雌二醇誘導雄性長爪沙鼠乳腺增生模型的初探

王存龍, 杜小燕, 劉 欣, 郭 萌, 呂建祎, 陳振文, 李長龍

(首都醫科大學基礎醫學院, 北京100069)

雌二醇誘導雄性長爪沙鼠乳腺增生模型的初探

王存龍, 杜小燕, 劉 欣, 郭 萌, 呂建祎, 陳振文, 李長龍

(首都醫科大學基礎醫學院, 北京100069)

目的 建立雌激素誘導雄性長爪沙鼠乳腺增生模型。方法 使用苯甲酸雌二醇腹腔注射誘導雄性長爪沙鼠、小鼠和大鼠，建立乳腺增生模型。取模型動物乳腺組織進行組織學觀察，并與正常雄性和雌性長爪沙鼠、小鼠和大鼠進行比較。結果 通過組織學觀察，正常雄性長爪沙鼠未見乳腺相關結構，而在苯甲酸雌二醇誘導后的組織中顯示較為明顯的乳腺導管和乳腺小葉。此外，相比于小鼠和大鼠，長爪沙鼠在雌激素誘導后除了有較明顯的乳腺增生外還伴有炎性細胞浸潤。結論 苯甲酸雌二醇可以在雄性小鼠、大鼠和長爪沙鼠較好地誘導乳腺增生，初步證實長爪沙鼠可以作為男性乳腺增生動物模型。

長爪沙鼠; 雌二醇; 男性乳腺發育癥(GYM)

男性乳腺發育癥(gynecomastia, GYM), 又稱男性乳腺增生癥, 是指男性乳腺組織異常發育、乳腺結締組織異常增生的一組疾病[1,2], 占男性乳房疾病的60%～80%[3,4]。近年來, 伴隨著生活水平的提高和生活方式的改變, 其發病率和就診率明顯增多[5,6]。特別是在青少年男性中的發病率已達60%[1]。研究表明, 乳腺發育相關基因都在常染色體上, 因此乳腺在胚胎發育早期沒有性別差異。在青春期時，雌激素與生長激素共同作用引起乳腺的發育。正常情況下，雄性動物因為其體內雌激素水平較低和雄激素水平較高等原因抑制了乳腺的發育[7]。GYM的發病機制非常復雜，體內激素分泌異常是一個重要的影響因素[8]。目前GYM治療主要有手術治療法和抗激素治療法，但大多治療方式并不十分理想。最常見是手術治療法，但會出現血腫、手術部分感覺下降、手術創口出現瘢痕及其他術后并發癥[9];抗激素治療法也是常用方法之一，仍然存在副作用大、復發率高等不足之處[10]。人類疾病動物模型的建立對于人類疾病的預防、診斷、治療以及發病機制的研究發揮著重要作用。但到目前為止GYM動物模型種類較少，因此，更多種類模型動物的建立將有助于該疾病的相關研究。

長爪沙鼠(Meriones unguiculatus)，又稱蒙古沙鼠(Mongolian gerbils)、土沙鼠、黃耗子等，屬哺乳綱, 嚙齒目, 鼠科, 沙鼠亞科, 沙鼠屬, 主要分布于我國東北及內蒙古等荒漠草原地帶[11]。長爪沙鼠因其具有獨特的解剖學、生理學和行為學等特征，已經廣泛應用于醫學領域的研究，是極具潛在應用價值的實驗動物[12]。作者前期在外觀和組織學上未見雄性長爪沙鼠具有明顯的乳腺相關結構。本研究利用雌二醇誘導雄性長爪沙鼠并與大鼠和小鼠進行比較，嘗試建立雄性長爪沙鼠乳腺增生動物模型，為男性乳腺疾病研究提供新的模型材料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

ICR小鼠雄性6只, 雌性3只, 體質量30～40 g;Wistar大鼠雄性6只，雌性3只, 體質量180～220 g;長爪沙鼠雄性6只，雌性3只，體質量40～50 g;所有動物均為2～3月齡。小鼠、大鼠為SPF級動物，均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2012-0001]，長爪沙鼠為普通級動物，均來自首都醫科大學實驗動物部，飼養于控制溫濕度的普通環境中[SYXK(京) 2013-0005]。將小鼠、大鼠和長爪沙鼠分別分為3組，第1組為雌性動物組，第2組為雄性動物組，第3組為苯甲酸雌二醇誘導的雄性動物組，每組3只。

