大鼠微小病毒和細小病毒雙重熒光定量PCR檢測方法建立

孫竹筠, 蔡驍垚,, 熊 煒, 陳懿斐, 張 泉, 李澤君, 魏曉鋒, 陳鴻軍

(1.中國農業科學院上海獸醫研究所, 上海 200241; 2. 揚州大學獸醫學院, 揚州 225009;3. 上海實驗動物研究中心, 上海 201203; 4. 上海出入境檢驗檢疫局, 上海 200135）

大鼠微小病毒和細小病毒雙重熒光定量PCR檢測方法建立

孫竹筠1, 蔡驍垚1,2, 熊 煒4, 陳懿斐3, 張 泉2, 李澤君1, 魏曉鋒3, 陳鴻軍1

(1.中國農業科學院上海獸醫研究所, 上海 200241; 2. 揚州大學獸醫學院, 揚州 225009;3. 上海實驗動物研究中心, 上海 201203; 4. 上海出入境檢驗檢疫局, 上海 200135）

目的 建立快速、準確地同時檢測和鑒別大鼠細小病毒(RPV)和大鼠微小病毒(RMV)的雙重TaqMan實時熒光定量PCR方法。方法 根據 GenBank中已公布的RMV NTU1株全基因組序列(JX627317.1)，在1 705～1 808 nt處設計引物和TaqMan探針，根據RPV NTU1毒株的全基因組序列(JX827169)，在863-967nt處設計引物和TaqMan探針。以構建的質粒參考物為模板建立熒光定量PCR檢測方法，并對該鑒別檢測方法的靈敏度、穩定性和特異性進行評價; 用建立的熒光定量方法對50份臨床樣品進行檢測，并用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的商品試劑盒進行驗證。結果 建立的RMV和RPV的鑒別熒光定量PCR方法標準曲線的線性關系良好，R2值可達0.99，最低檢測限均為10拷貝數/μL; 應用鑒別熒光定量PCR方法和ELISA檢測試劑盒，對100份大鼠肝臟和50份血清樣品病料進行檢測，結果均為陰性。結論 建立的RMV和RPV的TaqMan實時熒光定量PCR方法具有特異、靈敏的特點，適用于RMV和RPV的臨床監測。

大鼠微小病毒(RMV); 大鼠細小病毒(RPV); TaqMan探針; 熒光定量PCR

大鼠細小病毒(RPV)和大鼠微小病毒(RMV)是大鼠細小病毒(Parvovirus)中的兩株常見病毒株，具有細小病毒的典型特征，為無囊膜單股線狀DNA病毒，RPV和RMV感染表現出的臨床癥狀相似，所以需要通過雙重FQ-PCR技術同時檢測和鑒別這兩個病原體[1]。

在動物實驗中一旦使用細小病毒感染的大鼠，會嚴重影響實驗數據的準確性，特別是在涉及免疫學、器官移植、以及腫瘤學研究的動物實驗[2,3]。細小病毒能夠改變免疫應答反應，導致肝細胞壞死，影響神經系統、淋巴系統、消化系統、造血系統和生殖系統。成年大鼠感染大多無臨床癥狀，細小病毒還可污染腫瘤移植物和細胞系，對實驗研究產生嚴重干擾。細小病毒抵抗力強，在環境中長期保持傳染性，感染動物排毒時間長，一旦感染便難以根除，一直是健康監測的重點。

隨著我國實驗動物工作的法制化和規范化管理水平的提高，實驗動物生產和使用單位對實驗動物質量要求也越來越提高，開始加強對實驗動物健康的全面監測。RPV中，H-1和KRV已經被列入國家標準SPF級大鼠要求必須檢測項目，而Charles River Laboratories (CRL)公司把RPV、RMV、NS-1和RTV均列為檢測項目。在國內，有報道[4]已證實存在RPV和RMV感染大鼠情況。然而，這兩種病毒感染卻缺乏靈敏特異的分子生物學檢測方法。本研究擬建立TaqMan探針熒光定量PCR方法，以鑒別診斷RPV和RMV。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和病毒毒株

