應用樹鼩對硫酸乙酰肝素佐劑的安全性初步評價

李彥涵, 李建芳, 孫 靜, 烏美妮, 王海璇, 胡云章

(中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所疫苗研究室云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室 云南省重大傳染病疫苗工程技術研究中心, 昆明 650118)

應用樹鼩對硫酸乙酰肝素佐劑的安全性初步評價

李彥涵, 李建芳, 孫 靜, 烏美妮, 王海璇, 胡云章

(中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所疫苗研究室云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室 云南省重大傳染病疫苗工程技術研究中心, 昆明 650118)

目的 通過檢測佐劑硫酸乙酰肝素(HS)對樹鼩皮膚的刺激性反應以及佐劑與甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)聯合免疫樹鼩后主要組織器官的病理分析，探討以樹鼩作為動物模型進行安全性評價的可行性。方法 根據給藥次數和皮膚是否完整將樹鼩隨機分組，采用樹鼩同體自身左右對比的方法進行皮膚刺激性實驗。根據疫苗及佐劑種類將樹鼩隨機分組，采用皮下免疫方式，免疫后20周取主要組織器官制備病理切片，HE染色，觀察主要組織器官病理學特征。結果 佐劑HS單次及多次給藥對樹鼩完整皮膚組和破損皮膚組的受試部位均不產生紅斑、水腫等刺激性變化。與對照組相比， HepA-l免疫組以及HepA-l聯合HS免疫組的心、肝、脾、肺、腎及大腦組織病理觀察，均未見明顯異常。結論 證實了以樹鼩作為動物模型進行疫苗安全性評價的可行性，為以后疫苗及藥物評估平臺建設提供了基礎數據。

樹鼩; 硫酸乙酰肝素(HS); 甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l); 皮膚刺激性實驗; 病理分析;安全性評價

樹鼩(Tupaia belangeri, Tree shrew)是一種生長于熱帶和亞熱帶地區的接近靈長類動物的小型哺乳類動物，具有體型小、比較容易飼養及在生物進化史上更接近人類等優點，早在1970、1980年代就用于醫學實驗研究[1-3]。因此以樹鼩作為人類重大疾病研究的動物模型[4-6], 在醫學生物學上已呈現出廣闊應用前景[7-10]。目前國內外對疫苗安全性評價大多選用大鼠、小鼠或靈長類動物模型，而以樹鼩作為動物模型對疫苗進行安全性評價卻缺乏報道，制約了樹鼩作為標準化動物模型的建立。

本實驗觀察佐劑硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)對樹鼩皮膚的刺激反應，并將甲型肝炎減毒活疫苗(Hepatitis A virus attenuated live vaccine, HepA-l)與HS聯合對樹鼩進行免疫，免疫后解剖樹鼩取主要組織器官進行組織病理學檢查，為樹鼩作為動物模型進行疫苗免疫或安全性評價提供病理學方面的指標，并為樹鼩標準化模型的建立完善數據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級成年雄性樹鼩, 體質量130～160 g, 來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。所有相關操作均按照醫學生物學研究所動物實驗倫理委員會要求進行, 動物飼養設施符合相關標準[SYXK(滇)K2014-0007]。

1.2 疫苗及佐劑

HepA-l, 甲型肝炎病毒(HAV)抗原滴度256 EU/mL,由中國醫學科學院醫學生物學研究所提供；HS(1 mg/mL)購自美國Sigma公司。

1.3 皮膚刺激性實驗

1.3.1 實驗動物及分組 選取健康樹鼩16只, 隨機分為單次給藥組和多次給藥組, 每組各8只, 其中單次給藥完整皮膚組、單次給藥破損皮膚組、多次給藥完整皮膚組以及多次給藥破損皮膚組各4只。

1.3.2 樹鼩皮膚準備 各組樹鼩在實驗前24 h采用質量分數6%硫化鈉水溶液脫毛，去除樹鼩背部脊柱兩側毛發，每側脫毛面積為20 cm2左右，脫毛后觀察皮膚是否有損傷，若無損傷則作為完整皮膚組繼續實驗; 破損皮膚組用滅菌針尖將去毛消毒皮膚劃破，以見有滲血為度[11,12]。

1.3.3 單次皮膚刺激實驗 根據分組每只樹鼩采用同體自身左右對比，背部去毛區左側涂HS 50 μg，右側涂0.5 mL生理鹽水作為對照，給藥部位用一層油紙外加兩層紗布包裹固定，6 h后用溫水去除殘留涂抹物，之后1h、24 h、48 h、72 h肉眼觀察，記錄給藥部位紅斑及水腫情況，按評分標準判斷刺激強度。

