GB 4789.10—2016《金黃色葡萄球菌檢驗》分別對獼猴桃發酵果漿中乳酸菌、大腸桿菌、沙門氏菌及金黃色葡萄球菌進行檢測。

（4）可溶性固形物

采用手持式阿貝爾折光儀。

2 結果與分析

2.1 發酵菌種的選擇

由圖1A可知，三種乳酸菌接種到獼猴桃果漿中，發酵前6 h三株菌種活菌數的含量均下降，其中植物乳桿菌下降幅度最小，表明植物乳桿菌相對于另外兩種菌更能適應獼猴桃果漿的生長條件。由圖1B可知，隨著發酵時間的延長pH值逐漸降低，發酵12h后pH值下降明顯。由于發酵24h各菌種的含量基本達到最大，因此取該發酵時間的獼猴桃乳酸菌飲料進行感官評價。由圖1C可知，植物乳桿菌發酵獼猴桃飲料感官評分最高，其次是干酪乳桿菌，鼠李糖乳桿菌最低。結合感官評分，最終選擇植物乳桿菌為發酵菌種。

圖1 3種獼猴桃乳酸菌飲料的pH值、菌濃度及感官評分Fig．1 pH value，bacterial concentration and sensory score of 3 kinds of kiwifruit lactic acid bacteria beverage

2.2 發酵工藝優化單因素試驗

白砂糖作為植物乳桿菌發酵所需的碳源，添加量過少，植物乳桿菌生長遲緩，使產品香味不足；添加量過多，還會使口感過于甜膩[12]。由圖2A可知，白砂糖添加量在6%～14%之間時感官評分呈現上升趨勢，添加量為14%時，感官評分最高，隨后降低。因此，選擇加糖量為14%進行后續試驗。

pH值的大小會直接影響植物乳桿菌的生長與代謝[13-14]，間接影響獼猴桃發酵飲料的口感。由圖2B可知，隨著初始pH值的變化，感官評分值呈現先逐漸升高后降低的趨勢，且當初始pH為5.5時達到最高。因此，選擇的起始pH值為5.5進行后續試驗。

由圖2C可知，料液比為1∶3到1∶1時，感官評分呈現上升趨勢，在1∶1時達到最大值，隨后降低。因此，選擇料液比為1∶1進行后續試驗。

接種量過低，發酵時間較長，產酸量低且容易受到雜菌污染；接種量過高，發酵速度雖能加快但微生物細胞易衰老，出現自溶現象[15]。由圖2D可知，接種量在103～107CFU/g之間感官評分值呈現上升趨勢，接種量為107CFU/g時感官評分最高，隨后降低。因此，選擇接種量107CFU/g進行后續試驗。

發酵時間的長短會直接影響到發酵產品口感和風味。由圖2E可知，隨著發酵時間的延長，感官評分值先升高后緩慢降低，發酵28h感官評分達到最高。因此，選擇發酵時間為28 h進行后續試驗。

不同的培養溫度影響代謝產物的產量和質量，以及產品的酸度、風味和組織狀態[16]。由圖2F可知，發酵溫度在32℃到37℃之間隨著溫度的升高感官評分逐漸上升，37℃時達到感官評分最高，隨后降低。因此，選擇發酵溫度為37℃進行后續試驗。

圖2 不同因素對獼猴桃發酵飲料pH值及感官品質的影響Fig.2 Effects of different factors on pH value and sensory quality of fermented kiwifruit beverage

2.3 發酵工藝優化正交試驗表3 發酵工藝優化正交試驗結果與分析

Table 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

試驗號 A B C D E F 感官評分/分1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 0 0 0 -1 1 1 1 0 0 0 -1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0-1 1 1 1 0 0 0 -1 1 0 -1 1 0 -1 0 -1 1 0 --1-1-1-1 1 1 0 -1 1 0 -11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 1 1 1 0 0 0 -1 0 0 0 -1-1-1-1-1-1 1 1 0 -1 0 --1-1 1 1 0 -1 1 0 --1-1 1 1 1 -1 1 1 0 -1 1 0 -1 1 --1-1-1 1 1 1 0-1-1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 -1 1 1 0 -1 1 1 1 0 -1 83.2 78.1 83.0 83.3 83.5 82.0 75.0 80.0 76.3 85.0 88.2 80.0 82.3 74.3 80.3 86.0 87.1 88.3 77.0 77.6 85.7 81.7

續表

表4 正交試驗結果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3可知，各因素對獼猴桃發酵的影響程度從高到低的次序為料液比＞初始pH＞發酵時間＞接種量＞加糖量＞發酵溫度。最佳發酵工藝為A2B1C2D2E2F2，即初始pH

