小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR檢測方法的建立

伍妙梨, 朱余軍, 饒 丹, 袁 文, 王 靜, 叢 鋒, 黃 韌, 陳梅麗, 郭鵬舉

(廣東省實驗動物監測所, 廣東省實驗動物重點實驗室, 廣州510663)

小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR檢測方法的建立

伍妙梨, 朱余軍, 饒 丹, 袁 文, 王 靜, 叢 鋒, 黃 韌, 陳梅麗, 郭鵬舉

(廣東省實驗動物監測所, 廣東省實驗動物重點實驗室, 廣州510663)

目的 建立敏感性高、特異好的小家鼠螺桿菌(Helicobacter muridarum) TaqMan-qPCR檢測方法。方法 選擇小家鼠螺桿菌保守基因GyrB設計特異性引物進行PCR擴增，并構建質粒標準品GyrB-19T。通過反應體系及條件的優化，建立小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR檢測方法，并對GyrB-19T標準品進行定性及定量分析，評估該方法的靈敏度、特異性及重復性。結果 所建立的qPCR檢測方法，質粒標準品濃度在2×102～2×108拷貝/μL范圍內表現出較好的線性相關性，所得標準曲線的斜率為-3.57，相關系數為0.996，檢測靈敏度達到200拷貝/μL。結論 所建立的小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR方法具有特異性好、敏感性高、穩定性強等特點，適用于小家鼠螺桿菌的定量及定性分析。

小家鼠螺桿菌; TaqMan-qPCR

嚙齒動物螺桿菌(rodent helicobacter)是一類寄居在嚙齒動物消化道的螺桿菌屬細菌總稱，常以隱性感染形式普遍存在于大鼠、小鼠、倉鼠、蒙古沙鼠等動物的消化道中，可引起嚙齒動物的多種胃腸道疾病[1]。目前，從嚙齒動物體內陸續分離出較為重要的腸道螺桿菌主要有膽汁螺桿菌(Helicobacter bilis)、肝螺桿菌(Helicobacter hepatitis)、嚙齒類螺桿菌(Helicobacter rodentium)、小家鼠螺桿菌(Helicobacter muridarum)、盲腸螺桿菌(Helicobacter typhlonius)等[2,3]。

小家鼠螺桿菌于1992年首次從小鼠腸黏膜中分離得出，其主要寄生在小鼠、大鼠等嚙齒動物的胃及腸道黏膜中，可引起小鼠的腸胃炎而導致動物體弱影響動物健康，甚至影響實驗動物的質量及干擾實驗結果，造成人力、物力資源的浪費[4]。目前用于小家鼠螺桿菌隱性感染的檢測主要有病原學、血清學及分子生物學方法。傳統的細菌分離培養方法費時費力，且因小家鼠螺桿菌的生長條件苛刻而失敗率較高; 血清學檢測方法雖然簡單便捷，但是由于診斷抗原和商品化試劑盒的缺乏，而限制了其應用。分子生物學方法如普通PCR、巢式PCR、多重PCR等在螺桿菌檢測中已被大量運用，但存在假陽性及污染問題[5]。TaqMan探針型實時熒光定量PCR(TaqMan-qPCR)因其高敏感性、高特異性、結果直觀并可準確定量等優點而被廣泛應用于病原菌的檢測[6]。本研究旨在建立一種靈敏度高、特異性強、快速準確檢測小家鼠螺桿菌的TaqMan-qPCR方法。

1 材料與方法

1.1 菌種及臨床樣本的收集

小家鼠螺桿菌ATCC51212、膽汁螺桿菌ATCC51630、肝螺桿菌ATCC51449等購自美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)，大腸桿菌DH-5α菌株購自大連寶生生物有限公司; 盲腸螺桿菌及鼠傷寒沙門氏菌均由本實驗室分離保存。臨床樣品來自褐家鼠(Rattus norvegicus)，捕獲于廣州市某實驗動物養殖場附近，共25只。樣本采集在本實驗室的屏障環境實驗間, 無菌采集盲腸內容物共計25份，于-20℃保存。

1.2 試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒等購自天根生化科技有限公司; Premix Ex TaqTM (Probe qPCR)、pMDTM19-T Vector 等均購自大連寶生生物有限公司。

1.3 引物及探針的合成

根據小家鼠螺桿菌gyrase B(GyrB)基因序列的保守區域設計特異性引物(GyrB-F、GyrB-R)及探針(GyrB-P), 同時設計一對普通引物(GyrB-S、GyrB-A)用以擴增GyrB基因長片段(表1)。引物及探針等均由上海立菲生物技術有限公司合成。

