瑞芬太尼聯(lián)合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠電生理及后肢功能的影響

李 敏, 楊 磊, 葉 奎

(1. 赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科, 赤峰024005;2. 赤峰市平莊礦區(qū)醫(yī)療集團(tuán)醫(yī)院麻醉科, 赤峰024076;3.天津市第四中心醫(yī)院血管外科, 天津300140)

瑞芬太尼聯(lián)合臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷大鼠電生理及后肢功能的影響

李 敏1, 楊 磊2, 葉 奎3

(1. 赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科, 赤峰024005;2. 赤峰市平莊礦區(qū)醫(yī)療集團(tuán)醫(yī)院麻醉科, 赤峰024076;3.天津市第四中心醫(yī)院血管外科, 天津300140)

目的 檢測(cè)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC)移植聯(lián)合瑞芬太尼對(duì)大鼠脊髓損傷電生理的影響及后肢功能變化。方法 83只成年Wistar大鼠，建立脊髓損傷模型，造模成功的80只大鼠運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組。①UCMSC移植組，經(jīng)尾靜脈泵注等體積UCMSC細(xì)胞液; ②對(duì)照組，尾靜脈注入培養(yǎng)液; ③瑞芬太尼組，瑞芬太尼注射液(2 mL·kg-1·h-1)尾靜脈泵注4 h; ④聯(lián)合組，尾靜脈注射UCMSC細(xì)胞后，經(jīng)尾靜脈泵注瑞芬太尼注射液(2 mL·kg-1·h-1) 持續(xù)4 h。依次于移植前及移植后1周、2周、4周、6周通過(guò)大鼠脊髓損傷(BBB)評(píng)分、改良Tarlov 評(píng)分、斜板試驗(yàn)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定。移植后4周取材行熒光顯微鏡觀測(cè)PKH-26標(biāo)記的UCMSC存活及病理切片HE染色及分布情況。第4周進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶(HRP)示蹤分析神經(jīng)纖維的再生情況，行運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)和體感誘發(fā)電位(SEP)分析大鼠神經(jīng)電生理恢復(fù)情況。結(jié)果 造模后，大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)聯(lián)合組優(yōu)于UCMSC移植組及瑞芬太尼組，UCMSC移植組和瑞芬太尼組優(yōu)于對(duì)照組。瑞芬太尼組和UCMSC移植組損傷區(qū)可見(jiàn)少量神經(jīng)軸索樣的結(jié)構(gòu)，該脊髓空洞比較小，聯(lián)合組可見(jiàn)較多的神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)脊髓空洞。HE染色，對(duì)照組可見(jiàn)脊髓組織缺失及脊髓空洞形成，無(wú)神經(jīng)軸索通過(guò)。移植后4周 HRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)和PKH-26陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)照組最少，聯(lián)合組最多，UCMSC移植組和瑞芬太尼組次之，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MEP潛伏期，對(duì)照組＞瑞芬太尼組與UCMSC移植組＞聯(lián)合組，且各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); SEP潛伏期，對(duì)照組＜瑞芬太尼組與UCMSC移植組＜聯(lián)合組，且各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 瑞芬太尼對(duì)脊髓損傷起到神經(jīng)保護(hù)的作用，UCMSC移植的同時(shí)泵注瑞芬太尼能夠促進(jìn)脊髓損傷大鼠神經(jīng)突觸的再生，改善大鼠電生理功能及肢體運(yùn)動(dòng)功能。

臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC); 瑞芬太尼; 大鼠; 脊髓損傷

脊髓損傷系脊髓受到暴力所造成的組織損害。在渾身遭遇的種種創(chuàng)傷性疾病中，脊髓損傷的發(fā)生率、死亡率和殘疾率都較高[1-3]。嚴(yán)重的脊髓損傷即使經(jīng)治療挽救了生命，但其所引發(fā)的運(yùn)動(dòng)、記憶等后遺癥卻極大地影響患者的生活質(zhì)量，給患者家庭與社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[4-6]。近年來(lái)，人們進(jìn)行了大量有關(guān)脊髓損傷后功能修復(fù)的探索，雖取得一定療效但神經(jīng)功能的缺損卻無(wú)法獲得更佳的改善[7,8]。如何解決此問(wèn)題一直是在基礎(chǔ)理論研究和臨床實(shí)踐上困惑醫(yī)學(xué)界的重大難題。