1.3.4 多次給藥皮膚刺激實驗 按單次皮膚刺激實驗方法, 6 h后去除固定, 每日給藥1次, 連續1周,末次去除涂抹物后1 h、24 h、48 h、72 h肉眼觀察，記錄給藥部位紅斑及水腫情況，按評分標準判斷刺激強度。

1.3.5 皮膚刺激性反應評分標準 以皮膚出現紅斑、水腫等為評價指標。無紅斑分值為0，輕度紅斑分值為1，中度紅斑分值為2，重度紅斑分值為3，紫紅色紅斑到輕度焦痂形成分值為4。無水腫分值為0，輕度水腫分值為1，中度水腫分值為2，重度水腫分值為3，嚴重水腫分值為4。并根據紅斑和水腫的積分制計算皮膚刺激強度, 公式為: 每組動物平均分值=Σ紅斑和水腫積分/每組動物數[11-13]。

1.4 樹鼩經疫苗及佐劑免疫后的組織病理學檢查

1.4.1 疫苗與佐劑使用劑量及制備 本實驗室前期以小鼠為模型摸索出單獨免疫HepA-l合適使用劑量是18EU, HS合適使用劑量是100 μg[14]。將疫苗與佐劑混合后, 在漩渦振蕩儀上劇烈震蕩混勻, 備用。

1.4.2 動物分組及免疫 將24只成年健康雄性樹鼩分為HepA-l免疫組、HepA-l聯合佐劑HS組以及空白對照組，免疫途徑為皮下免疫，每組8只，免疫后20周取材進行組織病理學檢查。檢測前樹鼩禁食禁水12～14 h，戊巴比妥(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，股動脈放血處死。立即解剖取腦、肝臟、腎臟、心、肺等各組織標本用體積分數10%中性甲醛溶液固定72 h以上。用全自動脫水機脫水透明，常規石蠟包埋，全自動染色機HE染色、封片[15]。在光學顯微鏡下進行病理組織學檢查。

2 結果

2.1 佐劑HS對樹鼩皮膚刺激

2.1.1 單次刺激 佐劑HS 對樹鼩單次給藥完整皮膚組和破損皮膚組的受試部位均無紅斑、水腫等刺激性變化，除破損皮膚組1 h的平均分值為0.25外其余均為0，表明佐劑HS單次給藥對樹鼩的皮膚沒有刺激性(表1)。

2.1.2 多次刺激 佐劑HS 對樹鼩多次給藥完整皮膚組和破損皮膚組的受試部位均無紅斑、水腫等刺激性變化, 除完整皮膚組1 h的平均分制為0.25以及破損皮膚組1 h的平均分值為0.5外，其余均為0，表明佐劑HS多次給藥對樹鼩的皮膚無明顯刺激性(表 2)。

2.2 樹鼩經疫苗及佐劑免疫后的組織病理學檢查

實驗期間各組樹鼩體質量、毛色均正常，未出現蜷縮、豎毛、搔鼻、抽搐、痙攣、水腫及休克等異常反應，各組樹鼩注射部位均未出現紅腫、結節，進食、水、糞便和精神等均正常。

樹鼩經HepA-l以及HepA-l聯合佐劑HS免疫后，主要組織器官的病理切片與空白對照組相比，未見明顯異常的病理學改變，說明甲肝疫苗聯合佐劑免疫樹鼩具有良好的安全性(圖1)。

3 討論

樹鼩是在進化中處于食蟲類和靈長類之間，接近靈長類的小型哺乳動物。由于其具有體型小、壽命較長等特點，在生理機能、生化代謝和基因組的相似性方面比大鼠、小鼠等實驗動物更接近于人，現已廣泛應用于醫學研究[16-18]。目前國內外對于疫苗評價大多選用小鼠或者靈長類動物模型，各種檢測技術都比較成熟，但目前還尚未有樹鼩作為動物模型進行疫苗安全性評價的相關報道。

本實驗以樹鼩為動物模型，觀察佐劑HS對樹鼩皮膚的刺激反應，并將HepA-l疫苗與HS聯合對樹鼩進行免疫，免疫后解剖樹鼩分析各主要組織器官的病理學切片，完成佐劑安全性的初步評價。

表1 佐劑HS單次給藥對樹鼩皮膚刺激的測定結果(n=4)

表2 佐劑HS多次給藥對樹鼩皮膚刺激的測定結果 (n=4)