RPV和RMV ELISA試劑盒購于美國XpressBio公司。QlAamp DNA Mini kit購于德國Qiagen公司。TaKaRa ExTaq HS kit購于日本TaKaRa公司。小鼠微小病毒、RPV KRV株、RPV H1株、仙臺病毒(SEV)、小鼠呼腸孤病毒3型(Reo-3)和鼠痘病毒(ECT)由上海實驗動物研究中心保存。

1.2 參考物質粒構建與引物設計

通過MegAlign分析全基因序列，選出RPV(JX827169.1)的 863～963 bp和RMV(JX627317.1)的3 389～3 589 bp特異性序列區間，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成串聯的基因序列，與pUC57載體連接，構建pUC-RV作為參考物質粒。同時，根據該區域設計特異性引物，序列見表1。

表1 實驗所用引物信息Table 1 Primers in the experiment

1.3 熒光定量PCR方法反應體系及反應條件

使用美國ABI公司7500型熒光定量PCR儀，擴增反應總體系為20μL，其中Premix ExTaq(Probe qPCR)(2 ×)使用量為 10 μL, ROX Reference Dye II(50 ×)使用量為 0.2 μL，DNA模板使用量 2 μL, 加入引物(10 μmol/L)qRPV-F、qRPV-R、qRMV-F、qRMV-R 各0.4 μL，FAM-RPV探針(10 μmol/L)，FAM-RMV各0.8 μL, 用滅菌蒸餾水補足20 μL。采用優化后的反應程序進行反應, 反應條件為: 95℃預變性30 s; 95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，并采集熒光40個循環。

1.4 敏感性、特異性、重復性

將1×108拷貝/μL的參考物質粒pUC-RV，進行10倍梯度稀釋，用于進行敏感性測試; 用大鼠中常見的RPV KRV株、RPV H1株、SEV和ECT進行特異性檢測。以倍比稀釋的參考物質粒 PUC-RV作為模板，每個稀釋度設置3個重復孔來進行重復性實驗。方法的重復性以Ct值變異系數(標準偏差/重復值平均數)來評估。

1.5 臨床樣品檢測

初步運用建立的RMV和RPV的TaqMan探針熒光定量PCR方法，將采集來一一對應的100只大鼠的肝臟研磨液，進行組織DNA提取。抽提得到的DNA作為模板進行檢測。同時運用傳統的血清學ELISA方法檢測對應的100份血清樣品，對比兩種方法檢測的結果，確保檢測結果的準確性，同時也是對本研究建立方法的一種驗證。

2 結果

2.1 RPV和RMV各自特異性序列區間分析

從GenBank中調取細小病毒內的KRV(AF321230.1); 小鼠微小病毒(NC_001510.1); RPV H1(X01457.1); RMV NTU1(JX627317.1); RPV NTU1(JX827169.1)全基因序列。通過MegAlign分析全基因序列，表明RPV (JX827169.1)在863～963 bp的序列區間為特異性區間:cactgactctggctggaaatttaactttatgaaagaggcagacagacacttggtcagtacactttatactgatcaaatgaagccagaaacggttga gacca。RMV (JX627317.1)在3 389～3 589 bp(圖 1)。

2.2 熒光定量PCR的標準曲線

按pUC-RV質粒參考物1×108拷貝數/μL為起始模板濃度, 以倍比稀釋次數和相應的Ct值繪制出標準曲線(圖2)。得到的相關系數R2均大于0.99，標準曲線都具有良好的線關系，各個稀釋度相關性好，誤差較小。將1×108拷貝/μL的參考物質粒pUC-RV, 進行10倍梯度稀釋, 用于進行敏感性測試,Ct值大于35視為陰性。繪制不同濃度的模板下三組樣品的擴增曲線。結果顯示: 該方法具有良好的重復性, 最低可檢測模板濃度為10拷貝/μL(圖3), 約100 fg DNA。

圖1 使用MegAlign Clustal W方法進行序列比對Figure 1 Sequence alignments were performed using the ClustalW method in MegAlign

檢測方法中RPV產生的熒光強度明顯高出RMV,RMV的熒光擴增曲線也趨于平直, 很容易區分和辨別出, 且擴增曲線可靠, 所以雙重熒光檢測方法是可以同時鑒別并檢測RMV和RPV, 且靈敏度很高。