近年來(lái)，關(guān)于干細(xì)胞的研究成果不僅打破了神經(jīng)元?dú)麩o(wú)法再生的傳統(tǒng)概念，還提出干細(xì)胞具有很強(qiáng)增殖和分化能力，它已在脊髓損傷修復(fù)方面突出了不可估量的臨床應(yīng)用價(jià)值[9,10]。然骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有容易染菌，繁殖生長(zhǎng)分化能力隨傳代增多而下降，限定了其在臨床治療中的普遍應(yīng)用。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSC)與骨髓MSCs 相比， 除生物學(xué)特性相似外，顯示出進(jìn)一步低沉的免疫原性，且此類細(xì)胞在特殊既定的前提下可定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。瑞芬太尼系一類效果很強(qiáng)的阿片類鎮(zhèn)痛藥，因它能被迅速分解,具備半衰期短、藥物耐受性好等特性,在臨床麻醉中普遍使用。研究表明，瑞芬太尼對(duì)大鼠脊髓損傷有修護(hù)效果。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察UCMSC移植聯(lián)合瑞芬太尼對(duì)脊髓損傷電生理的影響及大鼠后肢功能變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雌性Wistar大鼠83只, 體質(zhì)量200～250 g購(gòu)自內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[SCXK(蒙)2015-0001]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[SYXK(蒙)2015-0001]。

1.2 主要試劑

胰蛋白酶、L-DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco BRL公司產(chǎn)品); PBS液(上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)有限公司); 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)用熒光抗體(美國(guó)BD公司); EDTA(天津市化學(xué)試劑一廠); 細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma 公司), PKH-26、水合氯醛(美國(guó)Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 采用體積分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛按350 mg/kg腹腔注射麻醉 Wistar大鼠。將Wistar大鼠于俯臥位固定在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)平臺(tái)上，腰背部備皮，全身消毒處理后，按T8-9棘突為切口中心，自大鼠背部正中逐層切開，充分顯露T7-10的棘突和椎板, 咬除T8-9棘突和部分椎板, 暴露硬膜保持完整, 作為損傷區(qū)。按照改良的Allen法打擊[11,12]造模, 將10 g重物自由落下, 撞擊大鼠硬膜及脊髓組織, 大鼠尾巴痙攣擺動(dòng)且雙下肢癱瘓表明造模成功。用雙氧水沖洗傷口, 逐層縫合大鼠損傷區(qū)切口。造模后每日擠尿2～3次, 直至大鼠恢復(fù)排尿反射。剔除造模失敗的2只及做骨髓MSCs培養(yǎng)時(shí)處死的1只, 余下80只大鼠納入實(shí)驗(yàn)。將其隨機(jī)分為4組: 各20只/每組: ①對(duì)照組尾靜脈注射1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液; ②UCMSC移植組:大鼠尾靜脈注射1 mL UCMSC (3×l06個(gè)/mL); ③瑞芬太尼組:經(jīng)尾靜脈泵注瑞芬太尼(1.2 μg·kg-1·h-1)4 h; ④聯(lián)合組: 大鼠尾靜脈注射1mL UCMSC(3×l06個(gè)/mL),同時(shí)經(jīng)尾靜脈泵注瑞芬太尼(1.2μg·kg-1·h-1)4h。