1.2 實驗方法

對小鼠、大鼠和長爪沙鼠的第3組動物腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液[四川坤慈農牧科技有限公司, 獸藥字(2015)221232511], 1 mg/100 g, 1次/日,第2組雄性動物同計量和方法注射植物油，連續20 d, 停藥飼養5 d后將所有動物施行安死術，備皮，觀察胸部和腹部皮膚高度，取胸部和腹部皮膚、肌肉及其之間的組織，用體積分數10%甲醛進行組織固定，石蠟包埋，連續切片，HE染色，進行組織病理學分析。

2 結果

2.1 雌性動物乳腺組織學觀察結果

鏡下觀察，雌性長爪沙鼠乳腺皮膚組織可見表皮、真皮，真皮下皮下組織，其內可見脂肪、肌肉組織及疏松結締組織(圖1A)。脂肪組織中腺泡增生，形成乳腺小葉(圖1B), 高倍鏡下可見乳腺腺泡擴張，乳汁潴留(圖1C)。小鼠雌性動物鏡下觀察，皮膚組織可見表皮、真皮，真皮下方皮下組織內可見脂肪、肌肉組織及疏松結締組織(圖2A)，脂肪層內可見3～4個不同孔徑的乳腺導管(圖2B)，乳腺導管擴張伴上皮增生(圖2C)。大鼠雌性動物鏡下觀察, 可見乳腺小葉(圖3A)及乳腺導管(圖3B, C),切片中也見乳頭及輸乳管。所有雌性動物均能觀察到完整的乳腺導管及乳腺小葉。

2.2 雄性動物乳腺組織觀察結果

正常雄性長爪沙鼠鏡下觀察，皮膚組織可見表皮、真皮，真皮下皮下組織(圖1D)，其內可見脂肪、肌肉組織及疏松結締組織(圖1E、F), 但未觀察到乳腺結構。正常雄性小鼠鏡下觀察, 表皮、真皮, 真皮下方皮下組織內可見脂肪、肌肉組織及疏松結締組織(圖2D), 連續切片第18～26張, 于疏松結締組織內可見乳腺導管上皮(圖2E、F)。大鼠雄性動物鏡下觀察表皮、真皮, 真皮下方皮下組織內可見脂肪、肌肉組織及疏松結締組織(圖3D), 切片中可見少量乳腺導管(圖3E、F)。

2.3 苯甲酸雌二醇誘導后雄性動物乳腺組織觀察結果

在苯甲酸雌二醇誘導后，雄性長爪沙鼠鏡下觀察，脂肪組織中大量腺泡增生形成密集的乳腺小葉(圖1G)，小葉間密集的炎細胞浸潤(圖1H)。部分乳腺腺泡擴張內乳汁潴留, 中性粒細胞、淋巴細胞為主的炎細胞浸潤(圖1I)。小鼠雄性動物鏡下觀察，有大量乳腺增生(圖2G, H)和乳汁潴留(圖2I)。大鼠雄性動物鏡下觀察, 有大量乳腺增生(圖3G, H)和少量乳汁潴留(圖3I)。

3 討論

長爪沙鼠作為實驗動物已經應用于乳腺相關疾病的研究中。早在1974年Rowe等[13]就報道老年長爪沙鼠會有自發性乳腺癌的發生。長爪沙鼠在妊娠期、哺乳期以及停乳等不同時期，其體內脫氫酶、核酸及可溶性蛋白等會有明顯變化[14]。此外，長爪沙鼠還用于甲狀腺素及雌激素調節泌乳期乳腺核內包涵體形成的研究[15,16]。