2.3 特異性試驗

對小鼠微小病毒、RPV KRV株、RPV H1株、仙臺病毒、小鼠呼腸孤病毒3型和鼠痘病毒進行檢測，除參考物有陽性擴增曲線外，其他病毒均沒有擴增曲線。這說明該方法與待檢的其他大鼠病毒病原體無交叉反應(圖4)。

2.4 重復性試驗

以倍比稀釋的參考物質粒 PUC-RV 作為模板，每個稀釋度設置3個重復孔來進行重復性實驗。對結果統計分析(表1)，對RMV檢測重復孔的變異系數為1.28%～2.91%，對RPV檢測重復孔的變異系數為0.12%～0.97%，變異系數小于3.0%，表明建立的RMV和RPV的熒光定量PCR檢測方法，具有較好的重復性和穩定性。

2.5 臨床樣品檢測

圖2 TaqMan熒光定量PCR檢測標準曲線Figure 2 Standard curve of TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR

圖3 TaqMan熒光定量PCR動力學曲線Figure 3 Dynamic Curve of TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR

圖4 TaqMan熒光定量PCR檢測方法的特異性Figure 4 Specificity of TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR

表2 RMV和RPV的熒光定量PCR檢測方法的重復性Table 2 Repeatability of qPCR method for detecting RMV and RPV

收集上海實驗動物研究中心用于檢測和科研的來自各單位的100只SPF級大鼠，采集各肝臟組織,提取DNA，使用建立的熒光定量PCR方法檢測，以質粒參考物模板為陽性對照，無RNA酶水模板為陰性對照。同時采集50只大鼠的血清樣品, 利用RPV和RMV的ELISA檢測試劑盒進行血清學檢測。結果表明，兩種方法檢測結果均呈陰性, 100只大鼠均未感染RPV和RMV，檢測結果相符合。

3 討論

RMV和RPV在大鼠群中的傳播能力非常強，且多為隱性感染并長期排毒，其傳播途徑為糞口途徑，所以要及早地發現并處理RPV感染，一旦蔓延，會造成嚴重損失。防治措施除對動物房的飼料、飲水和周圍環境消毒滅菌外，還要定期對實驗動物進行病原微生物監測。定期對動物房進行監測，確保第一時間發現疾病感染，是防控RPV感染最重要方法[5]。隨著我國實驗動物工作的法制化和規范化，我國實驗動物的質量已有明顯提升。雖然RPV H-1株和KRV株已被列入了國家標準SPF級大鼠必須檢測項目，但RPV和RMV也嚴重威脅著我國實驗大鼠健康安全。所以建立關于RPV和RMV的檢測方法十分必要。

目前，我國檢測RPV和RMV仍然利用傳統病毒抗體檢測方法，也就是先用ELISA對大鼠血清進行病毒抗體初步檢測，如出現陽性及可疑檢測結果的樣品，再用IFA進行復檢，檢測步驟繁瑣，操作過程中也容易污染，但準確性很高。ELISA與IFA檢測結果符合率為99.07%[4-6]。熒光定量PCR一直以來都是大鼠病毒的主要檢測手段之一[7-9]。本研究臨床檢測同樣也使用了傳統的ELISA對血清進行病毒抗體初步檢測，在運用建立的熒光定量PCR的檢測方法進行檢測，結果一致，均未見陽性RPV和RMV的感染。表明本研究建立的RPV和RMV的檢測方法是非常便捷和靈敏。

本研究側重于檢測方法的建立，檢測樣本只能說明該批SPF級大鼠不存在RPV和RMV的感染。目前，我國對實驗動物感染RPV和RMV病毒尚未引起足夠重視，但RPV和RMV重要性決定了這必將是國家標準要求的大鼠檢測項目，所以，建立RPV和RMV的熒光定量PCR的檢測方法非常重要。作者將收集更多地區的大鼠樣品，檢測和統計目前我國大鼠RPV和RMV感染情況，為實驗動物生產和使用單位制定健康監測方案以及動物病原體的凈化提供依據，也將為建立國家標準或地方標準提供重要參考依據。

[1] Besselsen DG, Romero MJ, Wagner AM, et al. Identification of novel murine parvovirus strains by epidemiological analysis of naturally infected mice [J]. J Gen Virol, 2006, 87(6): 1543-1556.