1.3.2 大鼠UCMSC的培養(yǎng) 無(wú)菌環(huán)境下，給待分娩雌鼠行剖宮產(chǎn)術(shù)，取臍帶血20 mL, 放置培養(yǎng)皿中, 預(yù)先配置體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，使用該培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿內(nèi)沖洗臍帶血3次[12]。無(wú)菌注射器抽取含有Hank’s液沖洗2次，制成細(xì)胞懸液。以1 000 r/min，離心12 min，去上清液，加入含有10%的胎牛血清(FBS)，100 U/mL青霉素G鈉，100 μg/mL硫酸鏈霉素，0.25 μg/mL兩性霉素B的DMEM基培養(yǎng)[13]。常溫靜置24 h后，貼壁細(xì)胞為UCMSC細(xì)胞，棄除未貼壁的細(xì)胞。每2日更換培養(yǎng)液，每6 h觀測(cè)一次細(xì)胞生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)95%后傳代，第3代用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 BBB評(píng)分、改良Tarlov 評(píng)分、斜板試驗(yàn)進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定 分別于移植前及移植后1周、2周、4周、6周采用BBB評(píng)分、改良Tarlov 評(píng)分及斜板試驗(yàn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定。BBB評(píng)分[13,14]:共22級(jí)，0級(jí): 后肢完全癱瘓，21級(jí): 功能正常，主要觀察指標(biāo)包括關(guān)節(jié)活動(dòng)次數(shù), 運(yùn)動(dòng)負(fù)荷、范圍,前肢、后肢及前爪、后爪、尾巴的協(xié)調(diào)程度。改良Tarlov 評(píng)分: 0級(jí): 后肢無(wú)活動(dòng), 不能負(fù)重; 1級(jí): 后肢可見(jiàn)活動(dòng)但不能負(fù)重; 2級(jí): 后肢活動(dòng)頻繁或有力,不能負(fù)重; 3級(jí): 后肢可支持體重, 能走1～2步; 4級(jí):可行走，僅有輕度障礙; 5級(jí): 行走正常。斜板試驗(yàn): 大鼠放置在光滑的木板上, 體軸垂直于板的垂直軸, 每個(gè)試驗(yàn)斜板的角度增加5°，當(dāng)最大角度時(shí)大鼠可停留5 s，則認(rèn)為有功能價(jià)值[15]。采取雙盲法進(jìn)行相關(guān)評(píng)分，評(píng)分均為兩人合評(píng)。每組隨機(jī)檢測(cè)5只，共檢測(cè)3次，取均值。

1.3.4 熒光顯微鏡觀測(cè)PKH-26標(biāo)記的UCMSC存活情況 移植后4周，將1 mL LDMEM培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清)和5 μL PKH-26溶液放入1.5 mL離心管中, 離心后即得PKH-26標(biāo)記液。當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)80%時(shí), 棄去離心管內(nèi)液體，用PBS沖洗3次，加入40 μL/cm2PKH-26標(biāo)記液，置于含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中, 37 ℃溫育20 min。棄液, 37 ℃下加入LDMEM溶液(含體積分?jǐn)?shù)5%FBS)5 mL, 溫育10 min。棄去溶液, 用購(gòu)置的培養(yǎng)液洗滌3次。對(duì)細(xì)胞的標(biāo)記形態(tài)及標(biāo)記效果進(jìn)行觀察。

1.3.5 熒光顯微鏡觀察HE染色及分布情況 于移植后4周對(duì)上述各組大鼠中隨機(jī)取5只，質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛腹腔麻醉后，開胸，暴露心臟，由升主動(dòng)脈為入口對(duì)大鼠進(jìn)行插管處理，插管深度至右心耳, 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，沖洗用生理鹽水。從病變部位取長(zhǎng)約1 cm的完整脊髓，經(jīng)分級(jí)系列酒精脫水，縱向切片，厚約20 μm。行HE染色，并觀察。隨機(jī)取5個(gè)視野，用高倍熒光顯微鏡(200×)觀察，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)PKH-26的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并取其平均值作為PKH-26的細(xì)胞數(shù)。

1.3.6 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)示蹤分析神經(jīng)纖維的再生情況 于移植后4周, 等量生理鹽水溶解HRP。各組隨機(jī)取5只大鼠, 麻醉后手術(shù)暴露脊髓。在T10髓背正中靜脈左/右側(cè)1 mm處進(jìn)針玻璃微管, 進(jìn)針深度1.5 mm。于40 min內(nèi)勻速注射50% HRP 1 μL,將微管停留腦內(nèi)30 min, 封閉切口, 正常飼養(yǎng)3 d。質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛麻醉后, 以溫?zé)岬馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛+質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.25%戊二醛固定液150 mL進(jìn)行心臟灌注, 并切取脊髓(T3-T11), 并其浸入4 ℃的質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%葡萄糖溶液，浸泡20 h后，取出脊髓制作成30 μm的橫切面冰凍切片。對(duì)切片進(jìn)行DAB 加強(qiáng)染色后以中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)脊髓橫切面上HRP 陽(yáng)性神經(jīng)纖維束數(shù)目, 各組隨機(jī)抽取5張切片進(jìn)行陽(yáng)性纖維束計(jì)數(shù)。