表1 所用引物及探針Table 1 Primer and probe

1.4 制備質粒標準品

將擴增的GyrB基因片段PCR產物純化后進行TA克隆插入到pMD-19T載體，并轉化DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，經PCR菌液鑒定后送invitrogen公司測序。將測序正確的陽性克隆增殖培養，提取重組質粒。

1.5 Taq-qPCR反應體系的建立和優化

根據Takara Premix Ex TaqTM (Probe qPCR)的操作說明書配制qPCR反應體系，分別對引物濃度(0.1～1 μmol/L)，探針濃度(0.1～1 μmol/L)、循環數(36～45個循環)等條件進行優化，通過比較Ct值、熒光強度等來判定優化結果，建立小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR方法。

1.6 敏感性分析

為了評估TaqMan-qPCR方法的敏感性，將GyrB質粒標準品母液進行10倍梯度稀釋，取108～100拷貝/μL共9個梯度稀釋度的質粒作為反應模板，每個稀釋度做3個復孔，同時以pMD-19T空質粒為陰性對照，ddH2O為空白對照。通過實時熒光定量PCR儀自動繪制線性標準曲線。

1.7 特異性分析

以膽汁螺桿菌(H.bilis)、嚙齒類螺桿菌(H.rodentium)、肝螺桿菌(H. hepatitis)、盲腸螺桿菌(H.typhlonius)、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌等細菌DNA作為模板進行小家鼠螺桿菌qPCR特異性檢測，同時以pMD-19T空質粒為陰性對照，水作為空白對照，每個樣品做2個重復。

1.8 重復性分析

選取5個濃度梯度模板測定其Ct值，并重復5次，通過計算Ct值的變異系數CV來評價檢測方法的重復性。

2 結果

2.1 GyrB-19T重組質粒的構建

以小家鼠螺桿菌的基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得小家鼠螺桿菌GyrB基因片段，長度為756 bp，經過TA克隆獲得重組質粒(圖1)。經測序鑒定與NCBI中GyrB基因片段序列一致。

M: DL2000 DNA分子質量標準; 1～4: GyrB-19T質粒陽性克隆菌落圖 1 重組質粒GyrB-19T的菌液PCR鑒定DL2000 DNA Marker (M) and positive plasmid colony of GyrB-19TFigure 1 Result of PCR identification of the recombinant plasmid GyrB-19T

2.2 Taq-qPCR反應體系的建立

通過對引物濃度、探針濃度、循環數等條件摸索, 得出最佳反應條件是每20 μL反應體系中加入 10 μL Premix Ex Taq, 0.2 μL ROX Reference DyeII，上下游引物各 0.2 μmol，探針 0.2 μmol，模板2 μL。反應程序為: 95 ℃預變性30 s后進入PCR擴增階段，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s ，共40個循環。其中60 ℃ 34 s為熒光收集階段。

2.3 定量線性分析及敏感度檢測

實驗結果顯示, 在 2 ×102～2 × 108拷貝 /μL濃度，標準曲線的線性關系較好，擴增曲線呈S型(圖2)，Ct值在16～38。所得標準曲線定量線性方程所得斜率為 -3.57, 截距為44.17，線性相關系數為0.996。而2×10拷貝/μL和2×102拷貝/μL組因模板濃度較低，接近TaqMan探針的臨界檢測濃度，線性相關性不好，故排除。故本研究建立的小家鼠螺桿菌TaqMan熒光定量PCR檢測方法的靈敏度為200個拷貝/μL。定性判定可認為Ct值大于38為陰性，Ct值小于38為陽性。

2.4 特異性分析

除了小家鼠螺桿菌有擴增外，其他幾種細菌模板包括陰性對照和空白對照均未出現特異性擴增條帶，其所對應的擴增曲線均為平緩直線。故認為該方法對小家鼠螺桿菌核酸的檢測是特異的。

圖2 GyrB-19T質粒標準品10倍倍比稀釋qPCR擴增熒光動力曲線及標準曲線Figure 2 The fluorescence quantitative amplification plot and standard curve of 10-fold serial dilution standard plasmid

圖3 小家鼠螺桿菌qPCR檢測方法特異性分析Figure 3 The specificity evaluation of qPCR method

2.5 重復性分析

2×102～2×108拷貝/μL的模板重復測定5次，分別得到5個Ct值，計算Ct值平均值、標準差和變異系數(表2)。由表2可知，本檢測方法的重復性較好。

2.6 臨床樣品檢測

用本研究建立的TaqMan-qPCR方法及普通PCR方法對25份臨床樣品進行檢測，并對擴增產物進行測序分析。結果顯示，用TaqMan-qPCR檢測出陽性樣品16份(檢出率64%)，而普通PCR檢測出的陽性樣品為14份(56%)。經測序分析，TaqMan-qPCR的檢測結果與測序結果一致。