[2] 軍事醫學科學院實驗動物中心. 實驗動物病毒性疾病 [M].北京:農業出版社, 1992.

[3] 田克恭. 實驗動物疫病學 [M]. 北京: 中國農業出版社,2015.

[4] 王翠娥, 陳立超, 周倩, 等. 實驗大鼠和小鼠多種病毒的血清學檢測結果分析[J]. 實驗動物科學, 2014, 31(2): 20-24.

[5] Liang CT, Shih A, Chang YH, et al. Microbial contaminations of laboratory mice and rats in Taiwan from 2004 to 2007 [J].J Am Assoc Lab Anim Sci, 2009, 48(4):381-386.

[6] Roble GS, Gillespie V, Lipman NS. Infectious disease survey of Mus musculus from pet stores in New York City [J]. J Am Assoc Lab Anim Sci, 2012, 51(1):37-41.

[7] 李曉波, 付瑞, 王吉, 等. 大鼠細小病毒 H-1株和 KRV 株雙重 PCR檢測方法的建立及應用 [J]. 中國比較醫學雜志,2015(6): 46-52.

[8] Besselsen DG. Detection of rodent parvoviruses by PCR [J].Methods Mol Biol, 1998, 92:31-37.

[9] Zhan D, Roy MR, Valera C, et al. Detection of minute virus of mice using real time quantitative PCR in assessment of virus clearance during the purification of mammalian cell substrate derived biotherapeutics [J]. Biologicals, 2002, 30(4): 259.

Establishment of TaqMan Real-time Fluorescent Quantitative PCR for Detecting Rat Minute Virus and Rat Parvovirus

SUN Zhu-yun1, CAI Xiao-yao1,2, XIONG Wei4, CHEN Yi-fei3,ZHANG Quan2, LI Ze-jun1, WEI Xiao-feng3, CHEN Hong-jun1
(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China.2. Veterinary Medicine College, Yangzhou University, Yangzhou Jiangsu 225009, China.3. Shanghai Lab. Animal Research Center, Shanghai 201203, China.4 Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China)

ObjectiveTo establish TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR method which can detect rat minute virus (RMV) and rat parvovirus (RPV) quickly and accurately in clinic.MethodAccording to the whole genome sequence of strain RMV NTU1 (Accession No. JX627317.1 in Genbank) the primers and TaqMan probe were designed from the 1705～1808 nt. And according to the whole genome sequence of strain RPV NTU1 (JX827169) the primers and TaqMan probe were designed from the 863-967nt. The stability, specificity, and sensitivity of the method were evaluated through realtime quantitative PCR method, which is based on the standardized plasmid constructed. 50 clinical samples were detected using this fluorescence quantitative method, which validated with the traditional ELISA method.ResultThe real-time quantitative PCR for detecting RMV and RPV showed a perfect linear relationship of standard curve, and R2value reached 0. 99 with a high specificity. The sensitivity of the real-time PCR was 10 copies/μL at minimum. Due to dual specificity of primer and probe, TaqMan quantitative PCR is extremely accurate. One hundred liver samples and 50 serum samples were negative via ELISA and real time quantitative PCR respectively.ConclusionThe TaqMan probe-based real-time PCR method is established with good specificity and sensitivity, which can make a powerful technical support for RMV and RPV investigation and detection.

Rat minute virus (RMV); Rat parvovirus (RPV); TaqMan probe; Real-time PCR

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0372-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.006

2017-03-06

上海市科委實驗動物專項資金資助(15140900600)

孫竹筠(1981-), 女, 碩士, 主要從事動物生態毒理研究。E-mail: sunzhuyun@shvri.ac.cn;

共同第一作者: 蔡驍垚(1990-), 男, 碩士研究生, 主要從事動物病毒學研究。E-mail: 1007567118@qq.com

陳鴻軍, 研究員。vetchj@shvri.ac.cn魏曉鋒, 副研究員。wei.xf@outlook.com