HS是一類廣泛分布于細胞外基質的糖胺聚糖，當細胞外基質發生炎癥或損傷時，降解為可溶性低分子量HS[19]。HS作為免疫佐劑能增強以小鼠為動物模型的體液免疫應答，并且對于以乙型肝炎病毒亞單位為抗原的體液免疫增強效應優于鋁佐劑或與鋁佐劑相當[20]。以佐劑HS作為涂抹物檢測樹鼩完整皮膚和破損皮膚的刺激性，實驗結果表明，佐劑HS 對樹鼩單次及多次給藥完整皮膚組和破損皮膚組的受試部位均無紅斑、水腫等刺激性變化。另外, 本實驗對樹鼩進行HepA-l以及HepA-l聯合HS免疫后，分別于末次免疫后的4周、8周、12周、16周和20周尾靜脈采血，用ELISA法檢測了樹鼩血清中的特異性IgG抗體水平。研究結果表明，除空白對照組外，其余組均在末次免疫的第四周檢測到抗-HAV抗體，并且抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，于第12周達到峰值，此后逐漸下降[21]。說明以樹鼩作為動物模型進行疫苗檢測是可行的，樹鼩可以對疫苗產生良好的免疫應答，體液免疫效果復合研究預期[21]。甲型肝炎減毒活疫苗HepA-l自1992年在我國大規模推廣應用至今已有10余年，為預防甲型肝炎的傳播發揮了巨大的作用。文獻報道[22,23]以獼猴等靈長類為動物模型進行HepA-l的安全性評價，結果表明實驗動物在接種免疫后，無接種部位和全身異常反應，肝組織在觀察全程無病理改變，尸檢均未見甲肝病變。 本實驗以樹鼩作為動物模型進行HepA-l免疫后， HepA-l免疫組以及HepA-l聯合HS免疫組的心臟、肝臟、脾、肺、腎及大腦病理切片與對照組相比，均未見明顯病理學改變，研究結果與用靈長類動物模型進行安全性評價得出的結果一致。

研究表明, HS作為佐劑具有良好的安全性, 并且結果提示以樹鼩作為動物模型進行疫苗及佐劑的安全性評價是可行的。綜上所述, 本實驗初步證實了以樹鼩作為動物模型進行疫苗評價的可行性, 為以后疫苗及藥物實驗評價平臺的建設提供了基礎數據。

[1] 許凌, 范宇, 蔣學龍, 等. 樹鼩進化分類地位的分子證據 [J].動物學研究, 2013, 34(2):70-76．

[2] Fan Y, Yu D, Yao YG. Tree shrew database (Tree shrew DB):agenomic knowledge base for the Chinese tree shrew[J]. Sci Rep, 2014, 4: 7145.

[3] Yang C, Ruan P, Ou C, et al. Chronic hepatitis B virus infection and occurrence of hepatocellular carcinoma in tree shrews(Tupaia belangeri chinensis) [J]. Virol J, 2015, 12:26.

[4] 黃曉燕, 徐娟, 孫曉梅, 等. 樹鼩在人類疾病動物模型中應用研究進展[J].實驗動物科學, 2013, 30(2):59-64.

[5] Tsubura A, Lai YC, Miki H, et al. Animal models of N-Methyl-N-nitrosourea-induced mammary cancer and retinal degeneration with special emphasis on therapeutic trials[J]. In Vivo,2011, 25(1):11-22．

[6] Xie ZC, Riezu-Boj JI, Lasarte JJ, et al. Transmission of hepatitis C virus infection to tree shrew[J]. Virology, 1998,244(2):513-520.

[7] 嚴瑞琪, 蘇建家, 陳志英, 等. 人乙型肝炎病毒實驗感染成年樹鼩的初步研究[J]. 廣西醫學院學報, 1984, 1(1):10-15.

圖1 樹鼩主要器官組織病理學觀察

[8] Wang BJ, Tian YJ, Meng ZJ, et al. Establishing a new animal model for hepadnaviral infection: susceptibility of Chinese Marmota species to woodchuck hepatitis virus infection[J].Gen Virol, 2011, 92(3):681-691.

[9] He W, Ren B, Mao F, et al. Hepatitis D virus infection of mice expressing human sodium taurocholate co-transporting polypeptide[J]. PLoS Pathog, 2015, 11(4):e1004840.

[10] Reddy JK，Svoboda DJ, Rao MS. Induction of liver tumors by aflatoxin B1 in the tree shrew (Tupaia glis), a nonhuman primate[J]. Cancer Res, 1976, 36(1):151-160.

[11] 中華人民共和國衛生部藥政局. 新藥臨床前研究指導原則匯編(藥學、藥理學、毒理學)[S]. 1994:205-209.