5.5 ，加糖量12%，料液比1∶1（g∶mL），接種量107CFU/g，發酵溫度37℃，發酵時間28h。將正交試驗得到的最佳工藝組合進行3次驗證試驗，成品感官評分達到89.2分。由表4可知，料液比對感官評價影響達到極顯著程度（P＜0.01），其他因素對感官評價影響均不顯著（P＞0.05）。

2.4 獼猴桃乳酸菌飲料保藏期中總酚、維生素C及活菌數的變化

表5 保藏期期間總酚酸、維生素C及活菌數的變化Table 5 Changes of total phenolic acids，vitamin C and viable count during the storage period

由表5可知，獼猴桃乳酸菌飲料在4℃保存21 d，維生素C比較穩定，僅下降3.4%，植物乳桿菌的數量隨儲存時間的延長逐漸降低，但始終維持在107CFU/g以上，滿足活性乳酸菌的要求[17]。研究表明，低溫會抑制獼猴桃中部分酶的活性，延緩多酚氧化、聚合、降解，使多酚相對比較穩定[18]。結果表明，在4℃保藏21 d能保持獼猴桃乳酸菌飲料較高的生物活性成分。

2.5 獼猴桃乳酸菌飲料質量標準

2.5.1 感官指標

色澤：綠色；氣味：兼有植物乳桿菌發酵的香味和獼猴桃特有的香味，無異味：滋味：口感細膩，酸甜適中。2.5.2理化及微生物指標

獼猴桃乳酸菌飲料總酚含量174.89 mg/100 g，維生素C 46.84 mg/100 g，pH值4.27，可溶性固形物18%。

微生物指標：植物乳桿菌活菌數對數值為9.96，大腸桿菌≤3 MPN/100 mL，霉菌≤30 CFU/100 mL，致病菌未檢出。

3 結論

本研究以pH和感官評分作為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗確定了植物乳桿菌發酵獼猴桃飲料的最佳工藝參數：初始pH 5.5，加糖量12%，料液比1∶1（g∶mL），接種量107CFU/g，發酵溫度37℃，發酵時間28 h。在此條件下制備的獼猴桃乳酸菌飲料總酚含量174.89 mg/100 g，維生素C 46.84 mg/100 g，pH值4.27，可溶性固形物18%，微生物指標符合相關標準。在4℃冷藏21 d，仍能保持較高的生物活性成分。本方法研制的獼猴桃乳酸菌飲料，采用單一植物乳桿菌作為發酵劑，生產工藝操作簡單、成本低、品質優和高附加值的飲品，豐富了發酵食品的種類。

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Preparation of kiwifruit lactic acid bacteria beverage

ZHANG Yefang1,TANG Shi1,ZHOU Yan2,SUN Xiaohong2*
（1.School of Public Health,Guizhou Medical University,Guiyang 550000,China;2.College of Food Safety,Guizhou Medical University,Guiyang 550000,China）

Using the kiwifruit as the raw material,pH value and sensory evaluation as detection indexes,the optimum technology conditions of the kiwifruit lactic acid bacteria beverage were determined by bacteria screening,single factor experiments and orthogonal experiments.The changes of total phenolic acid,vitamin C and lactic acid bacteria during the storage period of the beverage were analyzed.The results showed thatLactobacillus plantarumwas selected as the optimum strain for the beverage.The optimum fermentation process were initial pH 5.0,sugar 10%,solid-liquid ratio 1∶1 （g∶ml）,inoculum 106CFU/g,fermentation temperature 37 ℃ and time 28 h.Under the optimum process conditions,the total phenolic acid content,vitamin C content,pH value,soluble solid content and viable counts of the product were 174.89 mg/100 g,46.84 mg/100 g,4.27,18%,and 9.96 log CFU/ml,respectively.The microbiological indicators were in accord with relevant standards.

kiwifruit;lactic acid bacteria;beverage;fermentation process;optimization

TS255.3

0254-5071（2017）12-0186-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.039

2017-09-19

貴州省科技廳軟科學研究項目（黔科合R字[2015]2018-2號）；貴州省教育廳青年科技人才成長計劃（黔教合ky字[2016]154號）；貴州醫科大學博士啟動基金項目（YJ2017-1）

張業芳（1990-），女，碩士研究生，研究方向為營養與食品衛生。

*通訊作者：孫曉紅（1963-），女，教授，碩士，研究方向為營養與食品衛生。