1.3.7 運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)和體感誘發(fā)電位(SEP)分析大鼠神經(jīng)電生理恢復(fù)情況 于移植后4周, 各組隨機(jī)選取5只大鼠，參考文獻(xiàn)[16,17]的方法用Keypoint 4誘發(fā)電位儀測(cè)定MEP和SEP。質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%水合氯醛腹腔注射麻醉，將其平放在水平面上, 后肢固定刺激電極。記錄電極安放于冠狀縫和矢狀縫愈合線的相交處頭皮下(即后肢皮層感覺(jué)區(qū)),參考電極置于其后方0.5 cm處。給予直流方波電脈沖刺激, 以后肢輕微抽動(dòng)為宜, 電流強(qiáng)度為5～15 mA,波寬0.2 ms, 頻率3 Hz, 疊加次數(shù)50～60次, 記錄SEP潛伏期及波幅的變化，觀察神經(jīng)電生理恢復(fù)情況。MEP檢測(cè): 麻醉后將針狀刺激電極置于頂冠狀縫前2 mm、矢狀縫旁2 mm處頭皮下(即大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)區(qū)), 刺激強(qiáng)度40 mA, 刺激波寬0.1 ms, 刺激頻率 1 Hz, 疊加次數(shù) 300～500 次, 掃描速度 5 ms/D, 靈敏度5 μV/D。觀察記錄MEP和SEP的變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 UCMSC的形態(tài)觀察

體外培養(yǎng)3 d的UCMSC，懸浮細(xì)胞逐漸壞死破碎，有較多貼壁細(xì)胞出現(xiàn)，可見(jiàn)形成的細(xì)胞集落，細(xì)胞胞體呈梭形，體積較大，形態(tài)以梭形、多角形為主，類似成纖維細(xì)胞，有粗大突起伸出。按照標(biāo)準(zhǔn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增流程按1∶2～1∶3傳代，放入體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行傳代細(xì)胞的培養(yǎng)，3周后形成幾十到幾百個(gè)細(xì)胞的克隆，進(jìn)一步傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞體積逐步增大，為成纖維樣的長(zhǎng)梭形細(xì)胞，單個(gè)核，有較長(zhǎng)的突起，折光性較強(qiáng)。隨著細(xì)胞的迅速增殖，3周后細(xì)胞生長(zhǎng)可達(dá) 80%～90%融合，形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，類似于骨髓MSCs。本研究采用培養(yǎng)第3代的UCMSC進(jìn)入實(shí)驗(yàn)(圖1)。

圖1 UCMSC的形態(tài)觀察

2.2 大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定

移植后，大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)聯(lián)合組優(yōu)于UCMSC移植組及瑞芬太尼組，UCMSC移植組和瑞芬太尼組優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)。各組大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分見(jiàn)表1、2、3。

2.3 PKH-26標(biāo)記UCMSC存活

移植后4周 HRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)和PKH-26陽(yáng)性細(xì)胞：對(duì)照組最少(圖2A)，聯(lián)合組最多(圖2D)，UCMSC移植組(圖2B)和瑞芬太尼組(圖2C)次之，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠BBB評(píng)分評(píng)定結(jié)果

表2 各組大鼠改良Tarlov 評(píng)分評(píng)定結(jié)果

表3 各組大鼠斜板試驗(yàn)評(píng)定結(jié)果

圖2 各組PKH26標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞(×200)

2.4 HE染色及分布情況

對(duì)照組可見(jiàn)脊髓組織缺失及脊髓空洞形成，無(wú)神經(jīng)軸索通過(guò)(圖3A)。瑞芬太尼組和UCMSC移植組損傷區(qū)可見(jiàn)少量神經(jīng)軸索樣的結(jié)構(gòu)，該脊髓空洞比較小(圖3B、C)，聯(lián)合組可見(jiàn)較多的神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)脊髓空洞(圖3D)。

圖3 各組大鼠的病理學(xué)觀察(HE×200)

2.5 HRP示蹤分析神經(jīng)纖維的再生

HRP示蹤法顯示瑞芬太尼組、UCMSC移植組及聯(lián)合組可見(jiàn)HRP標(biāo)記的神經(jīng)錐體細(xì)胞穿越損傷區(qū)。對(duì)照組(圖4A)大鼠T8 以上節(jié)段可見(jiàn)較少的HRP陽(yáng)性顆粒標(biāo)記的神經(jīng)錐體細(xì)胞。瑞芬太尼組(圖4B)及UCMSC移植組(圖4C)的HRP陽(yáng)性神經(jīng)錐體細(xì)胞數(shù)目較聯(lián)合組少，但較對(duì)照組多。聯(lián)合組(圖4D)脊髓可見(jiàn)到較多HRP陽(yáng)性顆粒標(biāo)記的神經(jīng)錐體細(xì)胞。瑞芬太尼組、UCMSC移植組于對(duì)照組比較，聯(lián)合組于瑞芬太尼組、UCMSC移植組比較，均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，各組大鼠HRP陽(yáng)性顆粒標(biāo)記的神經(jīng)錐體細(xì)胞見(jiàn)表4、圖4。