表2 小家鼠螺桿菌qPCR檢測方法的重復性實驗Table 2 The repeatability evaluation of 10-fold serial dilution of GyrB-19T

3 討論

螺桿菌是一類最初從人類及其他哺乳動物的胃組織中分離出來的螺旋彎曲狀細菌，為微需氧革蘭氏陰性菌[7]。根據其定植部位的不同可分為胃內螺桿菌(gastric helicobacter species)和肝腸螺桿菌(enterohepatic helicobacter species, EHS)。嚙齒動物螺桿菌屬于肝腸螺桿菌菌屬, 主要寄居于消化道中,包括盲腸、結腸及肝膽管系統[8]。螺桿菌的致病力較低，故多數動物表現為潛伏性、慢性感染，臨床癥狀不明顯，但對于免疫缺陷動物、轉基因動物或免疫力較低的動物, 可導致臨床炎癥、肝膽疾病、腫瘤甚至致死性疾病等，嚴重影響動物的質量。若使用隱性攜帶螺桿菌的動物進行致病機理、藥物篩選、藥效研究、藥品及保健品的安全性評估時, 必然會干擾實驗結果，故被國際實驗動物理事會列為嚙齒類實驗動物必須排除的病原微生物。

目前動物中具有致病性報道較多的螺桿菌是肝螺桿菌和膽汁螺桿菌，而對于小家鼠螺桿菌的報道甚少。小家鼠螺桿菌, 主要寄生在大、小鼠的消化道, 與大、小鼠的胃炎、腸炎發生相關[4]。若使用感染的實驗動物進行胃炎、腸炎相關實驗, 必將影響實驗結果。因此, 小家鼠螺桿菌在實驗動物中的感染已引起研究者的高度重視[9]。目前, 在國內對小家鼠螺桿菌的檢測缺乏有效方法，而未被列入實驗動物國家質量標準，造成我國實驗動物科研領域與國際水平的差距，影響我國實驗動物產業化,并對實驗動物進出口帶來不利影響[10]。因此, 建立一種簡單、快速、高效、準確的檢測小家鼠螺桿菌的方法對保證及提高實驗動物質量至關重要。

在螺桿菌檢測研究的早期，細菌分離培養法因其結果直接可靠而成為螺桿菌診斷的首選方法，鑒于其生長條件苛刻，該方法的成功率較低而限制了其應用。近年來，隨著分子生物學的快速發展，PCR檢測技術因其快速準確、操作便捷而被廣泛應用于病原微生物的檢測[11-13]。與常規PCR相比，實時熒光定量PCR具有特異性更強、檢驗時間短、有效解決PCR產物污染問題等特點而被廣泛應用于分子生物學研究的各個領域[14,15]。

本研究所建立的小家鼠螺桿菌TaqMan-qPCR檢測方法具有敏感、穩定及特異性好等特點，其定量準確性達到200拷貝/μL?？捎糜谛〖沂舐輻U菌的快速檢測及定量分析。

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Development of TaqMan-qPCR for Detection of Helicobacter muridarum

WU Miao-li, ZHU Yu-jun, RAO Dan, YUAN Wen, WANG Jing,CONG Feng, HUANG Ren, CHEN Mei-li, GUO Peng-ju
(Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangdong Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663, China)

ObjectiveTo establish the sensitive and specific TaqMan-qPCR method for detection ofHelicobacter muridarum.MethodThe specific primers were designed according to theHelicobacter muridarumgyrase B(GyrB) gene, specific fragment was amplified by PCR, and cloned into pMD-19T vector to construct the recombinant plasmid GyrB-19T, which was used as standard DNA of this qPCR method. The qPCR system was optimized and the sensitivity, specificity, repeatability and quantitative range of this method were evaluated.ResultThe quantitative standard curve from 2×108copies/well to 2×102copies/well of serial diluted plasmid DNAs showed that they had good liner correlation, the slope of the standard curve was -3.57, R2＞0.996, and the lowest detection limit reached 2× 102copies/well.ConclusionThis qPCR method showed high sensitivity, specificity and stability, which will be utilized for qualitative and quantitative detection of Helicobacter muridarum.

Helicobacter muridarum; TaqMan-qPCR

S855.3 Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0378-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.007

2017-03-23

廣東省省級科技計劃項目(2013B060400028;2014A070705003; 2014B070706006)

伍妙梨(1987-), 女, 碩士, 研究方向: 預防獸醫學。E-mail: 983671845@qq.com

郭鵬舉, 研究員。E-mail: 1517727522@qq.com