[12] 國家藥典委員會.臨床用藥須知[M]. 北京:人民衛生出版社, 2005:82-83.

[13] 陳新謙, 金有豫, 湯光.新編藥物學[ M]. 16 版. 北京: 人民衛生出版社, 2007:836 -837.

[14] 蘭蕓, 王海漩, 烏美妮, 等. 內源性危險信號低分子量硫酸乙酰肝素的免疫佐劑作用[J]. 中國生物制品學雜志, 2011,24(1):5-9.

[15] 匡德宣, 孫曉梅, 陸彩霞, 等. 實驗樹鼩主要內分泌器官的組織學觀察[J]. 中國比較醫學雜志, 2014, 24(6):35-39.

[16] Li SA, LEE WH, Zhang Y. Two bacterial infection models in tree shrew for evaluating the efficacy of antimicrobial agents[J]. Zool Res, 2012, 33(1):1-6.

[17] Tian ZF, Shen H, Fu XH, et al. Interaction of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 with the large extracellular loop of tupaia CD81 [J]. World J Gastroenterol, 2009, 15(2):240-244.

[18] Xia HJ, Wang CY, Zhang HL, et al. Characterization of spontaneous breast tumor in tree shrews[J]. Zool Res, 2012,33(1):55-59.

[19] 施建東, 胡凝珠, 趙蕊蕊, 等. 氫氧化鋅與低分子量透明質酸復合佐劑對甲肝乙肝聯合抗原的體液免疫增強作用[J].中國生物制品學雜志, 2012, 25(1):34-36.

[20] Powell JD, Horton MR. Threat matrix: low-molecular-weight hyaluronan (HA) as a danger signal [J]. Immunol Res, 2005,31(3):207-218.

[21] 王東寶, 胡云章, 胡凝珠, 等. 樹鼩經甲型肝炎減毒活疫苗、乙型肝炎疫苗及聯合硫酸乙酰肝素佐劑免疫后的免疫效果評價 [J]. 實驗動物與比較醫學, 2017, 37(2):113-117.

[22] 楊凈思, 陳洪波, 楊曉蕾, 等. H2株甲肝減毒活疫苗安全性及免疫效果觀察[J].中國公共衛生, 2005, 21(10):1186-1187.

[23] 辛忠, 李淑焱, 廉小黎, 等. 甲型肝炎減毒活疫苗(L-A-1)猴體安全性及免疫原性研究[J]. 預防醫學論壇, 2004, 10(5):549-550.

Safety Evaluation on Adjuvant Heparan Sulfate in Tree Shrew

LI Yan-han, LI Jian-fang, SUN Jing, WU Mei-ni, WANG Hai-xuan, HU Yun-zhang
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical College and Peking Union Medical College,Yunnan Key Laboratory of Prevention & Control on Insect Infectious Disease, Yunnan Research Center of Engineering Technique for Vaccines against Severe Infectious Diseases, Kunming 650118, China)

ObjectiveTo explore the feasibility of tree shrew as an animal model for safety evaluation,through the detection of adjuvant heparan sulfate (HS) of the tree shrew skin irritation and adjuvant with Hepatitis A virus attenuated live vaccine (HepA-l) combined with immune pathological analysis of main organs on tree shrews.MethodsAccording to the dose frequency and skin integrity, the tree shrews were randomly divided into two groups, the skin irritation test performed by tree shrew own left and right contrast. According to the vaccine and adjuvant type the tree shrews randomly divided, subcutaneous immunization. Twenty weeks after immunization, major organs are harvested to make pathological slice and perform HE staining analysis.ResultsThe skin irritation test of adjuvant HS on tree shrews were no erythema, edema and other irritating changes of single and multiple dosing group on integrity skin or damaged skin. There is no significant pathological change between HepA-l and HepA-l combined with HS group on heart, liver, spleen, lung and kidney and the brain biopsy.ConclusionThe experiment proved that the tree shrew as an animal model for vaccine safety evaluation is feasible, provide the basical data for future vaccine and drug evaluation platform.

Tree shrew; Heparan sulfate(HS); Hepatitis A virus attenuated live vaccine(HepA-l);Skin irritation test; Pathological analysis; Safety evaluation

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0390-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.009

2017-03-09

國家科技支撐計劃項目(2014BAI01B01); 國家重點研發計劃項目(2016YFC1202305)

李彥涵(1982-), 女, 碩士, 助理研究員, 研究方向: 疫苗研發。E-mail: 110393273@qq.com

胡云章(1962-), 男, 教授, 博士生導師, 主要從事病毒疫苗方面的研究。E-mail: huyunzhangym@126.com