cFLIP基因沉默對急性壞死性胰腺炎大鼠的治療作用及其機制

王寶枝 汪軍 彭和平 丁榆 胡旭中

cFLIP基因沉默對急性壞死性胰腺炎大鼠的治療作用及其機制

王寶枝 汪軍 彭和平 丁榆 胡旭中

目的通過尾靜脈注射cFLIP-siRNA治療急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠，觀察療效，探討其相關機制。方法設計并合成3對靶向cFLIP 基因的siRNA(cFLIP-siRNA)及陰性對照siRNA(siRNA-NC)，篩選抑制cFLIP 基因表達能力最強的siRNA進行實驗。30只SD大鼠采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉鹽溶液方法建立ANP模型，按數字表法隨機分為ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA組，每組10只，分別于尾靜脈注射等容積生理鹽水、siRNA-NC、cFLIP-siRNA。24 h后處死大鼠，取血檢測血清淀粉酶、內毒素水平，取胰腺組織，常規行病理學檢查，采用免疫組織化學法和蛋白質印跡法檢測胰腺組織cFLIP-S、caspase-8蛋白表達。結果ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA 組大鼠血清淀粉酶水平分別為(1 286±209)、(1 297±305)、(552±256)U/L，內毒素為(136±32)、(128±56)、(46±23)ng/L，胰腺病理評分為(4.97±1.16)、(4.92±2.03)、(1.67±1.98)分，cFLIP-S蛋白表達量為8.56±2.72、9.12±2.45、3.82±1.46，cFLIP-siRNA 組顯著低于ANP組及siRNA-NC組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。3組caspase-8蛋白表達量分別為2.25±1.24、2.41±1.14、5.56±1.79，cFLIP-siRNA組顯著高于ANP組及siRNA-NC組，差異均有統計學意義(P值均<0.05)。而ANP組與siRNA-NC組間各項指標的差異均無統計學意義。結論抑制cFLIP基因表達可減輕ANP大鼠胰腺的損傷，其機制可能是通過上調caspase-8表達抑制胰腺細胞壞死，促進細胞凋亡所致。

胰腺炎，急性壞死性； RNA，小分子干擾； 細胞凋亡； cFLIP基因

重癥急性胰腺炎(SAP)發病中有兩個關鍵環節，即胰腺組織壞死引起胰腺消化酶釋放和全身炎性反應綜合征，如果能夠有效抑制這兩個環節的進展，將會非常有效地控制SAP進展至終末期的各器官損傷[1-3]。cFLIP也稱細胞型含死亡結構域的Fas相關蛋白樣白介素-1β轉換酶抑制蛋白(cellular Fas associated protein with death domain-like interleukin-1β converting enzyme inhibitor protein, cFLIP)，是天然存在的胱冬蛋白酶(caspase)抑制蛋白。cFLIP有cFLIP-L與cFLIP-S兩種單體亞型，均在炎癥中參與調控細胞凋亡、壞死[1-2]。本研究應用RNA干擾技術抑制急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺組織cFLIP-S mRNA表達，觀察其對ANP胰腺損傷的影響，初步探討其作用機制。

材料與方法

一、靶向cFLIP siRNA的構建及篩選

參照GeneBank cFLIP mRNA的序列及siRNA的設計原理，由Ambion公司設計并合成3條靶向cFLIP基因不同位點的siRNA(cFLIP-siRNA)及無同源性的陰性對照siRNA(siRNA-NC)。設計原則：siRNA分子的長度為21～23 bp；序列在起始密碼子ATG 70～100 bp之后，GC含量低，避開mRNA一級結構區域。siRNA1正義序列5′-GGCUGAUUCUGGAAGUUCUtt-3′，反義序列5′- AGAACUUCCAGAAUCAGCCtg-3′；siRNA2正義序列5′- CCAGUACCCUGAUGCUACAtt-3′，反義序列5′-UGUAGCAUCAGGGUACUGGat-3′；siRNA3正義序列5′-GCAUCUUCUGAGCAAUUACtt-3′，反義序列5′- AAUUGACCUCAGAGAUGCGtg-3′；siRNA-NC正義序列5′-CACUGAUCGUUCAUAGCCAtt-3′，反義序列5′-GGUCAAGAUGCGACAUUUGat-3′。取9只雄性清潔級健康SD大鼠(廣州中醫藥大學實驗動物中心提供)，隨機分為3組，每組3只，分別經尾靜脈注射1對cFLIP-siRNA，注射后72 h處死大鼠，取胰腺組織，采用RT-PCR方法檢測cFLIP mRNA表達。