表4 各組大鼠HRP陽(yáng)性顆粒標(biāo)記的神經(jīng)錐體細(xì)胞

2.6 MEP和SEP分析大鼠神經(jīng)電生理恢復(fù)

MEP和SEP的潛伏期：對(duì)照組＞瑞芬太尼組與UCMSC移植組＞聯(lián)合組，且各組間差異均有顯著性意義(P＜0.05); 波幅: 對(duì)照組＜瑞芬太尼組與UCMSC移植組＜聯(lián)合組，且各組間差異均有顯著性意義(P＜0.05)(表 5)。

3 討論

脊髓損傷是一種可導(dǎo)致嚴(yán)重后果的創(chuàng)傷性疾病[18,19]。脊髓損傷的病理機(jī)制較為復(fù)雜, 病理生理過(guò)程主要包括兩個(gè)階段，即原發(fā)性損傷與脊髓損傷后脊髓出血水腫造成的繼發(fā)性損傷[20-23]。繼發(fā)性損傷在原發(fā)性損傷基礎(chǔ)上，損傷脊髓組織發(fā)生復(fù)雜的病理生理反應(yīng), 進(jìn)而導(dǎo)致脊髓組織結(jié)構(gòu)、功能的繼發(fā)性損害，給脊髓損傷后功能恢復(fù)造成障礙[24-27]。臨床中針對(duì)脊髓損傷后繼發(fā)性損害的治療較多，多采用藥物治療，然而藥物不良反應(yīng)較多，因此也限制了其發(fā)展[28-30]。大量研究[31,32]表明，干細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷具有保護(hù)作用，這一結(jié)論已得到公認(rèn)。實(shí)驗(yàn)研究[33,34]表明，UCMSC具有增殖力強(qiáng)、免疫原性低、利于進(jìn)行細(xì)胞移植，可以作為修復(fù)神經(jīng)功能受損的一種有效方法。研究[35,36]表明，UCMSC移植到受損傷的脊髓組織中，能產(chǎn)生新的神經(jīng)細(xì)胞，可以促進(jìn)脊髓組織的再生修復(fù)。

圖4 傷后8 周各組HRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)(×200)

表5 各組大鼠MEP和SEP變化

脊髓損傷后采取早期藥物治療可以對(duì)脊髓損傷患者運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)起到重要的輔助治療作用。瑞芬太尼可保護(hù)中樞系統(tǒng)減輕或免受損傷。此外，瑞芬太尼起效迅速、清除速率快，能夠抑制細(xì)胞凋亡，維持脊髓缺血損傷區(qū)域金屬元素 Ca2+等的穩(wěn)定，且少有不良反應(yīng)，已被廣泛應(yīng)用于臨床。早期應(yīng)用瑞芬太尼等藥物能夠抑制脊髓缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡， 發(fā)揮藥物預(yù)處理效應(yīng)。

本研究通過(guò)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)定、熒光顯微鏡觀測(cè)、病理切片HE染色觀察及神經(jīng)電生理等的檢測(cè),觀察大鼠脊髓損傷后功能的恢復(fù)情況，研究結(jié)果顯示, 移植后4周, 大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)聯(lián)合組優(yōu)于UCMSC移植組及瑞芬太尼組, UCMSC移植組和瑞芬太尼組優(yōu)于對(duì)照組。瑞芬太尼組和UCMSC移植組損傷區(qū)可見(jiàn)少量神經(jīng)軸索樣的結(jié)構(gòu)，該脊髓空洞比較小，聯(lián)合組可見(jiàn)較多的神經(jīng)軸索樣結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)脊髓空洞。HE染色，對(duì)照組可見(jiàn)脊髓組織缺失及脊髓空洞形成，無(wú)神經(jīng)軸索通過(guò)。移植后4周HRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)和PKH-26陽(yáng)性細(xì)胞: 對(duì)照組最少，聯(lián)合組最多，UCMSC移植組和瑞芬太尼組次之，每組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MEP和SEP的潛伏期: 對(duì)照組＞瑞芬太尼組與UCMSC移植組＞聯(lián)合組; 對(duì)照組＜瑞芬太尼組與UCMSC移植組＜波幅聯(lián)合組。這一系列結(jié)論說(shuō)明UCMSC移植和瑞芬太尼均可對(duì)脊髓損傷大鼠發(fā)揮治療作用，可促進(jìn)脊髓損傷大鼠神經(jīng)突觸的再生，改善其大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能，但聯(lián)用后對(duì)脊髓損傷大鼠具有更佳的修護(hù)作用。