乳腺位于皮下淺筋膜的淺層與深層之間，是哺乳動物的重要器官。發育正常的乳房腺體由15～20個腺葉組成，每一腺葉分成若干個腺小葉，每一腺小葉又由10～100個腺泡組成，這些腺泡緊密地排列在小乳管周圍，腺泡的開口與小乳管相連。本實驗觀察到雌性長爪沙鼠，小鼠和大鼠均有較為完整的乳腺結構，雌性長爪沙鼠乳腺組織與小鼠、大鼠的乳腺組織較為類似。乳腺的發育與體內性激素的表達水平有著密切的聯系。雄性動物由于其體內雌激素表達量較低，乳腺往往發育不良。通過對皮下組織連續切片觀察，本實驗結果顯示正常雄性長爪沙鼠并沒有找到乳腺導管或乳腺小葉等乳腺結構，而在雌二醇的誘導下可以觀察到乳腺結構。在正常雄性大鼠和小鼠可見有乳腺導管，但相較于雌性動物，起乳腺導管數量較少。這些結果證明雄性長爪沙鼠存在乳腺，但因為體內雌激素基礎值較低而不能夠引起乳腺發育。

圖1 沙鼠乳腺組織結構觀察Figure 1 Observation on mammary histological structure in Mongolian gerbil

圖2 小鼠乳腺組織結構觀察Figure 2 Observation on mammary histological structure in mice

圖3 大鼠乳腺組織結構觀察Figure 3 Observation on mammary histological structure in rat

男性乳腺增生是臨床常見的疾病，但是尚缺少有效的預防和理想的治療手段。實驗動物疾病模型將大大促進發病機制和治療方法的研究。在動物實驗中已經證實體內維持較高含量的雌激素水平將促進乳腺增生[17-19]。例如通過連續注射雌激素可以導致雌性家兔、雌性大鼠及雌性小鼠出現較為明顯的乳腺增生現象。但關于雄性乳腺增生動物模型很少報道，王學魁等[20]，李春甫等[21]使用苯甲酸雌二醇成功在雄性大鼠復制出乳腺增生動物模型。本研究表明，與正常雄性長爪沙鼠相比，長時間腹腔注射苯甲酸雌二醇的雄性長爪沙鼠體內有大量腺泡增生形成密集的乳腺小葉，在部分乳腺腺泡擴張內有乳汁潴留。相較于苯甲酸雌二醇誘導的雄性小鼠和大鼠的乳腺增生情況，長爪沙鼠在誘導后乳腺組織附近出現了炎性細胞浸潤和大量脂肪組織。這與諶章慶等[22]報道的在男性乳腺增組織中有炎性細胞的組織浸潤，其組織內部間雜著大量脂肪組織的結果相一致。

通過使用苯甲酸雌二醇誘導雄性長爪沙鼠后，其乳腺有明顯增生，證明雄性長爪沙鼠具有乳腺組織。長爪沙鼠可以用于建立男性乳腺增生模型，該模型或可為男性乳腺增生的治療及發病機制研究提供新材料。

[1] Davanco RA, Sabino NM, Garcia EB, et al. Quality of life in the surgical treatment of gynecomastia[J]. Aesthetic Plast Surg, 2009, 33(4):514-517.

[2] Kocazeybek B, Saribas S, Ergin S. The role of Ad-36 as a risk factor in males with gynecomastia [J]. Med Hypotheses,2015, 85(6):992-996.

[3] Rohrich RJ, Ha RY, Kenkel JM, et al. Classification and management of gynecomastia: Defining the role of ultrasoundassisted liposuction[J]. Plast Reconstr Surg, 2003, 111(2):909-923.

[4] 鮑旭, 孫強, 郭春利, 等. 論男性乳腺發育癥臨床研究進展[J]. 醫學理論與實踐, 2015, 28(24):3339-3341.

[5] Gunhan-Bilgen I, Bozkaya H, Ustun E, et al. Male breast disease: clinical, mammographic, and ultrasonographic features[J]. Eur J Radiol, 2002, 43(3):246-255.

[6] 錢會利, 蔡景龍, 張纓, 等. 國人成年男性乳房美學標準的探討[J]. 中國實用美容整形外科雜志, 2004, 15(5):244-246.

[7] Hennighausen L, Robinson GW. Information networks in the mammary gland[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005,6(9):715-725.

[8] 周新麗, 徐進, 郭軍, 等. 男性乳腺發育癥[J]. 山東醫藥,2010, 50(17):110.

[9] Brown RH, Chang DK, Siy R, et al. Trends in the surgical correction of gynecomastia[J]. Semin Plast Surg, 2015,29(2):122-130.