二、實驗動物及分組

雄性清潔級健康SD大鼠30只，體重250～300 g，術前禁食12 h，自由飲水。按數字表法將大鼠隨機分為ANP組、siRNA-NC 組、cFLIP-siRNA組。采用胰膽管逆行注射5%牛磺膽酸鈉鹽(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重的方法制備ANP模型。siRNA-NC組、cFLIP-siRNA組分別經尾靜脈注射1 nmol/μl siRNA-NC或cFLIP-siRNA 100 μl(5 mg/kg體重)。術后于背部皮下分點注射無菌生理鹽水(2 ml/100 g體重)以補充術中丟失的體液。術后禁食，不禁水。術后48 h于心臟采血5 ml，離心留取血清，置-80℃保存。取胰腺組織部分置4%甲醛固定，部分置液氮冷凍。

三、觀察指標

1．血清淀粉酶、內毒素水平檢測：采用碘比色法檢測血清淀粉酶活性，基質偶氮顯色鱟法檢測內毒素水平。

2．胰腺組織病理學檢查：取甲醛固定的胰腺組織，常規石蠟包埋、切片、HE染色觀察組織病理學改變，雙盲法按Gukovshaya等[6]的標準從水腫、壞死、出血、鈣化4方面進行病理評分。水腫評分：無水腫，0分；葉間局灶性水腫，0.5分；葉間彌漫性水腫，1分。脂肪壞死評分：無脂肪壞死，0分；胰腺周圍或葉間局灶性脂肪壞死，0.5分；彌漫性脂肪壞死，1分。胰腺腺泡壞死評分：無腺胞壞死，0分；小葉邊緣或葉間10%腺胞壞死，0.5分；小葉外緣10%～30%腺胞壞死，1分；小葉融合壞死<30%， 1.5分；融合壞死30%～50%，2分；融合壞死>50%，2.5分；微小膿腫形成，3分。出血評分：無出血，0分；充血及葉間或葉內局灶性出血，1分；多點彌漫性出血，1.5分；血管纖維素樣壞死或血栓形成，2分。鈣化評分：無鈣化，0分；局灶存在于脂肪或腺泡壞死區域，0.5分；彌漫性存在于脂肪或腺泡壞死區域，1分。4項評分相加為最后評分。

3．胰腺組織cFLIP-S及caspase-8蛋白表達檢測：取胰腺組織切片，采用免疫組織化學染色觀察胰腺組織cFLIP-S及caspase-8的表達。胞質內出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。每張切片隨機選取4個高倍視野(×40)，應用Image-Pro Plus圖像處理分析軟件掃描，以積分吸光值(IOD)表示蛋白相對表達量。

取液氮保存的胰腺組織，用裂解液制備組織勻漿，應用Pierce BCA蛋白定量試劑盒(Thermo公司)及紫外分光光度法定量蛋白后，采用常規蛋白質印跡法檢測胰腺組織cFLIP-S及caspase-8表達，以β-actin作為內參。抗cFLIP單抗購自美國Santa Cruz公司，抗caspase-8多抗購自美國Biowold公司。最后ECL發光，X片曝光、顯影、定影，圖像分析軟件掃描，以目的條帶與內參條帶的灰度值比表示相對表達量。

4．胰腺組織cFLIP mRNA表達檢測：取凍存胰腺組織，用Trizol試劑盒提取胰腺組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度。按照RT-PCR試劑盒取1 μg總RNA逆轉錄合成cDNA,然后以Sybr Green作為熒光標記物，在ABI 7500 Real Time PCR System中進行PCR反應，cFLIP上游引物為5′-GGCGGCCATTCTCATCTTCTCGG-3′，下游引物為5′-ACCTCGGCAGACACAGGGCT-3′；GAPDH作為內參，上游引物為5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′，下游引物為5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以公式2-ΔΔCt計算mRNA表達量。

四、統計學處理

結 果

一、cFLIP-siRNA篩選

注射cFLIP-siRNA1的3只大鼠胰腺組織cFLIP mRNA表達抑制率分別為0.28、0.25、0.42，注射cFLIP-siRNA2的表達抑制率為0.36、0.66、0.56，注射cFLIP-siRNA3的表達抑制率為0.31、0.29、0.38，故選擇cFLIP-siRNA2進行實驗研究。