綜上所述，瑞芬太尼聯(lián)合UCMSC能顯著改善大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能缺失狀況，對(duì)脊髓損傷起到神經(jīng)保護(hù)的作用，UCMSC移植的同時(shí)泵注瑞芬太尼能夠促進(jìn)脊髓損傷大鼠神經(jīng)突觸的再生，改善其大鼠電生理功能及肢體運(yùn)動(dòng)功能，從而施展修護(hù)脊髓損傷作用。目前關(guān)于干細(xì)胞移植治療脊髓損傷仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，仍需進(jìn)一步探索及大量的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)研究推動(dòng)，才可促進(jìn)臨床試驗(yàn)的應(yīng)用。

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Remifentanil Combined with Cord Blood Mesenchymal Stem Cells Transplantation on Hindlimb Function and Electrophysiology in Spinal Cord Injured Rats

LI Min1, YANG Lei2, YE Kui3
(1. Department of Anesthesiology, Affiliated Hospital of Chifeng College, Chifeng 024005, China;2. Department of Anesthesiology,Chifeng City General Hospital Medical Group Mining Pingzhuang, Chifeng 024076, China; 3. Department of Vascular Surgery, Tianjin Fourth Central Hospital,Tianjin 300140, China)

ObjectiveTo determine the effects of cord blood mesenchymal stem cells (UCMSC)transplantation combined with remifentanil on electrophysiology and hindlimb functionon in spinal cord injured rats.MethodsThe spinal cord injury model was established in 83 adult Wistar rats, the model rats were randomly divided into four groups. ①UCMSC transplantation group, via the tail vein infusion of equal volumes UCMSC cell sap. ② control group, refers to tail vein injection medium group.③ remifentanil group, remifentanil injection (2 mL·kg·h-1) via tail vein infusion of 4 h. ④ combined group, UCMSC cells injected intravenously via the tail vein and combined with infusion of remifentanil injection solution (2 ml·kg·h-1) continued 4 h. The spinal cord injury (BBB) score was evaluated before and 1 week, 2 weeks, 4 weeks and 6 weeks after transplantation. The modified Tarlov score and the slant plate test were used to evaluate the motor function. The survival and pathology of PKH-26-labeled UCMSC were observed by fluorescence microscopy at 4 weeks after transplantation. HRP (Horse Reddish Peroxidase) was used to analyze the regeneration of nerve fibers in the fourth week. MEP motor evoked potential and SEP somatosensory evoked potential were used to analyze the nerve Physiological recovery.ResultsCompared with UCMSC transplantation group and remifentanil group, UCMSC transplantation group and remifentanil group were better than the control group. There was a small amount of axonal-like structure in the injury area of Rufentini group and UCMSC transplantation group.The syndromes of the syringes were relatively small, and the ganglion-like structure was seen in the combined group. No syringomyelia was found. HE staining, the control group can be seen spinal cord loss and syringomyelia formation, no nerve axon through. The number of HRP-positive nerve fibers and PKH-26 positive cells were the lowest in the control group and the most in the control group, UCMSC transplantation group and remifentanil group were significantly different between the two groups at 4 weeks after transplantation (P＜0.05). MEP incubation group＞ remifentanil group and UCMSC transplantation group＞ and the difference between the groups were statistically significant (P＜0.05); SEP incubation period, control group, remifentanil group and UCMSC group, and the difference was statistically significant (P＜0.05).ConclusionRemifentanil may play a role in neuroprotective effects on spinal cord injury. At the same time, UCMSC transplanted with remifentanil can promote the regeneration of neuronal synapses in rats with spinal cord injury and improve the electrophysiological function and limb motor function of rats.

Cord Blood Mesenchymal Stem Cells (UCMSC); Remifentanil; Rat; Spinal cord injury

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0363-09

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.005

2016-07-11

2017-06-14

李 敏(1983-), 女, 主治醫(yī)師, 從事主要麻醉學(xué)工作。E-mail:liminrftn@163.com

葉 奎, E-mail:maomao111a@126.com