[10] Li CC, Fu JP, Chang SC, et al. Surgical treatment of gynecomastia:complications and outcomes[J]. Ann Plast Surg, 2012, 69(5):510-515.

[11] Li CL, Du XY, Gao J, et al. Phylogenetic analysis of the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) from China based on mitochondrial genome[J]. Genet Mol Res, 2016, 15(3):1-13.

[12] 李長龍, 杜小燕, 陳振文. 長爪沙鼠資源開發利用進展[J].中國實驗動物學報, 2014, 22(6):106-109.

[13] Rowe SE, Simmons JL, Ringler DH, et al. Spontaneous neoplasms in aging Gerbillinae. A summary of forty-four neoplasms.[J]. Vet Pathol, 1974, 11(1):38-51.

[14] Waldemarson KH, Karlsson BW. Dehydrogenases, nucleic acids and soluble proteins in mammary gland of the Mongolian gerbil during pregnancy, lactation and involution[J].Comp Biochem Phys B, 1976, 55(1):109-115.

[15] Nickerson PA. Intranuclear inclusions in mammotrophs of the Mongolian gerbil: effect of low doses of estradiol benzoate and a study of females before weaning[J]. Tissue Cell, 1975, 7(4):773-776.

[16] Nickerson PA. Effect of partial thyroidectomy, propylthiouracil or thyroxine on estrogen-induced intranuclear inclusions in mammotrophs of the Mongolian gerbil [J]. Tissue Cell,1975, 7(4):763-772.

[17] Dearth RK, Hiney JK, Srivastava VK, et al. Prepubertal exposure to elevated manganese results in estradiol regulated mammary gland ductal differentiation and hyperplasia in female rats[J]. Exp Biol Med, 2014, 239(7):871-882.

[18] 賈敏, 姚秀娟, 陳水英, 等. 雌二醇復制家兔乳腺增生病理模型的方法[J]. 西北藥學雜志, 1996, 11(6):259-260.

[19] 鄒世潔, 陳小野, 蔣小麗, 等. 雌激素對大鼠性腺、乳腺影響觀察[J]. 中醫藥學刊, 2006, 24(1):52-54.

[20] 王學魁, 張敏, 續哲莉. 雄性大鼠乳腺增生模型的建立[J].中國實驗診斷學, 2010, 14(12):1896-1897.

[21] 李春甫, 齊山, 王長宏, 等. 自擬消癖湯治療雄性大鼠乳腺增生實驗研究[J]. 長春中醫藥大學學報, 2016, 32(6):1126-1128.

[22] 諶章慶, 唐朝暉, 黃宇烽. 男性乳腺增生[J]. 中華男科學,2000, 6(3):184.

Mammary Gland Hyperplasiain Model in Male Mongolian Gerbil Induced by Estradiol

WANG Cun-long, DU Xiao-yan, LIU Xin, GUO Meng, LV Jian-yi, CHEN Zhen-wen, LI Chang-long
(School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069, China)

ObjectiveTo establish mammary gland hyperplasia model in male Mongolian gerbil induced by estradiol.MethodsThe male Mongolian gerbils, mouse and rats were respectivelyipestradiol benzoate to establish mammary gland hyperplasia model. Observe and compare the mammary gland of the experimental group with the control group.ResultsHistological observation showed that the mammary gland was not found in the normal male gerbils, and mammary ductal and glandular lobes were found in the male gerbils induced by estrogen. In addition, compared with mouse and rats, the gerbils showed mammary gland hyperplasia with inflammatory cells infiltration.ConclusionsThe mammary gland hyperplasia was successful replicated in mouse, rats and gerbils induced by estradiol benzoate, and initially demonstrated that Mongolian gerbil can be used as male mammary gland hyperplasia animal model.

Mongolian gerbil; Estradiol; Gynecomastia

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0352-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.003

2017-03-08

國家科技支撐計劃課題(2015BAI09B01); 國家自然科學基金項目(31572348); 北京自然科學基金重點項目(714100)

王存龍(1991-), 男, 碩士研究生, 研究方向: 實驗動物遺傳學。E-mail: cunlongwang@qq.com

李長龍(1976-), 男, 博士, 副研究員研究方向; 分子遺傳學 。E-mail: li-changlong@126.com