二、血清淀粉酶、內毒素水平變化

ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA 組大鼠血清淀粉酶水平分別為(1 286±209)、(1 297±305)、(552±256)U/L，內毒素水平為(136±32)、(128±56)、(46±23)ng/L，cFLIP-siRNA組較ANP組及siRNA-NC組顯著下降，差異均有統計學意義(t=7.687，P=0.001，t=5.401，P=0.009；t=4.618，P=0.016，t=5.591，P=0.006)，而ANP組與siRNA-NC組的差異無統計學意義(t=0.197，P=0.279；t=0.637，P=0.198)。

三、胰腺組織病理改變

ANP組大鼠腹腔內出血，胰腺充血水腫，表面出血、壞死，可見明顯皂化斑。鏡下見大鼠胰腺腺泡變性、灶狀或片狀壞死，大量炎癥細胞浸潤，胰周脂肪組織壞死、胰腺間質血管擴張充血或出血。siRNA-NC組大鼠的變化與ANP組基本相似。cFLIP-siRNA組大鼠胰腺病理損傷程度較ANP組及siRNA-NC組明顯減輕(圖1)。ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA組胰腺病理評分分別為(4.97±1.16)、(4.92±2.03)、(1.67±1.98)分，cFLIP-siRNA 組顯著低于ANP組及siRNA-NC組，差異均有統計學意義(t=3.687，P=0.016；t=3.156，P=0.021)，而ANP組與siRNA-NC組的差異無統計學意義(t=1.125，P=0.248)。

四、胰腺組織cFLIP-S、caspase-8蛋白表達變化

采用免疫組織化學方法檢測，ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA 組cFLIP-S蛋白相對表達量分別為8.56±2.72、9.12±2.45、3.82±1.46，cFLIP-siRNA組的表達量較ANP組及siRNA-NC組顯著下降，差異均有統計學意義(t=6.021，P=0.002；t=3.783，P=0.019)。caspase-8蛋白相對表達量分別為2.25±1.24、2.41±1.14、5.56±1.79，cFLIP-siRNA組較ANP組及siRNA-NC組顯著增加，差異均有統計學意義(t=4.687，P=0.011；t=-5.487，P=0.006)。而ANP組與siRNA-N組間的差異均無統計學意義(t=1.017，P=0.139；t=1.126，P=0.038)(圖2)。

采用蛋白質印跡法檢測，ANP組、siRNA-NC組、cFLIP-siRNA組cFLIP-S蛋白相對表達量分別為524.56±56.72、539.12±28.45、221.82±89.46，cFLIP-siRNA組的表達量較ANP組及siRNA-NC組顯著下降，差異均有統計學意義(t=5.126，P=0.019；t=6.106，P=0.015)；caspase-8蛋白相對表達量分別為216.25±56.24、209.41±52.14、 489.56±38.79，cFLIP-siRNA組較ANP組及siRNA-NC組顯著增加，差異均有統計學意義(t=5.636，P=0.013；t=6.021，P=0.008)。而ANP組與siRNA-NC組間的差異均無統計學意義(t=1.106，P=0.084；t=0.982，P=0.079)(圖3)。

圖1 ANP組(1A)、siRNA-NC組(1B)、cFLIP-siRNA組(1C)胰腺組織病理改變(HE ×200)

圖2 ANP組(2A)、siRNA-NC組(2B)、cFLIP-siRNA 組(2C)大鼠胰腺cFLIP-S(上)、caspase-8(下)蛋白表達(免疫組織化學 ×400)

討 論

胰腺腺泡細胞死亡包括細胞凋亡和細胞壞死兩種方式。細胞壞死與凋亡并非完全對立，而是在一定條件下相互轉化。細胞死亡是決定急性胰腺炎(AP)病程及預后的重要因素，AP患者的病情嚴重程度與腺泡細胞凋亡程度呈負相關，與腺泡細胞壞死程度呈正相關[2]。研究表明，腺泡細胞凋亡可能是AP發生后對機體的一種保護性反應。本研究結果顯示，cFLIP-siRNA組大鼠的腹腔內出血量減少，胰腺出血壞死較輕，組織病理評分明顯降低，表明抑制cFLIP表達可減輕ANP大鼠的胰腺細胞壞死程度。cFLIP-siRNA組大鼠血清淀粉酶及內毒素水平下降也支持抑制cFLIP表達對ANP的進展有保護作用。

圖3 ANP組(1)、siRNA-NC組(2)、cFLIP-siRNA 組(3)胰腺組織cFLIP-S及caspase-8蛋白表達

Caspase-8是一種凋亡相關蛋白，其活化狀態可誘導胰腺細胞發生凋亡。正常情況下死亡受體介導的細胞凋亡信號通路中cFLIP與caspase-8前體形成異源二聚體，進而阻止caspase-8前體活化，抑制細胞凋亡，維持細胞存活狀態[1，3]。當細胞受到損傷時，通過TNF-α受體介異的細胞壞死信號通路，cFLIP-S與caspase-8前體FADD形成復合體，激活RIPK1形成RIPK1-RIPK3-MLKL復合體，抑制caspase-8活化，促發細胞壞死的級聯反應[1，4]。Gunther等[5]報道，正常回腸上皮細胞不發生壞死，但TNF-α可致caspase-8 缺乏的回腸上皮細胞發生壞死，而這種壞死可被特異性TNF-α壞死通路抑制劑Nec-1 所抑制。Gukovskaya等[6]報道，大劑量的膽囊收縮素可致大鼠發生水腫型胰腺炎，并觀察到caspase-8的激活，當特異性抑制caspase-8活化時，大鼠胰腺中壞死的腺泡細胞明顯增多，凋亡細胞明顯減少，提示AP時caspase-8減少可能與腺泡細胞壞死相關。本研究結果顯示，抑制cFLIP 基因表達后胰腺組織caspase8表達明顯增強，并主要以活性形式存在，推測cFLIP-siRNA可能通過上調caspase-8的表達進而誘導AP時胰腺細胞從壞死轉向凋亡，從而減輕AP病變程度。

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TherapeuticeffectsofcFLIPgenesilencingonacutenecrotizingpancreatitisratsanditsmechanism

WangBaozhi,WangJun,PengHeping,DingYu,HuXuzhong.

DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511447,China

WangBaozhi,Email: 565263945@qq.com

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects of cFLIP-siRNA tail venous injection on acute necrotizing pancreatitis (ANP) rats, and explore the related mechanism.MethodsThree pairs of cFLIP siRNAs (cFLIP-siRNA) and negative control(siRNA-NC) were designed and synthesized. The most effective siRNA to inhibit the expression of cFLIP gene was selected for the experiment. Thirty SD rats were treated with retrograde pancreaticobiliary duct injection of 5% taurocholic acid sodium salt solution to establish ANP rat model. They were randomly divided into ANP group, siRNA-NC group and cFLIP-siRNA group with 10 rats in each group using random number method. The same volume of normal saline, siRNA-NC and cFLIP-siRNA were injected into tail vein, respectively. The rats were sacrificed after 24 h and the blood samples were colelcted. The levels of serum amylase and endotoxin were measured. The pancreatic tissues were collected and routine pathological examination was performed. The expressions of cFLIP-S and caspase-8 protein in pancreatic tissues were detected by immunohistochemistry and Western blotting.ResultsThe levels of serum amylase in ANP group, siRNA-NC group and cFLIP-siRNA group were (1 286±209), (1 297±305) and (552±256)U/L, the level of serum endotoxin were (136±32), (128±56) and (46±23)ng/L,respectively. The pancreatic pathological scores were (4.97±1.16), (4.92±2.03) and (1.67±1.98). The expression level of cFLIP-S protein were (8.56±2.72), (9.12±2.45) and (3.82±1.46), respectively, which were significantly lower in cFLIP-siRNA group than in ANP group and siRNA-NC group (P<0.05), and the difference was statistically significant (P<0.05). The expression level of caspase-8 protein in the three groups were (2.25±1.24), (2.41±1.14) and (5.56±1.79), respectively, which were significantly higher in cFLIP-siRNA group than in ANP group and siRNA-NC group, and the difference was statistically significant (P<0.05). However, there was no significant difference between ANP group and siRNA-NC group.ConclusionsInhibition of cFLIP gene expression can reduce pancreatic injury in ANP rats. The possible mechanism was that the up-regulation of caspase-8 can inhibit pancreatic cell necrosis and promote apoptosis.

Pancreatitis, acute necrotizing; RNA, small interfering; Apoptosis; cFLIP genes

FundprogramProject Supported by Program of Guangzhou Medical Research(20151A011098)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.06.005

511447 廣州，廣州醫科大學附屬第二醫院普通外科

王寶枝，Email: 565263945@qq.com

廣州市醫藥衛生科技一般引導項目(20151A011098)

2017-05-15)

呂芳萍)